異硫氰酸芐酯對人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞增殖與凋亡的影響

摘要：目的 探討異硫氰酸芐酯對人舌鱗癌Tca8113的作用及可能作用機(jī)制。方法 將體外培養(yǎng)的人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞分成對照組和不同濃度異硫氰酸芐酯處理組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。采用MTT法檢測不同濃度下異硫氰酸芐酯對Tca8113細(xì)胞生存率的影響；采用PI染色和Annexin V-FITC/PI雙染以及流式細(xì)胞技術(shù)檢測異硫氰酸芐酯作用下Tca8113細(xì)胞周期的改變和凋亡的程度；采用Western blot方法檢測細(xì)胞cyclin B1和p53蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果 異硫氰酸芐酯體外能有效抑制Tca8113細(xì)胞的增殖，這種抑制作用表現(xiàn)出劑量依賴性；異硫氰酸芐酯能使Tca8113細(xì)胞周期停滯在G2/M期，并能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，在作用過程中，細(xì)胞cyclin B1蛋白表達(dá)降低，而p53蛋白的表達(dá)增強(qiáng)。結(jié)論 異硫氰酸芐酯能夠明顯抑制人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞的增殖并能誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，該作用機(jī)制可能與p53蛋白的表達(dá)增強(qiáng)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：異硫氰酸芐酯；舌鱗癌；Tca8113細(xì)胞；p53

Effects of Phenethyl Isothiocyanate on Proliferation and Apoptosis in Human Tongue Squamous Carcinoma Tca8113 Cells

GUI Yu， SUN Ying， MENG Ling-qiao

（Stomatological Hospital Affiliated to Tianjin Medical University， Tianjin 300070， China）

Abstract：Objective To detect the effects of phenethyl isothiocyanate （PEITC） on human tongue squamous carcinoma Tca8113 cells and to investigate the possible effects. Methods Tca8113 cells were divided into different groups treated by different doses of PEITC， MTT method was used to detect the cell viability， PI staining was used to detect the cell cycle， Annexin V-FITC/PI staining was used to detect the apoptosis， and Western Blot Analysis was used to detect the expression of cyclin B1 and p53 of cells in each group. Results PEITC could inhibit the proliferation of Tca8113 cells effectively in a dose-dependent manner， cells treated with PEITC would appear a G2/M arrest during cell cycle， and the apoptotic rates of cells were significantly high in PEITC treated groups. Western Blot analysis showed a decrease in the expression of cyclin B1 and an increase in the expression of p53 of Tca8113 cells treated with PEITC. Conclusion PEITC could obviously inhibit cell growth of Tca8113 cells as well as induce cell cycle arrest and cell apoptosis， the up-regulation of p53 might be related to the mechanism.

Key words：Phenethyl isothiocyanate； Tongue squamous carcinoma； Tca8113； p53

口腔鱗癌占頭頸部腫瘤的95%，近十年內(nèi)其發(fā)病率增長了50%，而口腔鱗癌患者的5年生存率仍低于50%[1-3]。在口腔鱗癌的早期（I和II期）主要的治療手段是手術(shù)和/或者放療，一般能實(shí)現(xiàn)根治，然而多數(shù)被診斷為口腔鱗癌的患者都已經(jīng)發(fā)展到了中晚期（III期和IV期），對于中晚期的患者則主要是采用手術(shù)結(jié)合放療或者化療的方法，口腔鱗癌晚期患者的五年生存率低于12%[1]。口腔是人們進(jìn)食與交流的重要器官，口腔癌癥的發(fā)生發(fā)展及對其治療的整個(gè)過程中，會(huì)對患者的生理和精神產(chǎn)生沉重的負(fù)擔(dān)[2]，因此，除了加強(qiáng)早期診斷，尋求有效且副作用小的藥物來進(jìn)行防治，同時(shí)改善患者的生活質(zhì)量和提高患者的生存率具有積極重要的意義。

