異丙基腎上腺素不同給藥模式對(duì)小鼠心臟腺苷酸活化蛋白激酶活性的影響*

肖 晗， 馬曉偉， 付勇南， 張幼怡， 呂志珍

(北京大學(xué)第三醫(yī)院血管醫(yī)學(xué)研究所，衛(wèi)生部心血管分子生物學(xué)與調(diào)節(jié)肽重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，分子心血管學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，心血管受體研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191)

異丙基腎上腺素不同給藥模式對(duì)小鼠心臟腺苷酸活化蛋白激酶活性的影響*

肖 晗， 馬曉偉， 付勇南， 張幼怡， 呂志珍△

(北京大學(xué)第三醫(yī)院血管醫(yī)學(xué)研究所，衛(wèi)生部心血管分子生物學(xué)與調(diào)節(jié)肽重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，分子心血管學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，心血管受體研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191)

目的： 探討β-腎上腺素受體(β-AR)激動(dòng)劑異丙基腎上腺素(ISO)2種給藥模式對(duì)小鼠心臟腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)活性的影響，以及AMPK激動(dòng)劑在這2種模式中對(duì)心臟結(jié)構(gòu)和功能的不同作用。方法:采用皮下植入微滲透壓泵的方法給予雄性BALB/c小鼠持續(xù)14 d輸注ISO(5 mg·kg-1·d-1)以及每日皮下注射AMPK激動(dòng)劑AICAR(250 mg·kg-1·d-1)。分別于植入泵14 d后和植入泵14 d并撤泵3 d后，利用超聲心動(dòng)圖和血流動(dòng)力學(xué)方法檢測(cè)心臟功能并收集心臟樣本。Western blot檢測(cè)AMPK的磷酸化水平。結(jié)果:持續(xù)輸注ISO 14 d后心臟AMPK的磷酸化水平較對(duì)照組明顯增加(P<0.05)，AICAR并不進(jìn)一步增加AMPK磷酸化水平，反而有減少ISO引起的心臟AMPK磷酸化水平增加的趨勢(shì)。AICAR明顯抑制ISO引起的心臟重量增加。反映心臟收縮功能的左室短軸縮短率(FS)和左心室壓力最大上升速率(+dp/dtmax)在ISO組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，AICAR并不進(jìn)一步增加心臟收縮功能。反映心臟舒張功能的左室舒張末壓(LVEDP)在各組并無明顯改變。持續(xù)輸注異丙基腎上腺素14 d并撤泵3 d后心臟AMPK的磷酸化水平與對(duì)照組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。AICAR明顯抑制ISO引起的心臟重量增加。+dp/dtmax在ISO組明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，提示收縮功能下降。AICAR+ISO組與ISO組相比，有增加+dp/dtmax的趨勢(shì)。反映心臟舒張功能的LVEDP在ISO組明顯升高(P<0.05)，提示舒張功能明顯降低。而AICAR則顯著改善了ISO引起的舒張功能異常(P<0.05)。給予ISO后，AMPK磷酸化水平增加和心率增加的時(shí)間曲線一致，均為5 min開始升高，30 min開始下降至基礎(chǔ)水平。結(jié)論:β-AR持續(xù)激動(dòng)使AMPK活性持續(xù)升高，而撤泵后AMPK活性則降至對(duì)照水平。觀察AMPK激動(dòng)對(duì)心臟功能的改善作用需避免β-AR激動(dòng)引起的正性變時(shí)變力效應(yīng)的干擾。

