色譜柱的選擇及應用

宋學英 楊 華

(首都醫科大學醫學實驗測試中心現代藥學測試室 北京 100069)

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色譜柱的選擇及應用

宋學英 楊 華

(首都醫科大學醫學實驗測試中心現代藥學測試室 北京 100069)

目的:分析時正確選擇色譜柱,使其能夠達到較好的分離效果。方法：通過綜述色譜柱的分類、基質及不同鍵合相的最新發展狀況，結合自身的科研工作實例說明不同的色譜柱對樣品分離效果的重要影響以及色譜柱在使用過程中的維護方法。結果：正確選擇色譜柱能夠達到較好的分離效果。結論：不同基質的色譜柱對樣品的分離效果不同,實驗中需要根據樣品性質選擇合適的色譜柱；做好色譜柱的日常維護,才可以提高色譜柱的使用壽命。

色譜柱 選擇 維護

在色譜分析中，如何選擇最佳的色譜條件以實現最理想的分離，是色譜工作者的重要工作。色譜是一種分離分析的手段，分離是核心，因此可以說擔負分離作用的色譜柱是色譜系統的心臟[1]。對色譜柱的要求是：柱效高、選擇性好，分析速度快等[2]。目前市售的用于HPLC的各種色譜柱種類繁多，從色譜柱填料來分，可分為硅膠基質和有機雜化球基質的色譜柱，還有不同長短、不同微粒大小的色譜柱，因此選擇一個合適的色譜柱非常重要。

1 實驗材料與儀器

液相色譜儀：1525-2487:1525泵、2487雙波長紫外檢測器，美國沃特世 ；CoulArray5600，包括：EAS482泵、ESA542自動進樣器、CoulArray 5600 8通道庫侖陣列檢測器，美國戴安 ；色譜柱：ESA MD150×3.2 3μm美國戴安 ；Symmetry 150×3.9 5μm ；SymmetryShield 150×4.6 5μm； Nova Pak 150×4.6 4μm 均為美國沃特世；zorbax SB-c18 150×4.6 5μm 美國安捷倫；色譜甲醇(Fisher美國)；其余均為分析純試劑。

2 色譜柱的選擇

色譜柱的選擇可根據待分析樣品的極性、分子量大小、是否可溶于水等因素來考慮。如樣品分子量大于2000的，可溶于水的，可選擇凝膠色譜柱、大孔徑反相色譜柱、大孔徑離子交換色譜柱。分子量小于2000的，溶于有機相的，可選擇正相模式色譜柱。溶于水，可電離的樣品可選擇反相模式(用離子對試劑的鍵合固定相、用離子化控制鍵合固定相)色譜柱或離子交換或未經涂漬親水模式的色譜柱等。

2.1 色譜柱的分類

色譜柱可分正相模式色譜柱、反相模式色譜柱和親水模式柱[3]

正相模式色譜柱：采用極性固定相(如乙二醇、氨基與腈基等鍵合相)；常用于分離中等極性和極性較強的化合物(如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等)。

反相模式色譜柱：一般用非極性固定相，以硅膠為基質鍵合不同的基團(如C18、C8)；適用于分離非極性和極性較弱的化合物。反相色譜(RPC)在現代液相色譜中應用最多，據統計它占整個HPLC應用的80%左右[4]。由于超臨界色譜的崛起，一些過去用正相色譜的實驗逐漸被超臨界色譜所代替,所以反相色譜柱的應用將會更加廣泛。

隨著色譜柱填料的快速發展，某些無機樣品或易解離樣品的分析也可用反相色譜法。為控制樣品在分析過程的解離，常用緩沖鹽控制流動相的pH值。硅膠基質鍵合相(C8和C18)色譜柱使用的pH值通常為2.5～7.5(2～8)，太高的pH值會使硅膠溶解，太低的pH值會使鍵合的烷基脫落[2]。近年來技術的更新，利用包被、空間位阻、雜化顆粒等新技術，已經可以使硅膠基質的色譜柱使用范圍擴大到pH為 1～12，流動相為較強酸性或堿性時，可選擇寬pH值的色譜柱。

