結核分枝桿菌快速培養法的創新進展研究

摘要：結核病是全球關注的公共衛生問題和社會問題，也是我國重點控制的主要疾病之一，該疾病是由單一因素所致的感染性疾病，具有發病率高、死亡率高的臨床特點，相關的研究資料表明，目前約有800萬的新發結核病例，且有200～300萬的死亡病例，全球約有1/3的人口受到不同程度的結核分枝桿菌感染，因此，采取有效的方式快速準確的診斷結核感染，及時進行化療，防止其傳播十分的重要。

關鍵詞：結核分枝桿菌；快速培養法；創新；進展；研究

結核病的臨床危害性較大，具有發病率高、死亡率大的特點，且近幾十年來的發病率一直呈現逐步增長的趨勢[1]。細菌學檢查是發現傳染疾病的重要途徑和主要手段，對肺結核患者進行痰檢驗，發現其結核分枝桿菌是確診肺結核疾病的主要方法，傳統的涂片抗酸染色檢查的陽性檢出率較低，且較難分辨死菌和活菌，培養法的檢出準確性較高，但是由于結核菌的生長速度較為緩慢，不利于患者的臨床診斷和治療[2]，因此，對結核分枝桿菌快速培養的方法進行創新和思考已成為臨床熱議的焦點，快速培養測定系統可有效縮短檢測時間，且具有快速、靈敏、準確性高的特點[3]。本文就結核分枝桿菌快速培養法的創新進展，對噬菌體生物擴增法和結核分枝桿菌L型檢測的培養概況進行了綜述，現報道如下。

1 噬菌體生物擴增法

1.1噬菌體的特性 噬菌體包括真菌和古細菌，是原核生物病毒，又被稱為細菌病毒。噬菌體的個體較小，可通過細菌濾器，且具有其他病毒共同的特性，噬菌體主要由蛋白質構成的外殼和包于其中的核酸組成，且不具有獨立的代謝酶系，是一種專性的細胞內寄生菌，主要存活于活著并進行代謝的宿主細胞中，在該類細胞中進行生長和復制[4]。噬菌體感染細菌具有種屬特異性，一個噬菌體只能感染一個細菌種屬，有時也可感染一個種屬的幾株細菌，目前，噬菌體技術在各種細菌感染性疾病的診斷和治療方面取得了十分成功的應用[5]。

1.2噬菌體生物擴增法簡述 噬菌體生物擴增法是指將噬菌體應用于快速檢測結核分枝桿菌的技術，噬菌體D29可以感染生長緩慢的結核分枝桿菌，包括金色、偶然、胞內、草分枝桿菌等幾種非結核分枝桿菌，檢測結果通過快速生長恥垢分枝桿菌進行反映，噬菌體的增殖速度較快，在24h內，噬菌體浸染的細菌被裂解，進而形成無菌區域，如果繼續培養不會繼續增大，因此，可以以較快的速度反映標本中是否存在活的結核分枝桿菌，同時可用于檢測抗結核藥物的敏感性[6]。

1.3噬菌體生物擴增法的檢測原理 噬菌體D29在與結核分枝桿菌混合孵育時，可以對活的結核分枝桿菌造成感染，加入殺毒劑后，結核分枝桿菌體外的噬菌體滅活，且菌體內的噬菌體不會受到影響，噬菌體在菌體內大量的繁殖和裂解，進而釋放子代噬菌體，噬菌體在感染和裂解后，進而與指示細胞發生反應，瓊脂培養基可在指示細胞裂解后形成噬菌斑[7]，且噬菌斑的數目和標本內活的結核分枝桿菌數量呈正比的關系，但是如果標本中不含有結核分枝桿菌，那在經殺毒劑處理后，痰液中的無噬菌可以較好的存活。噬菌體生物擴增法檢測后的18～24h可判讀結果，小于等于10個噬菌斑為陰性，大于等于20個噬菌斑為陽性[8]。