β-腎上腺素受體； 腺苷酸活化蛋白激酶； 異丙基腎上腺素

腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是真核生物細(xì)胞中一個(gè)重要的蛋白激酶，它是由α、β和γ 3個(gè)亞基構(gòu)成的異源三聚體，其α亞單位上Thr172位點(diǎn)的磷酸化反映AMPK是否激活[1]。AMPK，顧名思義是AMP激活的激酶，當(dāng)受到外界刺激，如運(yùn)動(dòng)、低氧、氧化應(yīng)激時(shí)，細(xì)胞能量代謝狀況下降， AMP/ATP比例增加，就會(huì)激活A(yù)MPK。AMPK 激活后增加脂肪酸攝取和氧化，加速葡萄糖攝取，刺激糖酵解，增加ATP 生成。同時(shí)為了保存細(xì)胞內(nèi)ATP，蛋白質(zhì)以及脂質(zhì)合成均受到抑制。因此AMPK被稱作細(xì)胞的能量感受器，可以增強(qiáng)產(chǎn)生能量ATP的代謝通路而減弱消耗能量的合成通路[2]。心臟的多種病理刺激均可導(dǎo)致其AMPK活性增加，如缺氧[3]、運(yùn)動(dòng)[4]、左心室壓力負(fù)荷[5]。既往研究表明，AMPK的激活在心肌缺血引起的心臟損傷中發(fā)揮心肌保護(hù)作用，其機(jī)制包括抑制心肌細(xì)胞凋亡與壞死，促進(jìn)細(xì)胞自噬，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與氧化應(yīng)激[6]。心肌缺血后引起的代償性AMPK激活，可以通過調(diào)節(jié)糖脂代謝增加ATP產(chǎn)生，維持心臟能量穩(wěn)態(tài)[6]。此外，我們前期研究發(fā)現(xiàn)游泳訓(xùn)練可以通過激活A(yù)MPK，抑制β-腎上腺素受體(β-adrenoceptor,β-AR)激動(dòng)劑異丙基腎上腺素(isoproterenol，ISO)激活引起的心臟纖維化[7]。

β-腎上腺素受體的長(zhǎng)期過度激活可以引起病理性心臟重塑，包括左室肥厚、心肌間質(zhì)纖維化和心肌細(xì)胞凋亡，并且最終發(fā)展為心力衰竭[8]。而β-腎上腺素受體激動(dòng)最重要的生理功能之一就是變時(shí)、變力和變傳導(dǎo)的正性肌力作用，這一作用可加快心率，促進(jìn)心臟收縮功能。當(dāng)心率加快，心臟耗能會(huì)增加，理論上會(huì)代償性激活A(yù)MPK。但是我們既往研究發(fā)現(xiàn)，在每日皮下注射ISO的小鼠心臟中，AMPK活性并不增加[7]。由此我們提出以下問題：β-腎上腺素受體持續(xù)激動(dòng)時(shí)AMPK活性是否增加？AMPK激動(dòng)劑又是否能夠改善β-腎上腺素受體持續(xù)激動(dòng)引起的心臟病理性重構(gòu)？

因此，本研究觀察了β-腎上腺素受體激動(dòng)劑ISO持續(xù)輸注14 d后，小鼠心臟AMPK活性以及AMPK激動(dòng)劑AICAR對(duì)小鼠心臟結(jié)構(gòu)與功能的影響。為排除β-腎上腺素受體激動(dòng)的正性肌力作用對(duì)AMPK活性的影響，我們又進(jìn)一步觀察了ISO持續(xù)輸注14 d并撤泵3 d后的上述指標(biāo)。并初步探討了2種模型心臟AMPK活性不同的可能原因。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性BALB/c小鼠，8～10周齡，20～25 g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理批準(zhǔn)號(hào)為L(zhǎng)A2010-035。采用皮下植入微滲透壓泵(Alzet)的方法持續(xù)14 d輸注生理鹽水、ISO(5 mg·kg-1·d-1)和(或)每日皮下注射AMPK激動(dòng)劑AICAR(250 mg·kg-1·d-1)，分為對(duì)照(control)組、ISO組、AICAR組和ISO+AICAR組。分別于植入泵14 d后和植入泵14 d并撤泵3 d后檢測(cè)心臟功能并收集心臟樣本。此外，為明確ISO對(duì)AMPK活性影響隨時(shí)間變化情況，我們給予小鼠單次注射ISO(5 mg/kg)，并在不同時(shí)點(diǎn)收集心臟樣本。

2 主要試劑

ISO購(gòu)自Sigma；AICAR 購(gòu)自Toronto Research Chemicals；抗p-AMPK(Thr172)抗體和抗AMPK抗體購(gòu)自CST；抗eIF5抗體購(gòu)自Santa Cruz；其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。