親水(HILIC)模式：HILIC不同于反相色譜技術，流動相為反相色譜的流動相，它提供了相對于反相的互補選擇性，通常可保留傳統反相色譜方法無法保留的高極性化合物。需要注意的是HILIC模式中硅膠基質無鍵合相的色譜柱，流動相pH適用范圍。

2.2 固定相的基質

2.2.1 無機基質

無機基質有硅膠、羥基磷灰石、石墨化碳、氧化鋁、氧化鈦以及氧化鋯等金屬氧化鈦等[5]。硅膠是HPLC填料中最普遍的基質。除具有高強度外，還提供一個表面，可以通過成熟的硅烷化技術鍵合上各種配基，制成反相、離子交換、疏水作用、親水作用或分子排阻色譜所用填料。

2.2.2 有機聚合物基質

以高交聯度的苯乙烯-二乙烯苯或聚甲基丙烯酸酯為基質的填料是用于普通壓力下的HPLC，它們的壓力限度比無機填料低。苯乙烯-二乙烯苯基質疏水性強。可使用任何流動相，在整個pH范圍內穩定，可以用氫氧化鈉或強堿來清洗色譜柱。甲基丙烯酸酯基質比苯乙烯-二乙烯苯疏水性更強，但它可以通過適當的功能基修飾變成親水性的。雖然不如苯乙烯-二乙烯苯那樣耐酸堿，但也可以承受在pH13下反復沖洗。所有聚合物基質在流動相發生變化時都會出現膨脹或收縮，用于HPLC的填料其膨脹和收縮要有限制。因為小分子在聚合物基質中的傳質比在陶瓷性基質中慢，所以造成了小分子在這種基質中柱效低。對于大分子像蛋白質或合成的高聚物，聚合物基質的效能與硅膠基質相差無幾。因此，聚合物基質更廣泛用于分離大分子物質[5]。

2.2.3 鍵合相的種類

化學鍵合相按鍵合官能團的極性分為極性和非極性鍵合相兩種。

常用的極性鍵合相主要有氰基(-CN)、氨基(-NH2)和二醇基(DIOL)鍵合相[1,2,5]。極性鍵合相常用作正相色譜，混合物在極性鍵合相上的分離主要是基于極性鍵合基團與溶質分子間的氫鍵作用，極性強的組分保留值較大。極性鍵合相有時也可作反相色譜的固定相,如氨基柱。

常用的非極性鍵合相主要有各種烷基(C1～C18)和苯基、苯甲基等，以C18應用最廣[1]。非極性鍵合相的烷基鏈長對樣品容量、溶質的保留值和分離選擇性都有影響，一般來說，樣品容量隨烷基鏈長增加而增大，且長鏈烷基可使溶質的保留值增大，常常可改善分離的選擇性；但短鏈烷基鍵合相具有較高的覆蓋度，分離極性化合物時得到的色譜峰對稱性較好。苯基鍵合相與短鏈烷基鍵合相的性質相似，適用于分離芳香化合物。

分離中等極性和極性較強的化合物可選擇極性鍵合相。氰基鍵合相：對于雙鍵異構體或含雙鍵數不等的環狀化合物的分離，有較好的選擇性。氨基鍵合相：具有較強的氫鍵結合能力，對如甾體、強心甙等有較好的分離能力；并被廣泛用于糖類的分析，但它不能用于分離羰基化合物，如甾酮、還原糖等。二醇基鍵合相適用于分離有機酸、甾體和蛋白質等。

