缺氧缺糖/復氧復糖PC12細胞自噬的形態學變化與細胞凋亡的關系*

靳曉飛， 張 穎， 李愛英， 武密山， 周曉紅， 趙艷萌， 高維娟△

(1承德醫學院病理生理學教研室，河北 承德 067000； 2河北中醫學院，河北省心腦血管病中醫藥防治重點實驗室，河北 石家莊 050200)

缺氧缺糖/復氧復糖PC12細胞自噬的形態學變化與細胞凋亡的關系*

靳曉飛1， 張 穎2， 李愛英2， 武密山2， 周曉紅2， 趙艷萌2， 高維娟2△

(1承德醫學院病理生理學教研室，河北 承德 067000；2河北中醫學院，河北省心腦血管病中醫藥防治重點實驗室，河北 石家莊 050200)

目的： 觀察缺氧缺糖/復氧復糖PC12細胞自噬的形態學變化及其與細胞凋亡的關系，探討自噬對PC12細胞的保護作用。方法:取對數生長期的PC12細胞，隨機分為正常對照組、缺氧缺糖/復氧復糖組、自噬抑制劑組和自噬激活劑組。其中缺氧缺糖/復氧復糖組、自噬抑制劑組和自噬激活劑組進行缺氧缺糖3 h后再復氧復糖12 h，自噬抑制劑組和自噬激活劑組于復氧復糖的同時分別給予自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤和自噬激活劑雷帕霉素。用透射電子顯微鏡和單丹磺酰尸胺熒光染色檢測自噬小體的變化，Annexin V-FITC/PI流式細胞術和TUNEL染色檢測細胞凋亡的情況。結果:與正常對照組相比，缺氧缺糖/復氧復糖組的自噬小體增多(P<0.05)，細胞凋亡率和凋亡指數升高(P<0.05)。與缺氧缺糖/復氧復糖組相比，自噬抑制劑組的自噬小體明顯減少(P<0.05)，細胞凋亡率和凋亡指數顯著升高(P<0.05)，而自噬激活劑組自噬小體變大，數量明顯增多(P<0.05)，并偶見自噬溶酶體，細胞凋亡率和凋亡指數顯著下降(P<0.05)。結論:缺氧缺糖/復氧復糖可以誘導PC12細胞發生自噬，且細胞自噬可以抑制細胞凋亡，發揮神經保護作用。

缺氧缺糖/復氧復糖； 自噬； 細胞凋亡； PC12細胞

自噬(autophagy)是細胞的一種自我吞噬現象，具有高度保守和精確調節的特點，廣泛存在于真核生物細胞內。當機體遇到饑餓、感染、藥物等因素刺激時，自噬可被大量激活，形成具有雙層膜結構的自噬小體，并通過自噬溶酶體途徑降解胞內的長壽命蛋白或老化損傷的細胞器，以實現細胞本身代謝的需要和細胞器的更新[1-2]。大量研究證實，自噬和凋亡在腦缺血再灌注損傷中發揮著非常關鍵的作用[3-4]，且貫穿于整個病變過程。研究發現，在腦缺血再灌注損傷的發生發展過程中，輕度缺氧缺血情況下，細胞自噬可發揮一定保護作用，而抑制自噬可加重損傷[5-7]。利用透射電子顯微鏡觀察自噬小體的變化被認為是檢測自噬的金標準，并且在某種程度上自噬小體的多少代表了自噬活動的強弱[8]，而在腦缺血再灌注損傷過程中，自噬小體的變化與細胞凋亡的關系如何？相關報道尚不詳細。因此，本實驗以常用于神經系統疾病體外研究的PC12細胞為實驗對象，建立缺氧缺糖/復氧復糖細胞模型，模擬神經元缺血再灌注損傷，觀察缺氧缺糖/復氧復糖PC12細胞自噬小體的變化，探討細胞自噬對抑制細胞凋亡和發揮神經保護的重要作用。

材 料 和 方 法

1 主要材料和儀器

神經生長因子誘導后的高分化PC12細胞由河北醫科大學第一醫院許順江教授惠贈；自噬檢測試劑盒[單丹酰尸胺(monodansylcadaverine, MDC)法]購于凱基生物公司；TUNEL檢測凋亡試劑盒購于Roche；Annexin V-FITC/PI雙染色試劑盒購于BD；自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)和自噬激活劑雷帕霉素(rapamycin，RAPA)購于Sigma；馬血清購于BI；胎牛血清購于PAR；RPMI-1640培養基由Gibco生產；Earle’s平衡鹽溶液由LEAGENE生產；Triton X-100購于北京索萊寶科技有限公司；DAB試劑盒購于北京中山金橋生物技術公司；其它試劑為國產分析純。二氧化碳培養箱3111型和三氣培養箱3131型購于Thermo；熒光顯微鏡DM5000B型購于Leica；透射電子顯微鏡H-7650型購于HITACHI；流式細胞儀FACSAriaII型購于BD。