3 主要方法

3.1 Western blot法檢測(cè)蛋白水平 取小鼠心臟并迅速放置液氮中，研磨后加入組織裂解液裂解15 min，超聲處理后于4 ℃、12 000×g離心15 min，所得上清保存并蛋白定量。取60 μg蛋白進(jìn)行10% SDS-PAGE凝膠電泳，蛋白分離后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉置于室溫封閉1 h, 孵育p-AMPK(Thr172)(1∶1 000)、AMPK (1∶1 000)和eIF5(1∶5 000)抗體4 ℃過夜。次日TBST洗膜后，將膜置于HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶2 000)中，室溫孵育1 h, 洗膜后用ECL發(fā)光液顯影。

3.2 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)小鼠心功能 小鼠用3%異氟烷(1 L/min)麻醉后，胸部脫毛，平臥放置于加熱板上。采用Vevo 770超聲儀(Visualsonics)進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢測(cè)。應(yīng)用30 MHz探頭探測(cè)乳頭肌水平的胸骨旁短軸切面。用M型超聲在左室最大腔徑處記錄左心室前后壁運(yùn)動(dòng)曲線，測(cè)量心率，左室內(nèi)徑，并計(jì)算左室短軸縮短率(fractional shortening，F(xiàn)S)，計(jì)算公式如下：FS(%)=(舒張末左室內(nèi)徑-收縮末左室內(nèi)徑)/舒張末左室內(nèi)徑×100 %。

3.3 血流動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià) 小鼠藥物麻醉后(1.25%三溴乙醇腹腔注射，劑量為250 mg/kg體重)固定于恒溫水浴板上。取頸部胸骨上窩正中切口，暴露并分離右側(cè)頸總動(dòng)脈。將與多導(dǎo)生理記錄儀(Biopac Systems)連接的1.4F微型壓力測(cè)量導(dǎo)管(Millar Instruments)經(jīng)右側(cè)頸總動(dòng)脈插入主動(dòng)脈、左心室，記錄主動(dòng)脈及左心室內(nèi)壓力，測(cè)量心臟收縮功能的指標(biāo)左心室壓力最大上升速率(maximum rate of pressure rise, +dp/dtmax)和心臟舒張功能指標(biāo)左室舒張末壓(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)。

3.4 心臟稱重 小鼠測(cè)量體重后，置于充滿二氧化碳?xì)怏w的密閉盒內(nèi)處死，迅速剪開其胸廓，心內(nèi)注射10%氯化鉀使其在舒張末期停跳，取出心臟置于冰PBS(0.8% NaCl，0.02% KCl，0.02% KH2PO4，0.4% Na2HPO4)中進(jìn)行灌洗，剪除心臟上的血管、脂肪組織等，用濾紙吸干水分，稱全心重量(heart weight，HW)，分離并測(cè)量脛骨長(zhǎng)度(tibia length,TL)，計(jì)算全心重量/脛骨長(zhǎng)度(HW/TL)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，先采用雙因素方差分析(two-way ANOVA)確定2種藥物(ISO和AICAR)對(duì)相應(yīng)指標(biāo)是否存在交互作用。如存在交互作用，則分層采用非配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較；如不存在交互作用，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 持續(xù)輸注異丙基腎上腺素14 d后心臟AMPK活性增加

如圖1所示，持續(xù)輸注ISO 14 d后，心臟磷酸化AMPK水平明顯增加(P<0.05)，提示AMPK活性在持續(xù)輸注ISO的小鼠心臟中是明顯增加的。在AICAR組以及ISO+AICAR組的小鼠心臟中，磷酸化AMPK水平也均明顯增加(P<0.05)。值得注意的是，雙因素方差分析提示ISO與AICAR對(duì)心臟AMPK活性的影響存在交互作用。在ISO與AICAR共同作用下，心臟磷酸化AMPK水平較單獨(dú)AICAR組明顯降低(P<0.05)，與單獨(dú)ISO組相比也有下降趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這一結(jié)果提示ISO與AICAR共同作用下，心臟AMPK活性雖然較對(duì)照組升高，但與單獨(dú)給藥組(ISO或AICAR)相比，心臟AMPK活性反而降低。

Figure 1. Increased AMPK activity in the hearts of the mice with sustained infusion of isoproterenol (ISO). The heart tissues were harvested after the mice were subcuta-neously injected with AICAR (250 mg·kg-1· d-1) or saline and infused with ISO (5 mg·kg-1·d-1) for 14 d. Mean±SEM.n=5～6.*P<0．05,**P<0.01vscontrol；##P<0．01vsAICAR.