分離非極性和極性較弱的化合物可選擇非極性鍵合相。C18柱穩定性較高，這是由于長的烷基鏈保護了硅膠基質的緣故，C18基團空間體積較大，有效孔徑小，所以C18色譜柱更適合分離小分子化合物。利用特殊的反相色譜技術，例如反相離子抑制技術和反相離子對色譜法等，非極性鍵合相也可用于分離離子型或可離子化的化合物。ODS(octadecyl silane)是應用最為廣泛的非極性鍵合相，它對各種類型的化合物都有很強的適應能力。

對于極性比較大的化學物還可采用HILIC模式的色譜柱，HILIC的保留機制是基于分配、離子交換、氫鍵作用等復雜機制，從而獲得對極性分子物有更強的保留能力[6]，如分離糖類化合物，可選用鍵合酰胺鍵的硅膠基質的色譜柱。

2.3 色譜柱的應用

以最常用的C18色譜柱為例，不同廠家或相同廠家不同系列的色譜柱之間存在一定的差異，如填料均為C18的色譜柱就有含有親水基團和不含親水基團色譜柱，含親水基團的色譜柱可以用100%水相作為流動相，而不含親水基團的色譜柱用純水作為流動相會造成色譜柱疏水塌陷，柱效降低。

2.3.1 不同型號的色譜柱對分離結果的影響

在分離ATP、ADP、AMP時，由于樣品的極性較強，流動相為緩沖鹽及1%甲醇的緩沖鹽溶液，用Waters SymmetryShield RP C18的色譜柱就可以得到較好的分離，如圖1所示。而用Agilent SB-C18的色譜柱不能得到滿意的色譜圖，這是因為Waters SymmetryShield這款色譜柱鍵合了親水基團，可以使用純水作為流動相，而Agilent SB-C18不含親水基團，使用純水作為流動相會降低柱效。所以在分離極性較大的化合物需要使用純水作為流動相時，應使用含親水基團的 C18色譜柱或親水模式的色譜柱。

利用反相離子對色譜法分離極性化合物，含親水基團和不含親水基團的色譜柱其保留能力不相同，通常在沒有應用離子對試劑時，我們認為含親水基團的色譜柱保留極性化合物的能力更強，但在應用了離子對試劑后，含親水基團的色譜柱的保留能力不一定比不含親水基團的色譜柱保留強，如用Symmetry C18測定多巴胺、多巴柯、五羥吲哚乙酸、五羥色胺、及高香草酸時，相同條件下(流動相：檸檬酸50mM、無水乙酸鈉70mM、EDTA-2Na 0.2mM、辛烷磺酸鈉0.2mM，緩沖鹽：甲醇=92∶8，pH=4.1)兩種色譜柱保留時間有所不同，含親水基團的色譜柱保留時間更短，分離效果不如普通的C18柱，五羥色胺與高香草酸未完全分開，如圖2所示。

這可能是離子對試劑可以與C18結合形成帶電的基團，而含親水基團的C18柱與離子對試劑結合不如C18柱強，因此對于用離子對色譜，C18的色譜柱保留更強(圖3)。

2.3.2 不同pH值對色譜柱分離結果的影響

如用ESA MD150×3.2mm, 3μm的色譜柱測DA、DOPAC、5=HIAA、5-HT、HVA時pH=3.5和pH=4.1時提保留時間及保留順序均發生了變化(流動相為70mM的乙酸鈉，50mM的檸檬酸，0.2mM EDTA-Na，0.2mM辛烷磺酸鈉，1.32%三乙胺用乙酸或氫氧化鈉調pH值分別為3.5)，如圖4所示。pH3.5時， 多巴胺與多巴柯沒有完全分開，pH4.1時5個峰得到也較好的分離，出峰順序較pH3.5時發生了改變，多巴胺與多巴柯位置相互交換了，高香草酸與五羥色胺位置也進行了交換。所以說pH值不同，色譜柱的選擇性也不相同，通過改變流動相的pH值，可以達到改善分離度的目的。

