Am80抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管新生內(nèi)膜形成的機(jī)制研究*

王 瑩， 呂心瑞

(河南大學(xué) 1第一附屬醫(yī)院， 2醫(yī)學(xué)院生理教研室， 河南 開(kāi)封 475004)

Am80抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管新生內(nèi)膜形成的機(jī)制研究*

王 瑩1， 呂心瑞2△

(河南大學(xué)1第一附屬醫(yī)院，2醫(yī)學(xué)院生理教研室， 河南 開(kāi)封 475004)

目的： 探討維甲酸衍生物Am80抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和大鼠頸總動(dòng)脈內(nèi)皮剝脫術(shù)后新生內(nèi)膜增生的機(jī)制。方法:用不同濃度Am80處理EA-hy926細(xì)胞24 h后，應(yīng)用細(xì)胞計(jì)數(shù)和MTS細(xì)胞活力分析檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況；將Am80處理的細(xì)胞進(jìn)行PI染色，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期的變化情況；通過(guò)real-time PCR方法分析Am80處理后EA-hy926細(xì)胞中cyclinB1、P21和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2表達(dá)的變化；制備SD大鼠頸總動(dòng)脈內(nèi)皮球囊損傷模型，通過(guò)HE和免疫組化染色方法，觀察Am80對(duì)球囊損傷后新生內(nèi)膜形成的影響。結(jié)果:細(xì)胞計(jì)數(shù)和MTS細(xì)胞活力分析結(jié)果顯示，Am80以濃度依賴(lài)性方式抑制EA-hy926血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖；流式細(xì)胞分析顯示，Am80可使EA-hy926細(xì)胞周期停滯在G2/S期；real-time PCR結(jié)果表明，Am80處理后，EA-hy926細(xì)胞中P21表達(dá)上調(diào)，cyclinB1和MMP-2表達(dá)水平降低；內(nèi)皮損傷動(dòng)物模型結(jié)果顯示，Am80處理后新生內(nèi)膜的形成受到顯著抑制。結(jié)論:Am80可通過(guò)促進(jìn)P21而抑制cyclinB1表達(dá)，從而抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管新生內(nèi)膜的形成。

Am80; 血管內(nèi)皮細(xì)胞； 內(nèi)膜增生； 細(xì)胞周期

血管內(nèi)膜損傷是動(dòng)脈粥樣硬化、血管術(shù)后再狹窄等心血管疾病的主要病理因素。血管內(nèi)皮細(xì)胞異常增殖常常發(fā)生在血管損傷之后，內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移能力的增強(qiáng)，常常又是引起高血壓等血管增殖性疾病的主要病理基礎(chǔ)。所以抑制血管內(nèi)膜異常增生是預(yù)防和扭轉(zhuǎn)心血管疾病的根本措施之一。Am80是一種人工合成的維甲酸衍生物，是維甲酸受體α的激動(dòng)劑，已經(jīng)在臨床上用于治療急性早幼粒細(xì)胞性白血病[1]。新的研究證明，Am80也可以通過(guò)激活其它的分子通路，促進(jìn)其抗增殖、促分化的生物功能[2-4]。在心血管組織中，Am80能誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞分化并抑制其增殖和遷移，有效抑制大鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型中血管內(nèi)膜的增生[5-7]。在前期研究中，我們已經(jīng)揭示了Am80可以通過(guò)提高核轉(zhuǎn)錄因子Krüppel樣因子4(Krüppel-like factor 4, KLF4)的表達(dá)水平，抑制血管平滑肌的遷移和異常增生[8]。但對(duì)于Am80如何抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，通過(guò)什么通路抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖的則知之甚少。本研究主要通過(guò)Am80對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖及對(duì)大鼠頸總動(dòng)脈球囊損傷模型中內(nèi)膜增生的研究，揭示了Am80在抗細(xì)胞增殖和周期蛋白的調(diào)控上抑制血管內(nèi)膜增殖的分子機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞株和試劑

