HDAC6在ISO誘導大鼠心肌纖維化中的作用研究

摘要：目的 本實驗探討HDAC 6在ISO誘導的大鼠心肌纖維化動物模型中表達機制。方法 將SD大鼠隨機分為兩組，每組各20只。設正常組和模型組。其中模型組的大鼠予以誘導劑ISO 1次/d[5mg/（kg·d）]皮下注射，另一組給予等劑量的生理鹽水，持續(xù)7d。取其血液和心肌標本，測定其心臟質量指數(shù)；應用酶聯(lián)免疫吸附法檢測I型和III型膠原的含量；采用HE和Masson染色法觀察大鼠心肌纖維化程度；蛋白質免疫印跡法測定HDAC 6和α-SMA蛋白的表達情況；采用qRT-PCR技術檢測HDAC 6的mRNA的表達情況。結果 模型組和正常對照組相比，心臟質量指數(shù)明顯增加（P<0.05）；HE染色和Masson染色顯示模型組膠原纖維增生。I、III型膠原較對照組有相對明顯增加（P<0.05）；Western blot法示模型組蛋白表達顯著大于正常組（P<0.05），而且α-SMA的表達顯著大于正常組（P<0.01）；qRT-PCR檢測模型組中mRNA表達明顯大于正常組（P<0.05）。結論 HDAC6在心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。

關鍵詞：心肌纖維化；HDAC6；α-SMA

Abstract：Objective The experiment was to investigate the expression of HDAC 6 in the rat model of myocardial fibrosis induced by ISO.Methods SD rats were randomly divided into 2 groups，each group of 20 which to set up the normal group and model group.The model group was treated with ISO daily by 5mg/kg for 7 d，the another group was given the same amount of saline.Take its blood and myocardial specimens.And tested its Heart quality index.ELISA was used to detected the content of type I and type III collagen.USed HE staining and Masson staining to observe the degree of myocardial fibrosis.The expression of HDAC6 andα-SMA were tested by Western blot.The mRNA expression ofα-SMA and HDAC6 were examined by qRT-PCR.Results Compared with model group，heart mass index was increased（P<0.05）；HE staining and Masson staining showed collagen fiber hyperplasia in model group；Collagen type I and III in model group have increased relatively（P<0.05）；Western blot showed that protein expression in model group was higher than normal group（P<0.05），α-SMA expression is obviously higher than normal control group（P<0.01）；QRT-PCR detection showed that mRNA expression in model group was higher than normal group（P<0.05）.Conclusion HDAC6 in plays an important role in development and incidence of myocardial fibrosis.

Key words：Myocardial fibrosis；HDAC6；α-SMA

心肌纖維化是由較大程度的冠脈硬化性狹窄導致的反復持續(xù)性心肌缺血加劇所的結果，從而逐步發(fā)展成為心肌慢性缺血性心臟病。本實驗研究的HDAC6作為II型HDAC家族的關鍵成員之一，在腫瘤的產生過程中起著有突出的作用，抑制相關活性的表達可以作為治療惡性腫瘤相當重要的途徑，然而對于其是否影響心肌重構中的重要步驟心肌纖維化罕有見聞。

1 資料與方法

1.1材料

1.1.1動物：SPF級SD♂大鼠，200±20g，[實驗動物使用許可證SCXK（皖）2011-002]。

1.1.2藥品與試劑：異丙腎上腺素由上海禾豐制藥有限公司提供；ELISA試劑盒購自北京北方生物技術研究所；HDAC6一抗美國Abcam公司提供；α-SMA、β-actin購自武漢博士德生物工程有限公司；二抗由中杉金橋生物技術有限公司提供，其余為分析劑。

1.2方法

1.2.1動物分組及模型建立：隨機均分為兩組，設立模型組和正常組，每組各20只。①模型組：皮下注射ISO溶液（5mg/kg-1·d-1），1次/d，持續(xù)不間斷注射7 d；②正常組：皮下注射生理鹽水溶液（5mg/kg-1·d-1），其他過程同模型組。

1.2.2標本采集及處理：正常組和實驗組在標準環(huán)境下喂食1w后處死，處死大鼠，腹主動脈采血抗凝備用；剖開胸腔，減去大鼠心臟，稱全心重和左心室重量；之后迅速放入10%中性甲醛溶液固定后，常規(guī)包埋，切片5張，厚4μm；運用HE、Masson染色方法檢測纖維化程度；殘存心臟標本均放入凍存管，于液氮罐中保存。