2.3.3 不同型號的色譜柱分離結果的差異

同樣用Waters 公司不同型號的色譜柱分離DA、DOPAC、5=HIAA、5-HT、HVA，其分離的效果也不相同，如圖5所示。

由圖5可以看出相同條件下，Nova Pak C18150×3.9 4μm不能將多巴胺與多巴柯很好的分離，而Symmetry C18150×3.9 5μm的色譜柱5種物質得

到了較好的分離，這說明雖然都是C18的色譜柱其填料也會有一定的差異。

2.4 色譜柱清洗與使用中的注意事項

2.4.1 常用硅膠鍵合相色譜柱的清洗與再生

對于常用的硅膠鍵合相的色譜柱被污染后，表現為：色譜峰變形，柱壓升高，保留時間改變等，說明色譜柱需要清洗，色譜柱的清洗與再生方法見表1[7]。

由于離子對試劑污染的色譜柱很難沖洗干凈，如在測定多巴胺、五羥色胺及其代謝產物的實驗中，色譜柱被離子對試劑污染，保留時間延長，用異丙醇沖洗色譜柱，保留時間恢復正常，但再次實驗時，又會表現為保留時間延長，因此離子對試劑污染了色譜柱很難恢復。

表1 色譜柱清洗和再生程序

2.4.2 鍵合相色譜柱的使用注意事項

色譜柱的正確使用和維護十分重要，稍有不慎就會降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。在色譜操作過程中，需要注意下列問題，以維護色譜柱。

(1) 避免壓力、溫度的急劇變化及任何機械震動。溫度的突然變化或色譜柱從高處掉下都會影響柱床；柱壓的突然升高或降低也會對柱床有影響，因此要緩慢升高或降低流速，閥進樣時，閥的轉動不宜過緩(如前所述)[8-10]。

(2)應逐漸改變溶劑的組成，特別是反相色譜，不應直接從有機溶劑直接改變為水相，反之亦然。

(3)一般說來色譜柱不宜反沖，只有生產者指明該柱可以反沖時，才可以反沖以除去留在柱頭的雜質。否則反沖會迅速降低柱效。

(4)避免生物樣品直接注入柱內，需要對樣品進行預處理，還可以在進樣器和色譜柱之間連接保護柱。保護柱是與色譜柱填料相似的短柱。保護柱可以而且應該經常更換。

(5)經常用強溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內的雜質。在清洗色譜柱時，對流路系統中流動相的置換應以相混溶的溶劑逐漸過渡，每種流動相的體積應是柱體積的20倍左右，即常規分析需要50～75mL。

(6)保存色譜柱時應用乙腈或柱說明書上指定的溶劑充滿色譜柱，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發干燥，絕對禁止將緩沖鹽溶液留在柱內靜置過夜。使用含有緩沖鹽的流動相時，可先用高比例的水替換掉色譜柱中的有機相，然后再用含有緩沖鹽的流動相，實驗結束后，用高比例的水替換掉緩沖鹽，沖洗20倍的柱體積，再逐漸升高有機相的比例，直至100%乙腈或高比例乙腈，沖洗20倍柱體積，保存色譜柱。裝在HPLC儀上柱子如不經常使用，應每隔4～5天開機沖洗15分鐘。

總之，對于色譜工作者,正確選擇色譜柱，可以使所分析的樣品得到理想的分離效果，維護好色譜柱可以使色譜柱的使用壽命大大提高，從而提高色譜柱的使用效率。

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Selection and application of chromatographic column.

Song Xueying,Yang Hua

(CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China)

In this paper, the latest development of the types, matrix, the bonded phase and the application of chromatographic column were introduced.

chromatographic column; selection; maintenance

宋學英，女，1964年出生， 副主任技師，首都醫科大學醫學實驗與測試中心現代藥學測試室， 主要從事液相色譜儀的管理、維護及相關測試，E-mail:13521292345@163；com；songxy@ccmu.edu.cn。

10.3936/j.issn.1001-232x.2016.06.019

2016-06-23