不同濃度嗜酸乳酸桿菌對(duì)急性期實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎腸黏膜屏障的研究

摘要：目的 研究不同濃度嗜酸乳酸桿菌對(duì)急性期潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠腸黏膜屏障的作用。方法 50只小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、不同濃度嗜酸乳酸桿菌組，對(duì)小鼠進(jìn)行急性期潰瘍性結(jié)腸炎動(dòng)物模型建立；觀察小鼠一般情況，體重變化，糞便隱血及結(jié)腸病理表現(xiàn)，免疫組織化學(xué)熒光染色測(cè)定結(jié)腸組織zo-1、occludin緊密連接蛋白的變化。結(jié)果 不同濃度嗜酸乳酸桿菌治療模型小鼠的一般情況及病理組織學(xué)均有明顯改變，與模型組比較，不同濃度嗜酸乳酸桿菌組結(jié)腸組織zo-1、occludin蛋白表達(dá)增加，但1×106CFU/ ml濃度嗜酸乳酸桿菌組蛋白較其他濃度組zo-1、occludin蛋白表達(dá)顯著增加。結(jié)論 可見1×106CFU/ ml濃度嗜酸乳酸桿菌對(duì)急性期潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠腸黏膜屏障有調(diào)節(jié)作用。

關(guān)鍵詞：嗜酸乳酸桿菌；潰瘍性結(jié)腸炎；急性期動(dòng)物模型；腸黏膜屏障

1資料與方法

1.1動(dòng)物與試劑 動(dòng)物：雄性C57BL/6小鼠（體重18～22g；7～12w），購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公；嗜酸乳酸桿菌 LT0637為湖南康哲中南醫(yī)藥研究有限公司提供，培養(yǎng)液離心后用生理鹽水均稀釋成1×105 CFU/ml，1×106 CFU/ml，1×107 CFU/ml濃度；右旋葡聚糖硫酸鈉（DSS）（Sigma公司美國(guó)）；兔抗zo-1抗體（Invitrogen）、 鼠抗occludin抗體（美國(guó)Santa Cruz公司）、HRP 抗鼠IgG 、HRP 抗兔IgG （北京中杉有限公司）；主要試劑的配制2%DSS：10 g DSS （分子量36 000～50 000）溶于500 mL蒸餾水中，配成2 %濃度的液體，放入4 ℃冰箱保存。

1.2造模方法 動(dòng)物造模與急性期造模及不同濃度嗜酸乳酸桿菌干預(yù)：50只雄性C57BL/6小鼠按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分入正常對(duì)照組、模型組、1×105 CFU/ml嗜酸乳酸桿菌組、1×106 CFU/ml嗜酸乳酸桿菌組、1×107 CFU/ml嗜酸乳酸桿菌組，每組10只；模型組自由飲用2% DSS 7d，正常對(duì)照組和不同濃度嗜酸乳酸桿菌組小鼠自由飲用蒸餾水7d；不同濃度嗜酸乳酸桿菌組小鼠自實(shí)驗(yàn)開始至結(jié)束，每組分別予1×105 CFU/ml嗜酸乳酸桿菌灌胃；1×106 CFU/ml嗜酸乳酸桿菌灌胃；1×107 CFU/ml嗜酸乳酸桿菌灌胃；正常組和模型組予PBS灌胃作對(duì)照，時(shí)間均為1w，從第8d處死所有動(dòng)物。

1.3小鼠一般情況及結(jié)腸病理組織染色 每天觀察小鼠的精神狀態(tài)、體重、活動(dòng)情況、毛發(fā)光澤度、食欲、大便性狀等。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)處死小鼠，取部分腸段置于多聚甲醛內(nèi)固定，包埋、切片，HE染色，行組織病理學(xué)觀察。

1.4結(jié)腸組織免疫組織化學(xué)熒光染色 新鮮腸組織以5μm的厚度進(jìn)行連續(xù)冰凍切片，按以下步驟進(jìn)行zo-1和occludin的免疫熒光染色：4%多聚甲醛固定10 min，免疫染色洗滌液洗5 min 3次，封閉液封閉，室溫1 h，加兔抗zo-1多克隆抗體/小鼠抗occludin單克隆抗體，4℃過夜，洗滌液洗5 min 3次，滴加標(biāo)記綠色熒光的抗兔FITC/標(biāo)記紅色熒光的抗小鼠Cy3，室溫1 h綠色熒光/紅色熒光為陽性表達(dá)。陰性對(duì)照組用PBS替代一抗，其余步驟同上。