兔抗cyclinB1和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)-2多克隆抗體購(gòu)自Abcam；Am80和Tween-80購(gòu)自Sigma；碘化丙啶(propidium iodide，PI)購(gòu)自Beckman；MTS試劑盒購(gòu)自Promega；引物合成來(lái)自上海生工；羊抗兔II抗和DAB試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株EA-hy926購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)于細(xì)胞瓶中，用含10%胎牛血清及1×105U/L青、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液置于37 ℃、5% CO2、相對(duì)濕度90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期換液傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 細(xì)胞計(jì)數(shù) 細(xì)胞接種于96孔板，每孔加入100 μL，細(xì)胞濃度為2×107/L，于37 ℃、5% CO2、相對(duì)濕度90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，加入不同濃度的Am80培養(yǎng)24 h。取10 μL細(xì)胞懸液與0.2%臺(tái)盼藍(lán)溶液混合染色至計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)。

2.3 MTS實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力 采用CellTiter 96? AQueous 單溶液細(xì)胞活力試劑盒(Promega)，按說(shuō)明書(shū)流程操作，用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀調(diào)整細(xì)胞濃度為為2×107/L，在 96孔板中每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)一段時(shí)間后，每孔加入20 μL MTS試劑于培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h，終止反應(yīng)，應(yīng)用全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)其490 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)值。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期EA-hy926細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度Am80作用于細(xì)胞24 h，收集各孔細(xì)胞及上清，離心棄上清，用冷PBS洗2次，調(diào)整各孔細(xì)胞數(shù)量為1×106，加入預(yù)冷的70%乙醇固定細(xì)胞，4 ℃過(guò)夜。離心收集細(xì)胞，PBS洗過(guò)后，加入含50 mg/L PI、100 mg/L RNaseA、0.2% Triton X-100工作液500 μL，孵育15 min后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。重復(fù)3次。

2.5 Real-time PCR實(shí)驗(yàn) 采用TRIzol總RNA提取試劑(Invitrogen)提取細(xì)胞總RNA，以O(shè)ligo(dT)18為引物，按照M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)(Promega)操作進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。得到的cDNA按SYBR Green PCR Master Mix試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。 P21的上游引物序列為5’-CTTCATCTCTCGGTCCCTTC-3’，下游引物序列為5’-CGGGTTACTCCTTCTGTTGT-3’；cyclinB1的上游引物序列為5’-AGGGCTGCCACGGACCGAGT-3’，下游引物序列為5’-CTGGCACCGGGAGGGCACTT-3’；MMP-2的上游引物序列為5’-AGACCCCGGAGGCTAAGGAGTT-3’，下游引物序列為5’-TCCGTCATAGTGTCCTCCATCA-3’；GAPDH的上游引物序列為5’-CAGCCCAGAACATCATCCCT-3’，下游引物序列為5’-GCCTCTCTCTTGCTCTCAGTA-3’。每個(gè)PCR反應(yīng)體系包括為2 μL稀釋的RT產(chǎn)物、10 μL SYBR Green PCR Master Mix以及250 nmol/L上、下游引物，總反應(yīng)體積為20 μL，經(jīng)ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)檢測(cè)，反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為：95 ℃ 5 s、60 ℃ 35 s，共40個(gè)循環(huán)。基因的表達(dá)變化用2-ΔΔCt法計(jì)算，以GAPDH mRNA的水平作為內(nèi)參照。

