Akt通路及細胞凋亡在瘦素介導的大鼠慢性嗎啡鎮痛耐受中的作用*

胡 芬， 崔 宇， 郭瑞鮮， 莫利求， 馮鑒強△

(中山大學 1附屬第一醫院病理學教研室， 2中山醫學院生理學教研室，廣東 廣州 510080； 3中山大學附屬第一醫院黃埔院區麻醉科，廣東 廣州 510700)

Akt通路及細胞凋亡在瘦素介導的大鼠慢性嗎啡鎮痛耐受中的作用*

胡 芬1， 崔 宇2， 郭瑞鮮2， 莫利求3， 馮鑒強2△

(中山大學1附屬第一醫院病理學教研室，2中山醫學院生理學教研室，廣東 廣州 510080；3中山大學附屬第一醫院黃埔院區麻醉科，廣東 廣州 510700)

目的： 探討Akt(又稱蛋白激酶B)及活化的caspase-3在瘦素介導的大鼠慢性嗎啡鎮痛耐受中的作用。方法：在SD大鼠建立慢性嗎啡鎮痛耐受模型；采用Western blotting法測定脊髓Akt和cleaved caspase-3的水平；免疫組織化學染色法檢測脊髓磷酸化Akt (p-Akt)及cleaved caspase-3陽性細胞；免疫雙染檢測p-Akt及cleaved caspase-3陽性細胞的定位。結果：鞘內慢性注射嗎啡(15 μg)7 d可明顯上調大鼠脊髓p-Akt及cleaved caspase-3的蛋白水平；在注射嗎啡前30 min，鞘內注射瘦素拮抗劑(3 μg)7 d能顯著地抑制慢性嗎啡處理對p-Akt和cleaved caspase-3的上調作用；p-Akt只定位在脊髓神經元，而cleaved caspase-3僅定位在星形膠質細胞；瘦素拮抗劑、Akt抑制劑及caspase-3抑制劑均能抑制慢性嗎啡鎮痛耐受。結論：脊髓Akt通路及活化的caspase-3參與瘦素介導的大鼠慢性嗎啡鎮痛耐受。

瘦素； Akt； Caspase-3； 嗎啡鎮痛耐受

瘦素(leptin)是一種主要由脂肪組織分泌的分子量為16 kD的激素，隨血循環到達全身各系統發揮重要的生理及病理生理作用。近年，有研究證實，瘦素與神經損傷引起的痛行為有關[1]。我們觀察到，瘦素可通過激活信號轉導子與轉錄激活子3 (signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)通路和NMDA受體介導大鼠嗎啡(morphine, Mor)鎮痛耐受[2]。但是，瘦素在大鼠嗎啡鎮痛耐受中的作用機制是復雜的，可能還涉及其他的下游信號分子。

磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)-Akt(也被稱為蛋白激酶B)通路是瘦素介導的食物攝取快速作用的必需通路[3]。值得注意的是，嗎啡受體與嗎啡對Akt有明顯的調節作用， 例如嗎啡通過激活Akt引起體外培養的小膠質細胞增殖[4]。但是Akt是否參與瘦素介導的嗎啡鎮痛耐受尚未明了。

近年來，慢性嗎啡處理的致神經元凋亡作用受到重視。有報道慢性嗎啡處理能激活大鼠脊髓caspase-3(為反映細胞凋亡的指標)，此作用與嗎啡鎮痛耐受有關[5-6]。但是，瘦素是否參與慢性嗎啡耐受對caspase-3 的激活作用，國內外迄今未見報道。

為了探討上述的研究內容，本研究擬在SD大鼠建立嗎啡鎮痛耐受模型，重點探討Akt通路在瘦素介導的嗎啡鎮痛耐受和活化的caspase-3在瘦素介導的嗎啡鎮痛耐受中的作用。