圖1 持續(xù)輸注異丙腎上腺素增加心臟的AMPK活性

2 持續(xù)輸注異丙基腎上腺素和(或)AICAR 14 d后，心臟結(jié)構(gòu)和功能的變化

如圖2所示，持續(xù)輸注ISO 14 d后，心臟重量明顯增加(P<0.05)，而給予AICAR則可明顯抑制ISO引起的心臟重量增加(P<0.05)。超聲心動(dòng)圖檢測(cè)FS的變化提示ISO可明顯增加心臟收縮功能(P<0.05)。類似的，反映心臟收縮功能的血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)+dp/dtmax在ISO組與ISO+AICAR組均較對(duì)照組顯著增加。提示持續(xù)輸注ISO顯著增加心臟收縮功能。但是ISO+AICAR組與單獨(dú)給予ISO組相比，心臟收縮功能指標(biāo)FS或+dp/dtmax并無明顯差別。提示在持續(xù)輸注ISO模型中，AICAR并不進(jìn)一步影響ISO引起的心臟收縮功能增加。反映心臟舒張功能的LVEDP在各組亦無明顯改變，提示持續(xù)輸注ISO 14 d和給予AICAR對(duì)心臟舒張功能均無明顯影響。

3 持續(xù)輸注異丙基腎上腺素14 d并撤泵3 d后心臟AMPK活性并不增加

如圖3所示，持續(xù)輸注異丙基腎上腺素14 d并撤泵3 d后，心臟組織磷酸化AMPK水平與對(duì)照組相比并無明顯變化。只有單獨(dú)給予AICAR組，心臟組織磷酸化AMPK水平明顯增加(P<0.05)。ISO+AICAR組與對(duì)照組相比無明顯增加。 ISO+AICAR組與單獨(dú)給予ISO組相比，心臟組織AMPK磷酸化水平并無明顯差別。類似的，ISO+AICAR組與單獨(dú)給予AICAR組相比，心臟組織AMPK磷酸化水平有下降趨勢(shì)。這些結(jié)果提示，在持續(xù)輸注ISO14 d并撤泵3 d的模型中，心臟AMPK活性并不增加，在此基礎(chǔ)上給予AICAR也不能顯著增加心臟AMPK活性。相反，與單獨(dú)給予AICAR組相比，ISO有抑制心臟AMPK活性的趨勢(shì)。

Figure 2. The cardiac structure and function in the mice with sustained infusion of isoproterenol (ISO) and/or AICAR treatment. Echocardiography and evaluation of left ventricular haemodynamics were performed 14 d after treatment. The hearts were then harvested. A: the ratio of heart weight (HW) to tibia length (TL); B: fractional shortening (FS) was evaluated by echocardiography; C, D: +dp/dtmaxand left ventricular end-diastolic pressure (LVEDP) were measured by a 1.4-F micromanometer conductance catheter. Mean±SEM.n=6.**P<0．01vscontrol；#P<0．05vsISO group.

圖2 持續(xù)輸注異丙腎上腺素和(或)AICAR對(duì)心臟結(jié)構(gòu)和功能的影響

4 持續(xù)輸注異丙基腎上腺素14 d后并撤泵3 d后，心臟結(jié)構(gòu)和功能的變化

如圖4所示，與持續(xù)輸注ISO 14 d組相類似的，持續(xù)輸注ISO 14 d并撤泵3 d后，心臟重量明顯增加(P<0.05)，而給予AICAR則可明顯抑制ISO引起的心臟肥大(P<0.05)。但與持續(xù)輸注組不同的是，持續(xù)輸注ISO 14 d并撤泵3 d后, 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)FS的變化，與對(duì)照組相比并無明顯改變。而且反映心臟收縮功能的血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)+dp/dtmax在ISO組明顯降低(P<0.05)，提示收縮功能下降。而ISO+AICAR組與ISO組相比，則有增加+dp/dtmax的趨勢(shì)。反映心臟舒張功能的LVEDP在ISO組明顯升高(P<0.05)，提示舒張功能明顯降低。而ISO+AICAR組與ISO組相比，則顯著改善了ISO引起的舒張功能異常，并逆轉(zhuǎn)至正常水平(P<0.05)。