2 實驗方法

2.1 細胞培養 PC12細胞接種在含10%胎牛血清、5%馬血清和1%青、鏈霉素混合液的RPMI-1640培養液中，置于二氧化碳培養箱(37 ℃、5% CO2、飽和濕度)進行培養，每2～3 d換液1次，當細胞融合度達70%～80%時進行傳代。

2.2 缺氧缺糖/復氧復糖細胞模型的建立與實驗分組 取對數生長期的PC12細胞，隨機分為4組：正常對照(control)組、模型(model)組(即缺氧缺糖/復氧復糖組)、自噬抑制劑3-MA組和自噬激活劑RAPA組。除正常對照組外，其余各組建立缺氧缺糖/復氧復糖細胞模型：棄去正常細胞培養液(RPMI-1640培養液，含10%胎牛血清、5%馬血清和1%青、鏈霉素混合液)，用預熱的PBS清洗細胞2次，更換培養液為無糖Earle’s培養液模擬細胞缺血狀態，然后放入含94% N2、5% CO2、1% O2的37 ℃三氣培養箱內培養，氧糖剝奪3 h后，更換無糖Earle’s培養液為正常細胞培養液，放入37 ℃、5% CO2培養箱中繼續培養12 h[9-10]。正常對照組正常培養，不進行任何處理；自噬抑制劑組和自噬激活劑組氧糖剝奪3 h后復氧復糖的同時分別加入3-MA(終濃度為5 mmol/L)和RAPA(終濃度為250 nmol/L)，直到培養結束。

2.3 透射電子顯微鏡檢測自噬小體 0.25%胰蛋白酶(不含EDTA)對細胞進行消化；PBS清洗細胞2次；1 000 r/min離心5 min；2.5%戊二醛固定細胞4 h；PBS浸洗3次；1%鋨酸固定細胞2 h；PBS浸洗2次；丙酮逐級脫水(50%、70%、80%、90%、100%)2遍；包埋劑∶純丙酮1∶1配制， 37 ℃浸透1 h，包埋劑∶純丙酮3∶1配制，37 ℃浸透3 h，純包埋劑37 ℃浸透5 h；37 ℃恒溫箱12 h和60 ℃恒溫箱36 h聚合；超薄切片機切片(厚度約50 nm)；醋酸雙氧鈾和酸鉛雙重染色；HITACHI H-7650型透射電子顯微鏡觀察單位面積內自噬小體的形態變化和數目。

2.4 MDC熒光染色檢測自噬小體 參考凱基生物公司自噬檢測試劑盒(MDC法)說明書進行操作，將細胞接種到24孔板中做細胞爬片，初始濃度為2×108/L，置于CO2培養箱培養24 h，細胞貼壁后，進行造模及給藥處理。4%多聚甲醛室溫固定細胞25 min；PBS浸洗2次；300 μL 1× wash buffer 清洗細胞2次；每孔加入100 μL MDC工作液(1× wash buffer與MDC染色液按9∶1混合),室溫避光反應45 min；棄去MDC工作液，300 μL 1× wash buffer 清洗細胞3次；每孔加入100 μL collection buffer覆蓋細胞爬片；熒光顯微鏡觀察并計算單位面積內熒光斑點的數目，激發濾光片波長為355 nm，阻斷濾光片波長為512 nm。

2.5 Annexin V-FITC/PI流式細胞術檢測細胞凋亡百分率 參考BD凋亡試劑盒說明書進行操作，0.25%胰蛋白酶(不含EDT A)消化細胞，1 500 r/min將細胞離心5 min，4 ℃ PBS清洗細胞2次，100 μL 1× binding buffer重懸細胞(約含1×105個細胞)，同時加入5 μL FITC和5 μL PI，避光室溫反應15 min，最后加入400 μL 1× binding buffer，1 h內上機檢測各組細胞凋亡百分率。

2.6 TUNEL染色檢測細胞凋亡 參考Roche的TUNEL凋亡試劑盒說明書進行操作，細胞接種于6孔板做爬片，初始細胞濃度為2×108/L，置于二氧化碳培養箱培養24 h，待細胞貼壁后進行造模及給藥處理。細胞在4%多聚甲醛中室溫固定25 min，0.2%的Triton X-100透化細胞5 min，新鮮配制的3% H2O2室溫處理細胞5 min，待玻片干后，加50 μL TUNEL反應混合液(TdT與dUTP按1∶9混合)于細胞上，陰性對照組僅加50 μL dUTP液，37 ℃避光濕盒反應60 min，待玻片干后，加50 μL converter-POD于細胞上，37 ℃避光濕盒反應30 min，加100 μL DAB顯色劑，室溫反應10 min，蘇木素復染，幾秒后用自來水沖洗，脫水，透明，封片。細胞核被染成棕黃色者為凋亡細胞(即陽性細胞)，每張切片在高倍鏡下(×400)隨機選取5 個不同的視野，計算每個視野中陽性細胞所占比例(即細胞凋亡指數)，取其平均值。