材 料 和 方 法

1 動物和試劑

清潔級SD雄性大鼠36只，體重250～280 g，由國家級動物實驗中心中山大學北校區動物中心提供。

鹽酸嗎啡購自青海制藥有限公司；瘦素拮抗劑(leptin antagonist，LA)由ProSpec供應；兔抗大鼠瘦素多克隆抗體和羊抗大鼠瘦素受體多克隆抗體購自Santa Cruz；Akt抑制劑LY294002(LY)、兔抗大鼠p-Akt多克隆抗體及兔抗大鼠Akt多克隆抗體購自CST；caspase-3抑制劑Ac-DEVD-CHO (Ac)購自Sigma；兔抗大鼠cleaved caspase-3 抗體購自Bioworld；小鼠抗大鼠神經元特異性核蛋白(neuron-specific nuclear protein,Neu)單克隆抗體、小鼠抗大鼠小膠質細胞標志物OX-42單克隆抗體及小鼠抗大鼠GFAP單克隆抗體購自Chemicon。

2 方法

2.1 實驗動物模型的建立、行為學測試及分組 大鼠于12 h光照-黑暗循環、安靜環境下單籠飼養，自由飲水攝食。室溫控制在(25±1) ℃。按照前文[2]介紹的方法，每只大鼠每天于上午9時接受1次鞘內嗎啡注射(15 μg)，連續注射7 d。在給予注射嗎啡前及注射后30 min的第1、3、5、7天以熱甩尾法測試甩尾閾值，注射前為基礎閾值(basic latency，BL)，注射后為鎮痛閾值(total latency，TL)，動物尾部在熱水[(50.0±0.2) ℃]中停留最長時間為15 s(cut-off time)， 使用最大鎮痛百分比(percentage of maximal potential effect，%MPE)=(TL-BL)/(cut-off time-BL)×100%作為統計值來進行行為學測試。大鼠隨機分為8組，每組6只:生理鹽水(normal saline,NS)對照組、嗎啡耐受組(NS+Mor組)、瘦素拮抗劑(LA)干預組(LA+Mor組)、瘦素拮抗劑對照組(LA+NS組)、Akt抑制劑(LY)干預組(LY+Mor組)、Akt抑制劑對照組(LY+NS組)、caspase-3抑制劑干預組(Ac+Mor組)和caspase-3抑制劑對照組(Ac+NS組)。干預組在給予嗎啡注射前30 min給予藥物干預。

2.2 Western blot法測定Akt及caspase-3的蛋白水平 行為學測定結束后，立即處死大鼠取得新鮮脊髓組織，將組織與裂解液以1∶10比例于4 ℃混合勻漿后，迅速以15 000 r/min離心30 min，4 ℃離心取上清組織蛋白，于-80 ℃儲存。將組織蛋白與緩沖液以2∶1混合后加入SDS-PAGE凝膠中以恒壓進行蛋白電泳，將組織蛋白以8 V、30 min轉至PVDF膜，再將PVDF膜分別置于I抗液中(cleaved caspase-3，1∶2 000；p-Akt，1∶500)4 ℃孵育過夜，沖洗后置于 II 抗液中(1∶3 000)室溫孵育1.5 h，使用ECL發光顯影法于暗房中顯影，使用圖像分析軟件進行各條帶的灰度分析。

2.3 免疫熒光雙染法檢測p-Akt及cleaved caspase-3的細胞定位 行為學測定結束后，立即注射過量苯巴比妥鈉(100 mg/kg)處死大鼠，采用4%多聚甲醛溶液灌注后取腰段脊髓進行脫水及切片。加3%正常羊血清封閉1 h；加入稀釋后的混合 I 抗50 μL：兔抗大鼠p-Akt多克隆抗體(1∶200)或兔抗大鼠cleaved caspase-3 抗體(1∶200)，分別與小鼠抗大鼠Neu單克隆抗體(1∶400)、小鼠抗大鼠OX-42(1∶400)或小鼠抗大鼠膠質細胞原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)單克隆抗體(1∶400)置于I抗稀釋液中混合，4 ℃孵育過夜；沖洗后再加入稀釋后的混合 II 抗50 μL：Cy3標記的羊抗兔熒光II抗(1∶400)和FITC標記的羊抗小鼠熒光II抗(1∶400)。室溫于暗盒中避光孵育2 h，甘油緩沖液封片置于暗玻片盒中。Olympus熒光顯微鏡下觀察并照相。