世界衛(wèi)生組織（WHO）在2004年的腫瘤預(yù)防指南中提出，十字花科蔬菜中富含的葡糖異硫氰酸鹽在植物本身或者動(dòng)物腸道內(nèi)存在的芥子酶的催化作用發(fā)生水解生成多種異硫氰酸酯，而異硫氰酸酯與多種腫瘤的預(yù)防與治療有關(guān)[4]。其中異硫氰酸芐酯是在腫瘤預(yù)防與治療中研究的最多的異硫氰酸酯化合物分子之一。本研究采用異硫氰酸芐酯作用于體外培養(yǎng)的人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞，觀察并探討該化合物對Tca8113細(xì)胞的抑制效果與可能機(jī)制，為異硫氰酸芐酯作為人類口腔鱗癌的防治藥物提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 ①細(xì)胞株：人舌鱗癌細(xì)胞株Tca8113購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫（上海）；②試劑：異硫氰酸芐酯和MTT試劑購自美國Sigma公司，RPMI-1640培養(yǎng)液購自美國Gibco公司，小牛血清購自美國Invitrogen公司，PI周期染液和Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司，RIPA裂解液和PMSF購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，一抗抗體購自美國CST公司，二抗抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) Tca8113細(xì)胞置于含有10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 MTT法檢測細(xì)胞存活率 將Tca8113單細(xì)胞懸液按照5×103細(xì)胞/孔接種到96孔板，每孔細(xì)胞液終體積為100 ul，細(xì)胞分為對照組和8個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組3個(gè)平行復(fù)孔。100 ul等體積無血清RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋異硫氰酸芐酯使對照組和實(shí)驗(yàn)組的終濃度分別為：0、0.5、1、5、10、15、20、30、40 uM，于細(xì)胞貼壁后加入。細(xì)胞加入異硫氰酸芐酯48 h后，棄上清，每孔加入無血清RPMI-1640培養(yǎng)液180 ul，再加入MTT工作液（5 mg/ml）20 ul，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)避光孵育3～4 h。孵育結(jié)束后，棄上清，每孔加入150 ul DMSO，搖床震蕩10 min，酶標(biāo)儀570 nm波長下檢測吸光值。細(xì)胞存活率（%）=實(shí)驗(yàn)組吸光度/對照組吸光度均值×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 PI檢測細(xì)胞周期 Tca8113細(xì)胞分三個(gè)組，每組3個(gè)復(fù)孔，等量接種到六孔板，每孔細(xì)胞液終濃度為2 ml。同上方法稀釋異硫氰酸芐酯使三個(gè)組的終濃度分別為：0、15和30 uM，于細(xì)胞貼壁后加入。藥物孵育24 h后制備成單細(xì)胞懸液，75%冰乙醇固定18 h，離心，棄上清，冰PBS漂洗、計(jì)數(shù)，加入PI染液（含RNA酶），使細(xì)胞懸液終濃度為1×106/ml，常溫孵育30 min，流式細(xì)胞儀（Beckman Coulter，美國）檢測周期變化。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.4 Annexin V-FITC/PI 檢測細(xì)胞凋亡 同上方法異硫氰酸芐酯孵育24 h后的三組Tca8113細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，PBS漂洗、計(jì)數(shù)，500 ul凋亡試劑盒中的1×buffer重懸，使細(xì)胞懸液終濃度為1×106/ml，每支樣品分別加入5 ul Annexin V-FITC染液和5ul PI染液，輕輕混勻，室溫避光反應(yīng)20～30 min，冰上終止反應(yīng)，1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀（Beckman Coulter，美國）上機(jī)檢測。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 Western blot檢測cyclin B1，p53蛋白變化 RIPA裂解液常規(guī)收集同上方法異硫氰酸芐酯孵育24 h后的三組Tca8113細(xì)胞蛋白，10% SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，室溫下5%脫脂牛奶封閉1 h。洗膜后分別加入5%脫脂牛奶稀釋的β-actin、cyclin B1和p53的一抗于4℃輕搖過夜；洗膜后加入5%脫脂牛奶稀釋的二抗中常溫輕搖孵育1 h，洗膜，暗室中與ECL化學(xué)增強(qiáng)發(fā)光劑反應(yīng)1 min，X線片（柯達(dá)）曝光。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)值結(jié)果以應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用t檢驗(yàn)及方差分析比較組間差異，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 異硫氰酸芐酯對Tca8113細(xì)胞增殖的影響 不同濃度異硫氰酸芐酯處理Tca8113細(xì)胞48 h后的細(xì)胞存活率，見圖1。異硫氰酸芐酯對Tca8113細(xì)胞的抑制作用具有劑量依賴性。