1.2.3心臟質量指數(shù)的測定：①末次給藥后只飲水24h，稱重；②腹腔麻醉后，剖胸取血，備用，取心臟；③洗凈、吸干后，稱全心重量，剝離左心室，稱重，計算心重指數(shù)和左心室重指數(shù)。

1.2.4 HE和Masson染色以及心肌CVF計算：將切片經烤熱后于二甲苯和梯度乙醇溶液中脫蠟至水。更換溶液，再重復上述步驟；蘇木精染5min，流水沖洗；1%鹽酸乙醇快速分化，流水稍洗，促藍液返藍數(shù)秒，流水沖洗；然后依次行HE染色和Masson染色。固定切片，光學顯微鏡下觀察、攝片。在每張Masson染色切片中，挑取出3個非血管視野（×400），使用圖像掃描軟件Image Proplus6.0進行掃描分析；計算CVF（%）：膠原面積/總視野面積×100%。

1.2.5 I型及III型膠原含量的檢測：血標本取出后，提取血清；依照ELISA試劑盒操作指南進行：包被、加樣、加酶標抗體、加底物液顯色、終止反應、結果判定。分析并酶標儀測定I型III型膠原的含量，繪制標準曲線，計算膠原蛋白含量

1.2.6 HDAC6和α-SMA蛋白表達測定：①心肌總蛋白的提取：取出0.1g心肌組織塊，均漿機充分打散并研磨成均勻糊狀，置入離心管中；給予RIPA容液1毫升，放置冰上裂解30min、4℃離心機12000轉/min，40min；管中提其上清液，測蛋白濃度，變性后于-80℃冰柜中保存留用；②蛋白質電泳：采用常規(guī)凝膠電泳系統(tǒng)；③免疫印跡雜交：200mA恒流電轉印1h。PVDF膜放入含5%脫脂奶粉的TBST封閉1h，一抗工作液，4℃搖床過夜。洗膜，二抗工作液，37℃孵育1h，洗膜；④顯影：將A和B發(fā)光液按等體積混合；滴于PVDF膜上，壓片，曝光，定影；⑤采用Lab Works 4.5圖像獲取和分析系統(tǒng)軟件測定蛋白條帶的積分光密度，以β-肌動蛋白作為參考的成像重復3次。

1.2.7 HDAC6、α-SMA mRNA表達：①RNA提取：用核酸提取劑測定心肌細胞中總核糖核酸，測定其核酸，以吸光值為計量，鑒定RNA的含量；②反轉錄：以總RNA為模板，嚴格按照試劑盒說明，合成cDNA；③PCR擴增：以β-肌動蛋白作為內參照。依次由變性-退火-延伸三個基本反應步驟進行實時定量PCR擴增，引物序列如下（見表1）；④電泳及結果測定：制作瓊膠糖凝膠；取適量的PCR產物，加上樣緩沖液充分混合，10V/cm電泳45～60min，成像系統(tǒng)成像分析，引物序列如下。

1.3統(tǒng)計學處理 以SPSS 16.0完善數(shù)據(jù)處理，采用（x±s）表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 LVW/BW和HW/BW參數(shù)測定 實驗組與正常組相比，LVW/BW和HW/BW參數(shù)有所提升，差異有顯著性（P<0.05）。見表2。

2.2血清中I型、III型膠原的含量影響 模型組I型膠原和III型膠原的含量明顯高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），表明通過皮下注射異丙腎上腺素能夠引起大鼠血清中I型膠原和III型膠原的含量的增加。

2.3 HE染色和Masson染色以及心肌CVF計算 檢測結果顯示：模型組：間質成分增多且排列不整齊，核間距離明顯增大，含纖維組織沉積；正常組：細胞形態(tài)大小基本大致相同且整齊，核間距大致相等，無纖維化表現(xiàn)，見圖1；心肌CVF計算，模型組CVF明顯高于正常組，見圖2。

圖1 模型組與正常組大鼠心肌HE染色及Masson染色×200

A：正常組；B：模型組；1：HE染色；2：Masson染色

圖2 模型組與正常組大鼠心肌CVF的比較

注：與正常組相比：*P<0.05

2.4 Western blotting法 與正常組相比，模型組大鼠心肌組織，HDAC 6含量和α-SMA含量相對升高，以此表明模型組中的HDAC6及α-SMA蛋白高表達（見圖3）。

圖3 HDAC 6和α-SMA蛋白表達變化

注：與正常組相比：*P<0.05，**P<0.01

2.5 qRT-PCR 選用相對定量法對大鼠心肌細胞內的HDAC6基因相對于β-肌動蛋白基因的表達變化進行測定。模型組HDAC6和α-SMA mRNA含量較正常組有著較大的增加，模型組中的HDAC6和α-SMA轉錄水平要高于對照組（見圖4）。