3 統計學處理

采用SPSS 20.0統計分析軟件進行統計學分析，所有實驗結果數據以均數±標準誤(mean±SEM)表示。組間均數比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 瘦素拮抗劑抑制慢性嗎啡處理對大鼠脊髓p-Akt蛋白水平的上調作用

圖1顯示，在鞘內連續7 d注射嗎啡(15 μg/d)可明顯上調大鼠脊髓p-Akt的蛋白水平，與注射生理鹽水組比較，差異具有統計學顯著性(P<0.05)；但是在嗎啡注射前30 min，鞘內連續7 d注射3 μg LA顯著抑制慢性嗎啡處理對脊髓p-Akt蛋白水平的上調作用(P<0.05)。而單獨鞘內注射LA 7 d對p-Akt的基礎水平無明顯影響。

Figure 1.Leptin antagonist (LA) attenuated chronic morphine (Mor)-induced upregulation of spinal protein level of phosphorylated (p)-Akt in the rats. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vsNS group;#P<0.05vsNS+Mor group.

圖1 瘦素拮抗劑抑制慢性嗎啡處理對大鼠脊髓磷酸化Akt表達的上調作用

2 慢性嗎啡耐受大鼠脊髓p-Akt特異定位于神經元

免疫熒光雙染法可確定p-Akt陽性的細胞類型。使用GFAP(綠色熒光)作為星形膠質細胞標志物，OX-42(綠色熒光)作為小膠質細胞的標志物，Neu(綠色熒光)作為神經元的標志物。免疫熒光雙染結果顯示，p-Akt(紅色熒光)僅定位于脊髓神經元，在星形膠質細胞和小膠質細胞均未見p-Akt的熒光信號,見圖2。

3 瘦素拮抗劑抑制慢性嗎啡處理對脊髓cleaved caspase-3蛋白水平的上調作用

圖3顯示，鞘內連續7 d注射嗎啡顯著增加大鼠脊髓cleaved caspase-3(反映caspase-3被激活)的蛋白水平，與注射生理鹽水組比較，差異有統計學顯著性(P<0.05)。然而，在注射嗎啡前30 min，鞘內連續7 d注射LA明顯減弱了慢性嗎啡處理對脊髓cleaved caspase-3蛋白水平的促進作用，與嗎啡耐受組比較，差異具有統計學顯著性(P<0.05)。而單獨鞘內注射LA 7 d對脊髓cleaved caspase-3的基礎水平無明顯作用。

Figure 2.The p-Akt was exclusively observed in the spinal neurons in the chronic morphine-treated rats. GFAP as an astrocyte marker; OX-42 as a microglia marker; Neu as a neuron marker. The scale bar=50 μm.

圖2 慢性嗎啡耐受大鼠脊髓p-Akt僅表達于神經元

Figure 3.Leptin antagonist (LA) ameliorated chronic morphine (Mor)-induced an increase in spinal protein level of cleaved caspase-3 in the rats. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vsNS group;#P<0.05vsNS+Mor group.

圖3 瘦素拮抗劑減弱慢性嗎啡處理對大鼠脊髓cleaved caspase-3蛋白水平上調的促進作用

4 Cleaved caspase-3特異定位于脊髓星形膠質細胞

圖4結果顯示，在慢性嗎啡處理的大鼠，cleaved caspase-3(紅色熒光)只定位于脊髓星形膠質細胞，在小膠質細胞及神經元未見cleaved caspase-3的熒光信號。

Figure 4.The cleaved caspase-3 was exclusively observed in the spinal astrocytes in the chronic morphine-treated rats. GFAP as an astrocyte marker; OX-42 as a microglia marker; Neu as a neuron marker. The scale bar=50 μm.