3 統計學處理

用SPSS 19.0統計軟件進行分析，數據用均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析,各組均數間兩兩比較使用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 透射電子顯微鏡觀察缺氧缺糖/復氧復糖PC12細胞自噬小體的變化

正常對照組無典型自噬小體的形成；模型組可見包裹著細胞內容物的空泡狀雙層膜結構，即自噬小體；與模型組相比，自噬抑制劑組自噬小體減少(P<0.05)，而自噬激活劑組自噬小體變大，數量顯著增多(P<0.05)，并偶見單層膜囊泡樣結構，即自噬溶酶體，見圖1。

Figure 1.The morphological observations of autophagosomes under transmission electron microscope. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmo-del group.

圖1 透射電子顯微鏡檢測各組細胞自噬小體的結果

2 MDC熒光染色觀察缺氧缺糖/復氧復糖PC12細胞自噬小體的變化

正常對照組偶見少量熒光斑點，熒光強度微弱；與正常對照組相比，模型組熒光斑點增多(P<0.05)，且熒光強度增強；與模型組相比，自噬抑制劑組熒光斑點顯著減少(P<0.05)，熒光強度減弱，而自噬激活劑組熒光斑點顯著增多(P<0.05)，差異有統計學意義。該實驗結果與透射電子顯微鏡所得結果趨勢相一致，見圖2。

3 流式細胞術檢測缺氧缺糖/復氧復糖PC12細胞凋亡率

與正常對照組相比，模型組細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，自噬抑制劑組細胞凋亡率升高(P<0.05)，而自噬激活劑組細胞凋亡率下降(P<0.05)，差異有統計學意義，見圖3。

Figure 2.The observation of autophagosomes with MDC fluorescent staining. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group.

圖2 MDC熒光染色檢測各組細胞自噬小體的結果

4 TUNEL染色檢測缺氧缺糖/復氧復糖PC12細胞凋亡

正常對照組偶見凋亡細胞；與正常對照組相比，模型組細胞凋亡指數升高(P<0.05)；與模型組相比，自噬抑制劑組細胞凋亡指數顯著升高(P<0.05)，而自噬激活劑組細胞凋亡指數顯著下降(P<0.05)，差異有統計學意義。該實驗結果與流式細胞術所得結果趨勢相一致，見圖4。

討 論

自噬是指從內質網膜、高爾基體膜或線粒體外膜脫落形成的雙層膜與需要降解的長壽命蛋白或老化損傷的細胞器集結在一起，形成自噬小體，并與溶酶體逐漸融合形成自噬溶酶體，通過自噬溶酶體途徑降解其所包裹的大分子物質，提供急需的營養物質，以維持細胞內環境的穩定。自噬分為3種類型：巨自噬、微自噬和分子伴侶介導的自噬，我們通常所說的細胞自噬為巨自噬，也是目前研究最多和最深入的。自噬的檢測方法主要包括透射電子顯微鏡下形態學觀察、MDC熒光染色、自噬相關蛋白的直接或間接檢測等，應用透射電子顯微鏡觀察自噬小體的變化是檢測自噬最經典、最直接的方法，被認為是檢測自噬的金標準。

Figure 3.The changes of the apoptotic rates in the PC12 cells with different treatments examined by flow cytometry with Annexin V-FITC/PI staining. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group.

圖3 Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術檢測各組細胞凋亡率的比較

自噬功能的異?？蓪е露喾N腦血管疾病的發生或發展[6]。Puyal 等[11]研究發現，于腦缺血再灌注損傷前給予自噬激活劑可明顯減輕腦缺血再灌注損傷，縮小腦梗死容積，減輕神經功能障礙。Carloni 等[12]研究發現，大鼠腦缺血缺氧4 h后海馬和皮質神經元中的自噬相關基因beclin-1表達上調，在缺血缺氧24 h達到高峰，應用自噬激活劑雷帕霉素后beclin-1表達顯著上調，同時死亡的海馬和皮質神經元數量明顯減少，而給予自噬抑制劑3-MA后，beclin-1表達下降，死亡的海馬和皮質神經元數量增多。Sheng 等[13]研究發現，在離體培養的氧糖剝奪細胞模型中，缺氧缺糖可以誘導PC12細胞發生自噬，LC3-Ⅱ水平和自噬小體數量明顯升高，而應用自噬抑制劑3-MA后細胞活性降低，損傷明顯加重。

Figure 4.The changes of the apoptosis in the PC12 cells with different treatments examined by TUNEL(×400). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group.