圖1 不同濃度異硫氰酸芐酯處理Tca8113細(xì)胞

48 h后細(xì)胞的存活率

2.2異硫氰酸芐酯使Tca8113細(xì)胞周期停滯 15 uM和30 uM的異硫氰酸芐酯對Tca8113細(xì)胞處理24 h后，細(xì)胞不同程度的停滯在G2/M期，G2/M期細(xì)胞的百分比分別從對照組的（5.33±1.53）%增加到了（17.33±2.31）%和（39.67±2.52）%，見表1。

2.3異硫氰酸芐酯誘導(dǎo)Tca8113細(xì)胞發(fā)生凋亡 分別以15 uM和30 uM異硫氰酸芐酯孵育Tca8113細(xì)胞24 h，以Annexin V-FITC/PI雙染凋亡試劑盒結(jié)合流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測發(fā)現(xiàn)異硫氰酸芐酯誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡的發(fā)生，并且隨著濃度的增加，凋亡程度也增加，見表2。

2.4異硫氰酸芐酯對Tca8113細(xì)胞cyclin B1和p53蛋白表達(dá)的影響 Western Blot檢測結(jié)果顯示，見圖2，不同濃度的異硫氰酸芐酯處理Tca8113細(xì)胞24 h以后，隨著異硫氰酸芐酯濃度的增加，細(xì)胞cyclin B1蛋白的表達(dá)量降低，而p53蛋白的表達(dá)量增加。Cyclin B1蛋白表達(dá)的降低與細(xì)胞在G2/M期的停滯有關(guān)，與周期檢測結(jié)果一致。用β-actin蛋白表達(dá)量來調(diào)整細(xì)胞蛋白濃度。

異硫氰酸芐酯=15uM-+-

異硫氰酸芐酯=30uM--+

圖2 不同異硫氰酸芐酯濃度下Tca8113細(xì)胞

cyclin B1和p53蛋白的表達(dá)

3 討論

口腔癌在世界上是位于第六位的常見惡性腫瘤，一般發(fā)生在口腔、咽喉和涎腺等部位，研究者們證實(shí)口腔癌中超過90%以上為口腔鱗癌[1，5，6]。口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展與多種因素有關(guān)，包括多基因突變以及吸煙、飲酒、慢性炎癥和病毒感染等環(huán)境因素的影響[1，3，5]。在早期，口腔鱗癌可通過手術(shù)和/或者放療實(shí)現(xiàn)根除，然而口腔鱗癌患者常常是在晚期才被診斷出來，而80%以上的晚期患者已經(jīng)發(fā)生了轉(zhuǎn)移[1-3]。