圖4 慢性嗎啡處理大鼠脊髓cleaved caspase-3僅定位于星形膠質細胞

5 瘦素拮抗劑、Akt抑制劑及caspase-3抑制劑減輕大鼠慢性嗎啡鎮痛耐受

疼痛行為學的檢測結果顯示，第1天給予大鼠鞘內注射嗎啡可產生明顯的鎮痛作用[%MPE=(99.65±1.60)%]，與注射生理鹽水組比較，差異具有統計學顯著性(P<0.05)。在連續鞘內注射嗎啡期間，從第3天開始，嗎啡鎮痛作用明顯減弱，%MPE降至(73.34±3.95)%，與第1天的作用比較，差異有統計學顯著性(P<0.05)，表明嗎啡鎮痛耐受開始形成。隨著注射嗎啡的時間延長，注射嗎啡的第5天和第7天的鎮痛作用進一步減弱，其中注射嗎啡第7天的%MPE已降至(16.57±2.18)%，與注射嗎啡第1、3和5天的鎮痛作用分別比較，差異有統計學顯著性(P<0.05)。上述結果表明，鞘內連續7天注射嗎啡已導致大鼠產生嗎啡鎮痛耐受。

Figure 5.The inhibitory effects of intrathecal injection of leptin antagonist (LA), Akt inhibitor (LY) and caspase-3 inhibitor (Ac) on chronic morphine (Mor) antinociceptive tolerance in rats. Mean±SEM.n=6.*P<0.05vsNS+Mor group;#P<0.05vsNS group.

圖5 鞘內注射瘦素拮抗劑、Akt抑制劑和caspase-3抑制劑對慢性嗎啡鎮痛耐受的抑制作用

重要的是，在注射嗎啡前30 min，鞘內分別連續7 d注射瘦素拮抗劑(3 μg)或Akt抑制劑(5 mmol/L)或caspase-3抑制劑(5 μg)均能明顯地減輕大鼠慢性嗎啡鎮痛耐受，其中注射的第5天，%MPE從(38.09±5.96)%分別增加至(66.27±3.90)%、(60.77±7.22)%和(66.46±8.20)%。注射的第7 d，%MPE從(16.57±2.18)%分別增加至(54.29±5.83)%、(49.53±6.43)%和(58.92±6.11)%。而單獨鞘內分別注射LA、LY、Ac或生理鹽水均不影響大鼠的基礎痛閾。

討 論

嗎啡是一種臨床上常被用于治療急性和慢性疼痛的阿片類藥物。然而，長期持續應用嗎啡會產生嗎啡鎮痛耐受，表現為嗎啡的鎮痛作用逐漸減弱，甚至產生痛覺過敏，因此，限制了嗎啡的臨床應用。目前，深入探討嗎啡鎮痛耐受機制已成為鎮痛原理的一個重要課題。

越來越多的研究證實，引起嗎啡鎮痛耐受的分子機制和細胞機制是復雜的，涉及中樞神經系統的多個部位，如海馬、脊髓等；涉及多種細胞，如神經元、膠質細胞等；涉及多種受體，如阿片受體、NMDA受體等；涉及多種信號通路。近年來我們已證實大鼠脊髓小膠質細胞的p38絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路[7]、NMDA-JNK通路[8]及瘦素-STAT3通路[2]參與嗎啡鎮痛耐受。瘦素是一種主要由脂肪組織分泌的多肽激素，隨血循環到達全身多系統發揮其生理及病理生理作用[9]。我們最近證實，瘦素及其受體可在大鼠脊髓背角及背根節中表達，而且，慢性嗎啡處理可促進它們的表達[2]。但是，一些受嗎啡處理調控的信號分子，如Akt和cleaved caspase-3是否參與瘦素介導的嗎啡鎮痛耐受，迄今未見報道。Akt是瘦素靶通路PI3K通路的一個下游激酶，參與病理性神經痛的發生[10]。急性嗎啡處理(只注射1次)可上調大鼠伏核p-Akt的水平[11]。基于這些研究基礎，本研究推測，Akt可能參與瘦素介導的慢性嗎啡鎮痛耐受。研究結果表明，鞘內慢性嗎啡注射可明顯促進大鼠脊髓背角神經元p-Akt蛋白水平的上調；瘦素拮抗劑能抑制慢性嗎啡處理對p-Akt的上調作用，提示Akt通路位于瘦素的下游。進一步的研究證實，Akt抑制劑能抑制慢性嗎啡鎮痛耐受，表明脊髓Akt通路參與慢性嗎啡鎮痛耐受的發生。上述結果表明，通過激活Akt通路可能是瘦素介導慢性嗎啡鎮痛耐受的作用機制之一。