1.4噬菌體生物擴增法的臨床應用分析 胡忠義[9]在《噬菌體生物擴增法快速檢測結核分枝桿菌方法學研究》一文中就建立噬菌體生物擴增法快速檢測結核分枝桿菌試驗方法，探討最佳檢測條件這一目的進行了研究分析，應用分枝桿菌噬菌體感染結核分枝桿菌，比較各種檢測條件對測定結果的影響，并將所建方法用于痰標本檢測，研究結果表明，與BIOTEC Lab公司產品比較，1×109噬菌斑形成單位（PFU）/ml的噬菌體，37℃感染60min可檢出200～500條/ml結核分枝桿菌，殺毒劑100mmol/ml，室溫作用5min可完全滅活受試噬菌體，指示細胞濃度在1×108條/ml時，形成的噬菌斑清晰。4種非結核分枝桿菌（偶然、胞內、金色、草分枝桿菌）在高濃度時（>1×105條/ml）檢測結果為陽性，重復試驗結果表明，本法批間和批內變異系數均<15%。痰標本氫氧化鈉-半胱氨酸液化方式的陽性檢出率為94%（49/52），顯著高于氫氧化鈉液化結果的62%（32/52，χ2=15.06，P<0.01）；預培養1d的陽性檢出率為65%（51/78），顯著高于未預培養結果的40%（31/78，χ2=18.05，P<0.01）。最終得出\"噬菌體生物擴增法快速、簡便、靈敏，有助于結核分枝桿菌的快速檢測\"這一結論。

1.5噬菌體生物擴增法的應用局限性 噬菌體D29可以對生長較為緩慢的結核分枝桿菌造成感染，且可以有效感染恥垢、金色、偶然、胞內等幾種非結核分枝桿菌[10]，但我國的非結核分枝桿菌較為少見。噬菌體生物擴增法的操作影響因素較多，實驗操作過程較為復雜，實驗過程中需設立陽性和陰性對照，以確保結果的可靠性，且噬菌體在痰液成分的保護下可能逃避清除，在60℃的溫度下，作用1min就有可能滅活，因此，需注意澆注器皿的溫度不宜過高[11]。

2 結核分枝桿菌L型檢測

2.1結核分枝桿菌L型檢測概述 國外研究資料表明[12]，在體內外多種因素的影響下，結核分枝桿菌可發生形態的異變，主要表現出細菌細胞壁完全或部分缺失，這部分變異的細菌在醫學上被命名為\"L型菌\"，在藥物誘導及免疫因子作用和自身生活周期中，非結核及結核兩種分枝桿菌容易在細胞壁丟失的影響下，形成分枝桿菌L型，臨床上也將該細菌稱為細胞壁缺陷菌，細胞壁缺陷菌由于細胞壁的缺乏或者不完整，分枝菌酸或者磷脂容易全部缺失，因此，常規的抗酸染發檢測不容易著色或者著色極淡。除此之外，結核分枝桿菌L型菌的菌體滲透壓較高，在等滲的普通培養基上溶解容易被破壞，導致采用普通結核分枝桿菌檢測容易呈現陰性結果。結核分枝桿菌L型檢測具有快速簡便、靈活性高的優點[13]。

2.2結核分枝桿菌L型檢測的臨床應用 結核分枝桿菌的細胞壁脂質含量較高，約占總比的60%左右，且大部分的分枝菌酸包圍在肽聚糖層外面，對染料的穿入造成了較大的影響。常規的抗酸染色可較好的用于分枝桿菌L型的檢測中，但是因為結核分枝桿菌L型對染料的拒染力較強，因此染色結果常為陰性，容易導致漏診及誤診情況的出現，但結核分枝桿菌L型檢測的靈敏度較高，特異性較強，因此可用于痰結核分枝桿菌的常規檢測中[14]。趙丹[15]學者在《結核分枝桿菌L型檢測對結核病診療價值的研究》一文中通過探究評價MTB-L涂片染色方法的改進及其方法學，得出\"MTB-L抗酸染色方法具有良好的靈敏度、特異度，操作簡便易行，適合于痰MTB-L常規檢測，能夠在基層結核病實驗室推廣應用\"這一結論，進一步佐證了本文的觀點，具有較好的臨床借鑒價值。

3 小結

快速培養法具有操作簡單、特異度高、敏感性高的臨床優越性，因此，可在臨床中應用和推廣，噬菌體生物擴增法和結核分枝桿菌L型檢測可在結核分枝桿菌快速培養法中得到良好的應用。

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編輯/周蕓霏