5 異丙基腎上腺素增加AMPK活性的時(shí)間曲線

如圖5所示，給予ISO后5 min, AMPK的磷酸化水平即顯著升高(P<0.05)，并持續(xù)升高至10 min。但給予ISO后30 min，AMPK的磷酸化水平即明顯下降，與對(duì)照組相比無明顯差異。此后多個(gè)時(shí)點(diǎn)(2 h、6 h、12 h、24 h、3 d、7 d和14 d)AMPK的磷酸化水平與對(duì)照組相比均無明顯差異，提示小鼠皮下注射ISO僅引起短暫AMPK活性的增加。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)給予ISO后，小鼠心率也是在5 min開始升高，10 min時(shí)最大，然后迅速下降，在30 min時(shí)降至正常水平。這一結(jié)果提示，給予ISO后，AMPK活性的增加和心率的增加模式是一致的。

Figure 3.The changes of AMPK activity in the hearts of the mice with sustained infusion of ISO and then ceased infusion for 3 d. Heart tissues were harvested after removal of minipump for 3 d. Mean±SEM.n=5～6.*P<0.05vscontrol.

圖3 持續(xù)輸注異丙腎上腺素14 d后再撤去輸注泵3 d，心臟AMPK活性的變化

討 論

心臟AMPK在心肌缺血缺氧或是運(yùn)動(dòng)之后都是代償性升高，從而促進(jìn)心肌脂肪酸攝取和氧化，加速葡萄糖攝取，刺激糖酵解，增加ATP 生成，以滿足心臟能量需求。我們和其他實(shí)驗(yàn)室既往研究發(fā)現(xiàn)，給予小鼠或大鼠每日皮下或腹腔注射ISO 2周或1周后，心臟的AMPK活性是不變或降低的[7,9]。然而本研究發(fā)現(xiàn)給予小鼠持續(xù)輸注ISO 2周，心臟AMPK活性是明顯升高的，而且給予AMPK激動(dòng)劑AICAR并不能進(jìn)一步增加AMPK活性。提示ISO不同給藥模式對(duì)心臟AMPK活性的影響是不一樣的。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)給予ISO后，小鼠心臟AMPK活性出現(xiàn)一過性升高，隨后很快下降，其變化模式與心率變化模式一致。由此我們推測(cè)，心臟AMPK活性的升高是由于ISO引起的正性變時(shí)變力效應(yīng)導(dǎo)致。β-腎上腺素受體激動(dòng)會(huì)導(dǎo)致心臟收縮力增強(qiáng)，心率加快，心肌耗氧量會(huì)增加，與運(yùn)動(dòng)等刺激因素類似，會(huì)代償性激活A(yù)MPK，以滿足心臟能量需求。由于ISO引起的正性變時(shí)變力效應(yīng)是一過性的，AMPK活性的升高也是一過性的，因此對(duì)于每日注射ISO和撤去輸注泵后的動(dòng)物模型，心臟AMPK活性是不變甚至是降低的。而對(duì)于皮下埋泵持續(xù)輸注ISO的動(dòng)物模型，由于ISO以及它的正性變時(shí)變力效應(yīng)持續(xù)存在，因此心臟AMPK活性是持續(xù)升高的。值得注意的是，在本研究的2種ISO動(dòng)物模型中，預(yù)先給予AICAR并不進(jìn)一步增加心臟AMPK活性。相反，在持續(xù)輸注ISO的動(dòng)物模型中，預(yù)先給予AICAR有降低心臟AMPK活性的趨勢(shì)。AICAR在細(xì)胞內(nèi)可轉(zhuǎn)化成ZMP，后者是AMP的類似物，可模擬AMP從而激活A(yù)MPK。根據(jù)本研究結(jié)果，預(yù)先給予AICAR有可能阻礙了持續(xù)輸注ISO引起的內(nèi)源性AMPK激活通路。就心臟AMPK活性而言，AICAR和ISO之間存在拮抗作用。而在我們既往研究中發(fā)現(xiàn)，游泳運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練仍可增加ISO動(dòng)物模型心臟AMPK活性[7]。因此，從增加心臟AMPK活性角度而言，在ISO動(dòng)物模型中，運(yùn)動(dòng)比AMPK激動(dòng)劑AICAR更具優(yōu)勢(shì)。