另一方面，本研究探討了脊髓凋亡信號分子cleaved caspase-3在瘦素介導嗎啡鎮痛耐受中的作用。有報道稱慢性嗎啡處理能激活大鼠脊髓的caspase-3，caspase-3的抑制劑能減輕嗎啡鎮痛耐受[5-6]。與他們的實驗結果相一致，本研究證實，鞘內連續7 d注射嗎啡可明顯地促進cleaved caspase-3的蛋白水平的上調，而且，cleaved caspase-3僅定位于大鼠脊髓背角的星形膠質細胞。Caspase-3抑制劑(Ac)能明顯地減輕大鼠慢性嗎啡鎮痛耐受。有意義的是，我們證實瘦素拮抗劑能顯著地抑制慢性嗎啡處理對cleaved caspase-3的上調作用，提示cleaved caspase-3是瘦素的一個下游靶分子，瘦素可通過激活caspase-3引起大鼠嗎啡鎮痛耐受。由于有研究指出，慢性嗎啡處理可激活脊髓星形膠質細胞[12-14]。因此，今后進一步探討在嗎啡鎮痛耐受中，活化的caspase-3與星形膠質細胞活動的相互關系將有助于深入闡明慢性嗎啡鎮痛耐受的病理生理機制。

綜上所述，本研究清晰地證實脊髓的Akt通路及cleaved caspase-3參與瘦素介導的大鼠慢性嗎啡鎮痛耐受，有可能是嗎啡鎮痛耐受的一個新穎的病理生理機制。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Roles of Akt pathway and cell apoptosis in leptin-mediated chronic morphine antinociceptive tolerance

HU Fen1, CUI Yu2, GUO Rui-xian2, MO Li-qiu3, FENG Jian-qiang2

(1DepartmentofPathology,FirstAffiliatedHospital,2DepartmentofPhysiology,ZhongshanMedicalSchool,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China;3DepartmentofAnesthesiology,HuangpuArea,FirstAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510700,China.E-mail:fengjq-sums@163.com)

AIM: To explore the roles of Akt (also called protein kinase B) and active caspase-3 in the leptin-mediated chronic morphine antinociceptive tolerance in rats. METHODS: A model of chronic morphine antinociceptive tolerance was established in the SD rats. The protein levels of spinal Akt and cleaved caspase-3 were tested by Western blotting. The technique of immunohistochemical staining was used to detect the immunoreactivity positive cells of phosphorylated (p)-Akt and cleaved caspase-3 in the spinal cord. Double staining of immunohistochemistry was used to examine the cellular location of the p-Akt and cleaved caspase-3 positive cells. RESULTS: The chronic intrathecal injection of morphine (15 μg) for 7 d markedly upregulated the spinal protein levels of p-Akt and cleaved caspase-3 in the rats. Thirty min before injection of morphine, intrathecal injection of leptin antagonist (3 μg) for 7 d significantly attenuated the upregulation of the protein levels of p-Akt and cleaved caspase-3 induced by chronic morphine treatment. The p-Akt was exclusively observed in the spinal neurons. The cleaved caspase-3 was only localized with the spinal astrocytes. Intrathecal injecting the inhibitors of leptin, Akt and caspase-3 ameliorated the chronic antinociceptive tolerance. CONCLUSION: The spinal Akt pathway and active caspase-3 are involved in the leptin-mediated chronic morphine antinociceptive tolerance in rats.

Leptin; Akt; Caspase-3; Morphine antinociceptive tolerance

1000- 4718(2016)12- 2163- 05

2016- 04- 29

2016- 08- 18

廣東省醫學科學技術研究基金資助項目(No.A2015415)

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.12.007

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△通訊作者 Tel： 13609738327； E-mail: fengjq-sums@163.com