2結(jié)果

2.1動(dòng)物的一般狀況 實(shí)驗(yàn)期間，正常對(duì)照組小鼠大小便正常、體重持續(xù)增加、毛發(fā)有光澤，飲食、活動(dòng)、精神狀態(tài)均正常。急性期模型組動(dòng)物飲用2%DSS水后第1d，體重增長(zhǎng)，飲水和進(jìn)食較多；飲用DSS第3d，模型組小鼠體重出現(xiàn)下降，飲水和進(jìn)食明顯減少，大便松散，量增多；飲用DSS第5d，小鼠體重下降明顯，精神萎靡，體毛凌亂，并出現(xiàn)稀便；實(shí)驗(yàn)第8d模型組小鼠體重明顯減輕，肛周可見肉眼血便。嗜酸乳酸桿菌組于實(shí)驗(yàn)第1d分別予1×105 CFU/ml、1×106 CFU/ml、1×107 CFU/ml灌胃治療，第2d嗜酸乳酸桿菌組動(dòng)物體重逐漸回升，精神好轉(zhuǎn)，并出現(xiàn)稀便；第5d，嗜酸乳酸桿菌組動(dòng)物體重明顯增加，大便稀，量多；第7d，嗜酸乳酸桿菌組動(dòng)物體重回升明顯，精神狀態(tài)良好，飲水和進(jìn)食較多，大便量多。

2.2嗜酸乳酸桿菌組對(duì)小鼠結(jié)腸組織病理的影響 正常對(duì)照組結(jié)腸黏膜光滑，無水腫、充血等表現(xiàn)；模型組小鼠結(jié)腸黏膜缺損，腺體破壞或消失，可見黏膜、黏膜下層甚至肌層大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，隱窩增生，組織上皮破損，炎癥細(xì)胞廣泛浸潤(rùn)，呈典型炎癥改變。給予嗜酸乳酸桿菌組可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)少，炎癥程度較模型組明顯減輕。1×106 CFU/ml濃度的嗜酸乳酸桿菌對(duì)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠腸道屏障修復(fù)作用最明顯，減輕炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)效果最佳；1×105 CFU/ml濃度的嗜酸乳酸桿菌、1×107 CFU/ml濃度的嗜酸乳酸桿菌組小鼠結(jié)腸病理表現(xiàn)較模型組炎癥浸潤(rùn)、病變深度、隱窩破壞均不同程減輕。

2.3免疫熒光染色檢測(cè)結(jié)腸黏膜zo-1、occludin蛋白的定位分布 Zo-1、occludin蛋白的免疫熒光表達(dá)更具有特異性。激光共聚焦顯微鏡下見zo-1蛋白呈現(xiàn)綠光，occludin蛋白呈現(xiàn)紅光。急性期正常對(duì)照組zo-1、occludin蛋白表達(dá)可見熒光沿胞膜分布，熒光強(qiáng)度強(qiáng)，邊緣光滑；模型組熒光分布較正常對(duì)照組分散，熒光強(qiáng)度減弱，邊緣粗糙呈鋸齒狀；1×105 CFU/ ml、1×106 CFU/ml、1×107 CFU/ml嗜酸乳酸桿菌組熒光仍沿胞膜分布，強(qiáng)度較正常對(duì)照組稍減弱，但仍強(qiáng)于模型組；1×105CFU/ml嗜酸乳酸桿菌組和1×107 CFU/ml嗜酸乳酸桿菌組小鼠結(jié)腸組織中Zo-1、occludin蛋白表達(dá)熒光分布較1×106 CFU/ml嗜酸乳酸桿菌組分散，熒光強(qiáng)度減弱，邊緣粗糙呈鋸齒狀。

3討論

UC作為一種以腸道癥狀為主要表現(xiàn)的疾病，且主要發(fā)病部位集中在腸道細(xì)菌呈高濃度的結(jié)直腸部位，結(jié)合環(huán)境因素的改變繼而發(fā)病率改變的現(xiàn)象，提示其發(fā)病與腸道細(xì)菌有密切關(guān)系。近年研究更顯示腸道菌群的紊亂是誘發(fā)的一個(gè)重要因素，相關(guān)研究報(bào)道用糞便灌腸治療法能緩解腸道炎癥，這表明細(xì)菌在本病發(fā)病中起著重要作用[1]。

參考文獻(xiàn)：

[1]Wills ES，Jonkers DM，Savelkoul PH，et al.Fecal microbial composition of ulcerative colitis and Crohn's disease patients in remission and subsequent exacerbation[J].PLoS One，2014，9（3）：e90981.

編輯/丁一