Figure 4.The cardiac structure and function in the mice with sustained infusion of isoproterenol (ISO) and/or AICAR treatment and then ceased ISO infusion for 3 d. Echocardiography and evaluation of left ventricular hemodynamics were then performed and the hearts were harvested after removal of minipump for 3 d. A: the ratio of heart weight (HW) to tibia length (TL); B: fractional shortening (FS) was evaluated by echocardiography; C, D: +dp/dtmaxand left ventricular end-diastolic pressure (LVEDP) were measured by a 1.4-F micromanometer conductance catheter. Mean±SEM.n=5.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0．05vsISO group.

圖4 撤去異丙基腎上腺素輸注泵3 d后觀察心臟結(jié)構(gòu)和功能的變化

Figure 5. The time course of cardiac p-AMPK level and heart rate upon ISO stimulation. A: Western blot analysis and quantification of p-AMPK at the indicated time points upon ISO stimulation; B: heat rates and p-AMPK levels at the indicated time points upon ISO stimulation. Mean±SEM.n=4～6.**P<0.01vscontrol group.

圖5 異丙基腎上腺素刺激后心臟AMPK磷酸化水平和心率的變化時(shí)間曲線

ISO不同給藥模式不但對(duì)AMPK活性的影響不同，對(duì)心臟結(jié)構(gòu)和功能的影響也是不一樣的。既往我們研究比較了每日皮下注射ISO和埋泵持續(xù)輸注ISO兩種小鼠動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)雖然2種模型都可以導(dǎo)致類似程度的心肌肥厚，但是每日皮下注射ISO模型中，心臟纖維化、心臟收縮與舒張功能的損傷，均比埋泵持續(xù)輸注ISO模型更重[10]。其可能機(jī)制是由于每日皮下注射ISO模型中，心臟產(chǎn)生更多的促纖維化因子，包括結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor，CTGF)和NADPH氧化酶4(NADPH oxidase 4，NOX4)[10]。另一方面，我們近期研究發(fā)現(xiàn)，游泳訓(xùn)練可以通過激活A(yù)MPK抑制ISO引起的NOX4表達(dá)和ROS產(chǎn)生，進(jìn)而抑制ISO引起的心臟纖維化[7]。結(jié)合本研究結(jié)果，我們推測(cè)埋泵持續(xù)輸注ISO模型心臟纖維化與功能損傷較輕的原因可能是心臟AMPK在該模型中持續(xù)激活從而發(fā)揮了一定程度的心臟保護(hù)作用。

事實(shí)上，不但不同的給藥模式會(huì)影響心臟AMPK活性，不同的病理模型對(duì)心臟AMPK活性的影響也并不相同。主動(dòng)脈縮窄導(dǎo)致的心臟壓力負(fù)荷模型可以升高心臟AMPK活性[5]，但是在自發(fā)性高血壓大鼠中，心臟AMPK活性是降低的[11]。而即便心臟AMPK活性代償性升高，AMPK激動(dòng)劑AICAR或白藜蘆醇均能抑制主動(dòng)脈縮窄引起的心臟肥大[12-13]。與之相類似的，在本研究的2種ISO給藥模型中，AICAR均能抑制ISO引起的心臟重量增加。但是由于β-腎上腺素受體持續(xù)激動(dòng)使心臟功能代償性升高，無法看出AICAR對(duì)心功能的改善作用。只有在撤泵后3 d的模型中，由于ISO導(dǎo)致心臟收縮功能與舒張功能均下降，AICAR才表現(xiàn)出明顯的改善心功能的作用。另一方面，在ISO持續(xù)輸注模型中，AICAR并不進(jìn)一步改善心功能的可能原因是AICAR并不進(jìn)一步增加ISO引起的心臟AMPK活性增加，反而有抑制AMPK活性的趨勢(shì)。在撤泵后3 d的模型中，AICAR有增加ISO模型中心臟AMPK活性的趨勢(shì)，而這可能是AICAR在該模型中改善心功能的另一原因。