圖4 TUNEL染色檢測各組細胞凋亡的結果

細胞凋亡是指由體內體外多種因素觸發細胞內存的死亡程序而導致的細胞死亡過程，被稱為I型程序性細胞死亡[14]，而由于過度自噬導致的細胞死亡被稱為II型程序性細胞死亡[15]。自噬和凋亡既有明顯的區別，又存在著復雜的聯系。Ryter 等[16]報道，在心肌缺血損傷中，細胞自噬可抑制心肌細胞的凋亡，減輕缺血導致的繼發性損傷，但過度自噬會促進細胞凋亡。眭怡群等[17]報道，自噬相關基因 beclin-1、LC3與凋亡相關基因BCL-2、p53在大腸癌的發生、發展中起協調作用。Bauvy 等[18]研究發現，在 HT-29結腸癌細胞中應用自噬抑制劑3-MA后，細胞凋亡活性明顯增強，提示細胞的自噬作用可抑制細胞凋亡。

本實驗結果顯示,缺氧缺糖/復氧復糖后PC12細胞內的自噬小體明顯增多，應用自噬抑制劑后，自噬小體減少，細胞凋亡程度上升，而給予自噬激活劑后，自噬小體變大且數量明顯增多，細胞凋亡程度顯著下降。這表明缺氧缺糖/復氧復糖可以誘導PC12細胞發生自噬，形成具有典型雙層膜結構的自噬小體，并且細胞自噬可以抑制細胞凋亡，發揮神經保護作用。

本實驗初步研究了自噬的形態學變化與細胞凋亡的關系，但自噬是一把雙刃劍，自噬過強會導致細胞死亡，并且自噬的發生是一個動態過程，如何更加精確地檢測自噬、調控自噬、甚至應用藥物干預自噬從而抑制細胞凋亡發揮神經保護作用將是我們下一步重點研究的方向。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Relationship between morphological changes of autophagy and apoptosis in PC12 cells induced by oxygen-glucose deprivation and reoxygenation

JIN Xiao-fei1, ZHANG Ying2, LI Ai-ying2, WU Mi-shan2, ZHOU Xiao-hong2, ZHAO Yan-meng2, GAO Wei-juan2

(1DepartmentofPathophysiology,ChengdeMedicalCollege,Chengde067000,China;2HebeiUniversityofChineseMedicine,HebeiKeyLaboratoryofChineseMedicineResearchonCardiocerebrovascularDisease,Shijiazhuang050200,China.E-mail：gwj6088@163.com)

AIM: To investigate the relationship between morphological changes of autophagy and apoptosis in the PC12 cells induced by oxygen-glucose deprivation and reoxygenation. METHODS: The PC12 cells were randomly divided into normal control group, oxygen-glucose deprivation and reoxygenation group, autophagy inhibitor group and autophagy activator group. The cells in oxygen-glucose deprivation and reoxygenation group, autophagy inhibitor group and autophagy activator group were exposed to reoxygenation (12 h) after 3 h of oxygen-glucose deprivation, and autophagy inhibitor 3-methyladenine and autophagy activator rapamycin were added into the cells at the same time. Using transmission electron microscope and monodansylcadaverine fluorescence staining, the morphological changes of autophagosome were observed. The apoptosis of the PC12 cells were analyzed by flow cytometry with Annexin V-FITC/PI staining and TUNEL method. RESULTS: Compared with normal control group, the numbers of autophagosomes and the apoptotic rates increased in oxygen-glucose deprivation and reoxygenation group (P<0.05). Compared with oxygen-glucose deprivation and reoxygenation group, the numbers of autophagosomes decreased obviously (P<0.05) and the apoptotic rates increased markedly in autophagy inhibitor group (P<0.05). The numbers of autophagosomes increased obviously (P<0.05), the apoptotic rates decreased markedly (P<0.05), the autophagosomes became bigger in size, and autolysosomes was also found in autophagy activator group. CONCLUSION: Oxygen-glucose deprivation and reoxygenation induce autophagy in PC12 cells, and autophagy inhibits cell apoptosis to play a protective role.

Oxygen-glucose deprivation and reoxygenation; Autophagy; Cell apoptosis; PC12 cells

1000- 4718(2016)12- 2157- 06

2016- 08- 15

2016- 10- 08

河北省應用基礎研究計劃重點項目(No. 16967756D)； 河北省普通高校高層次人才科學研究計劃項目(No. GCC2014031)； 河北省2016年博士學位點科研能力建設項目(No. 169677128D)； 河北省重點學科建設項目; 河北省研究生創新資助項目

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.12.006

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