抑癌基因p53的突變與失活被證實(shí)與多數(shù)人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移以及患者的預(yù)后有關(guān)，F(xiàn)rancis et al等人早期的研究結(jié)果在60%左右的口腔癌病例中檢測到了p53功能的改變[6]；Heah et al等人提議將p53作為檢測口腔鱗癌轉(zhuǎn)移的標(biāo)記物[7]，高繼賓等人通過外源導(dǎo)入野生型p53發(fā)現(xiàn)人舌癌細(xì)胞Tca8113生長和侵襲能力顯著下降，同時(shí)細(xì)胞凋亡顯著增加[8]；何春梅等人認(rèn)為p53的表達(dá)下調(diào)可能與人舌鱗癌細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性有關(guān)[9]。在本實(shí)驗(yàn)研究中，我們發(fā)現(xiàn)異硫氰酸芐酯可以體外促使人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞周期停滯在G2/M期，同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，在藥物處理之后，檢測到了cyclin B1蛋白表達(dá)的減弱和p53蛋白表達(dá)的增強(qiáng)。p53蛋白參與多種生物信號途徑的調(diào)節(jié)，包括抑制cyclin B蛋白的表達(dá)從而引起細(xì)胞周期發(fā)生G2期的停滯，以及激活一系列caspase家族的蛋白活性從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。由此我們認(rèn)為異硫氰酸芐酯對Tca8113細(xì)胞的抑制作用很可能與上調(diào)功能性p53蛋白的表達(dá)有關(guān)。

目前在以口腔癌為主的頭頸部腫瘤治療領(lǐng)域已經(jīng)出現(xiàn)多種基于調(diào)節(jié)p53功能的新型療法[8-10]，現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，這類療法無論是單獨(dú)還是與其它傳統(tǒng)療法聯(lián)合使用，都具有很大的潛力[10]。十字花科蔬菜以及經(jīng)其代謝產(chǎn)生的異硫氰酸酯類化合物被證實(shí)具有積極的腫瘤防治效果，同時(shí)在有效防治腫瘤的劑量范圍內(nèi)對人體并不產(chǎn)生明顯的毒副作用[4]。本實(shí)驗(yàn)研究為進(jìn)一步探討異硫氰酸芐酯作用于人口腔鱗癌的作用機(jī)制、實(shí)現(xiàn)異硫氰酸芐酯防治人口腔鱗癌的臨床推廣提供了重要的理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Markopoulos AK. Current aspects on oral squamous cell carcinoma [J]. The Open Dentistry Journal， 2012， 6： 126-130.

[2]Moore KA， Ford PJ， Farah CS. Support needs and qualify of life in oral cancer： a systematic review [J]. Int. J. Dent. Hygiene， 2014， 12： 36-47.

[3]Rivera C， and Venegas B. Histological and molecular aspects of oral squamous cell carcinoma （Review） [J]. Oncology Letters， 2014， 8： 7-11.

[4]WHO. IARC Handbook of cancer prevention_9 [M]. 2004， IARC， Lyon.

[5]Choi S， Myers JN. Molecular pathogenesis of oral squamous cell carcinoma： implications for therapy [J]. J. Dent. Res.， 2008， 87： 14-32.

[6]Francis G， Kumar UD， Nalinakumari KR， et al. Accumulation of inactive p53 protein in oral squamous cell carcinoma： stabilization by protein interaction [J]. Eur. J. Oral Sci.， 2013， 121： 21- 28.

[7]Heah KG， Hassan MIA， Huat SC.p53 expression as a marker of microinvasion in oral squamous cell carcinoma[J].Asian Pacific J.Cancer Prev，2011，12：1017-1022.

[8]高繼賓，李興平，蔣繼黨.絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶通路介導(dǎo)的p53基因抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌增殖和侵襲的實(shí)驗(yàn)研究[J].華西口腔醫(yī)學(xué)雜志，2013，31（2）：145-149.

[9]何春梅，劉斌，王柯敏，等.p53及p21wafl蛋白表達(dá)與人舌癌細(xì)胞多藥耐藥性的關(guān)系[J].中國醫(yī)師雜志，2006，8（9）：1189-1192.

[10]Tassone P，Old M，Teknos TN，et al. p53-based therapeutics for head and neck squamous cell carcinoma [J].Oral Oncol.，2013， 49（8）：733-737.

編輯/肖慧