綜上所述，β-腎上腺素受體持續(xù)激動(dòng)使AMPK活性持續(xù)升高，排除β-腎上腺素受體激動(dòng)的正性肌力作用這一因素后，AMPK活性則降至對(duì)照水平。AMPK激動(dòng)劑可抑制β-腎上腺素受體持續(xù)激動(dòng)引起的心臟重量增加，但觀察AMPK激動(dòng)劑對(duì)心臟功能的改善作用需排除β-腎上腺素受體激動(dòng)的正性肌力作用以及2種藥物的相互作用(β-腎上腺素受體激動(dòng)劑與AMPK激動(dòng)劑)。因此，利用β-腎上腺素受體激動(dòng)的心臟病理模型研究AMPK的心臟保護(hù)作用，應(yīng)選擇無正性變時(shí)變力效應(yīng)的模型。另一方面，我們這一結(jié)果還提示在急性應(yīng)激狀態(tài)下，交感神經(jīng)的激活可以激活A(yù)MPK發(fā)揮心臟保護(hù)作用；但是在長(zhǎng)期慢性交感神經(jīng)過度激活的情況下，一旦β-腎上腺素受體由于減敏等原因無法維持正性變時(shí)變力效應(yīng)，AMPK活性則不再增加，從而喪失其保護(hù)作用。而AMPK激動(dòng)劑有可能拮抗正性變時(shí)變力效應(yīng)引起的AMPK活性增加，因此相比較藥物而言，運(yùn)動(dòng)可能為更合適的干預(yù)方式用以增加AMPK活性，改善心臟功能。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Distinct effects of different β-adrenoceptor stimulation patterns on car-diac AMP-activated protein kinase activity

XIAO Han, MA Xiao-wei, FU Yong-nan, ZHANG You-yi, Lü Zhi-zhen

(InstituteofVascularMedicine,PekingUniversityThirdHospital,KeyLaboratoryofCardiovascularMolecularBiologyandRegulatoryPeptides,MinistryofHealth,KeyLaboratoryofMolecularCardiovascularSciences,MinistryofEducationandBeijingKeyLaboratoryofCardiovascularReceptorsResearch,Beijing100191,China.E-mail:zzlu@bjmu.edu.cn)

AIM: To investigate the cardiac AMP-activated protein kinase (AMPK) activity and the effects of AMPK activator on cardiac structure and function in the mice with different β-adrenoceptor (β-AR) stimulation patterns. METHODS: Male BALB/c mice were subcutaneously injected with AMPK activator (AICAR, 250 mg· kg-1·d-1) or saline, and infused with β-AR agonist isoproterenol (ISO, 5 mg·kg-1·d-1) for 14 d. The cardiac functions were evaluated by echocardiography or hemodynamic method, and the hearts were harvested after infusion cessation immediately or 3 d later. Phosphorylated AMPK (p-AMPK) was measured by Western blot. RESULTS: Sustained ISO infusion increased p-AMPK level. AICAR did not further increase p-AMPK but attenuated ISO-induced increase in heart weight. Sustained ISO infusion increased cardiac systolic function as indicated by left ventricular fractional shortening (FS) and maximum rate of pressure rise (+dp/dtmax). The cardiac systolic function was not further increased by AICAR. The cardiac diastolic function as indicated by left ventricular end-diastolic pressure (LVEDP) was not different in each group. In contrast, cardiac p-AMPK level was similar between the control mice and the mice with sustained ISO infusion and ceased infusion for 3 d. In this model, AICAR improved the cardiac systolic and diastolic functions, which were impaired by ISO. Moreover, the increased pattern of p-AMPK level was similar with that of heart rate upon ISO stimulation. CONCLUSION: Sustained ISO infusion increases p-AMPK. After ISO infusion cessation for 3 d, p-AMPK is decreased to the basal level. β-AR-induced inotropic effects should be avoided to investigate the cardioprotective role of AMPK activation in the β-AR stimulation models. [KEY WORDS] β-Adrenoceptor; AMP-activated protein kinase; Isoproterenol

1000- 4718(2016)12- 2177- 07

2016- 09- 06

2016- 10- 21

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81300067； No.81530009)

R363.2; R541.6

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.12.009

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