圖4 HDAC 6和α-SMA mRNA表達變化

注：與正常組相比：*P<0.05，**P<0.01

3 討論

心肌組織由心肌細胞和非心肌細胞組成。心肌細胞最主要組成部分是成纖維細胞。當心肌肥厚發(fā)生時，心肌細胞失去分裂的能力，僅表現(xiàn)為增生性生長，心肌成纖維細胞仍具備有絲分裂的能力，呈增生性生長。其在刺激因子作用下表達合成膠原蛋白的能力增加。心臟成纖維細胞能分泌多種活性物質，調節(jié)自己生產膠原蛋白和周圍的心肌細胞的形態(tài)結構和生理功能。

心肌纖維化是細胞外的基質不規(guī)則代謝而引起過多的膠原纖維沉積用來代替心臟的損傷，是各種心血管疾病進展到終末期的相同病理表現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)，α-SMA蛋白是心臟成纖維細胞活化中最重要的蛋白[1]。因此，我們決定將其作為一個重要的指標來評估心肌纖維化的嚴重程度。該實驗動物模型的制備是通過ISO完成心肌纖維化。實驗結果表明測定的纖維化組I型、III型膠原的含量有所增加。同時，纖維蛋白染色法提示：模型組心肌組織間質呈現(xiàn)纖維化改變。對比文獻造模數(shù)據(jù)表明，該實驗造模是成功的，該方法簡便易行，可重復。

心肌纖維化是心臟損傷代償?shù)慕Y果，是多種心血管疾病發(fā)展到一定階段的共同病理過程[2]。心肌間質的主要組成細胞為成纖維細胞，通常多處于未激活狀態(tài)。但其在決定纖維化細胞促進因子作用下被激活并大量增生，活化的成纖維細胞表達a-SMA并分化為肌成纖維細胞。故心肌成纖維細胞的基因調控是引起心肌纖維化發(fā)生發(fā)展的最重要的步驟。心肌成纖維細胞類似成纖維細胞和平滑肌細胞，可以作用表達為α-SMA和收縮蛋白。不同于肌成纖維細胞的是，心肌成纖維細胞的誘導細胞增殖以及細胞外膠原的沉積的作用不是很明顯[3]。在心肌組織中，成纖維細胞的病理學改變致使心肌順應性降低，心室舒張功能不全甚至誘發(fā)心衰[4]。而致纖維生長因子調控著膠原的轉錄與合成[5]。α-SMA是心肌成纖維細胞的活化的重要標志物之一[6]。心肌成纖維細胞具有活躍的增殖和分泌膠原的能力，是細胞外基質沉積增多的主要來源，最終導致心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展。因此，α-SMA是判斷心肌纖維化嚴重程度的代表性的指標。

目前已有很多相關研究證實HDAC6與多種腫瘤方面有著較高表達，通過與α-SMA、泛素化等多種方式參與腫瘤的調控。HDAC6異常結合到特定的啟動子區(qū)從而抑制正常功能基因的轉錄可能是惡性腫瘤發(fā)生的機制之一。目前為止，癌癥的治療已有著突破性的進展，其中HDAC6抑制劑的應用起到相當重要的作用。多種HDAC6抑制劑治療腫瘤已進入臨床試驗階段。然而HDAC6在這種研究腫瘤的道路中如火如荼，卻在心肌纖維化中少有報道。在本文中通過構造大鼠心肌纖維化模型，從而探究出HDAC6在心肌纖維化中是有某種相關性，進而研究HDAC 6在心肌纖維化中的作用。Western blotting法和qRT-PCR技術均提示：與正常組相比，造模組中的HDAC 6和α-SMA轉錄及翻譯水平都有明顯的上升。那心肌纖維化中HDAC6和α-SMA是如何調控的呢，α-SMA是否會直接影響心肌纖維化我們不從而知，這也是本實驗的不足之處。本實驗結果僅提示兩者之間是一種關聯(lián)現(xiàn)象，為之后心肌纖維化的深入研究提供基礎。

參考文獻：

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編輯/金昊天