2.6 頸總動(dòng)脈內(nèi)皮損傷動(dòng)物模型的復(fù)制 參照之前的手術(shù)方法[5]，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用25%烏拉坦 (3 mL/kg) 腹腔注射麻醉，常規(guī)消毒，從頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端結(jié)扎，將頸內(nèi)動(dòng)脈和頸總動(dòng)脈近心端用血管夾關(guān)閉血流，于頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端扎線部位的內(nèi)側(cè)剪一楔形切口，球囊導(dǎo)管自切口處向近心端插入，打開(kāi)血管夾，導(dǎo)管穿過(guò)頸總動(dòng)脈至主動(dòng)脈分支處。注入約100 μL生理鹽水充盈球囊，然后將球囊拖回到切口處，其間以導(dǎo)絲為軸線旋轉(zhuǎn)球囊。如此反復(fù)3次，退出球囊，關(guān)閉切口，恢復(fù)血流。體重 250～300 g的雄性SD大鼠隨機(jī)分為3組，分別為假手術(shù)(sham)組、損傷(injured)組、Am80組。Am80組大鼠于術(shù)前1 d至術(shù)后28 d進(jìn)行1 mg·kg-1·d-1灌胃給藥，其它組大鼠以同樣方式給予相同劑量的Tween-80，實(shí)驗(yàn)期間給予普通飼料飲食，自由進(jìn)食進(jìn)水，于術(shù)后28 d從股動(dòng)脈放血處死動(dòng)物，迅速分離左側(cè)頸總動(dòng)脈和對(duì)側(cè)血管用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.7 血管HE染色觀察 切片常規(guī)脫蠟至水，蘇木精染色5 min；自來(lái)水沖洗返藍(lán)5 min，1% 鹽酸乙醇稍分化數(shù)秒，自來(lái)水沖洗5 min；伊紅染色10 s；常規(guī)梯度乙醇脫水，即依次放入70%、80%、90%、95%的乙醇3 s 和無(wú)水乙醇中3 min、3次，二甲苯透明3 min、3次；中性樹(shù)膠封片；鏡下觀察、照相，進(jìn)行圖像學(xué)分析。

2.8 血管免疫組化觀察 切片常規(guī)脫蠟至水，抗原修復(fù)后，滴加3% H2O2去離子水，室溫孵育10 min；消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶影響，滴加正常山羊血清工作液，室溫孵育15 min進(jìn)行封閉；傾去血清，滴加兔抗cyclinB1多克隆抗體(1∶100)；片子平放保濕盒中4 ℃過(guò)夜后，滴加生物素化 II 抗工作液，室溫孵育15 min；滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育15 min；滴加DAB試劑顯色，顯微鏡下控制顯色時(shí)間，自來(lái)水沖洗終止反應(yīng)；蘇木精復(fù)染細(xì)胞核；常規(guī)脫水、透明、封片；鏡下觀察、照相，進(jìn)行圖像學(xué)分析。

2.9 血管組織總蛋白的提取 分離大鼠頸總動(dòng)脈，于冷PBS中洗凈血液，去除血管外結(jié)締組織，將血管剪碎后置勻漿套管中，100 mg 組織加入1 mL RIPA裂解液，冰浴勻漿。勻漿后靜置30 min。4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清 (即蛋白提取液)，分裝儲(chǔ)存于-80 ℃?zhèn)溆谩?以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，用改 良的Lowry 法進(jìn)行蛋白定量。

2.10 Western blot分析 灌制 8%分離膠和5%濃縮膠。用微量加樣器將樣品加入到凝膠加樣孔內(nèi)。 90 V穩(wěn)壓電泳約30 min，待溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后，換用120 V 穩(wěn)壓電泳，至溴酚藍(lán)前緣移動(dòng)到距凝膠底部0.5 mm，停止電泳，取出凝膠，進(jìn)行半干轉(zhuǎn)膜，然后取出PVDF膜，置于含5%脫脂奶粉的封閉液中，室溫封閉 2 h。 將封閉后的PVDF膜置入用TBST以適當(dāng)比例稀釋的I抗溶液中，4 ℃緩慢搖動(dòng)過(guò)夜。室溫洗膜，然后將PVDF膜置入用TBST 1∶20 000稀釋RDye～800CW 熒光標(biāo)記II抗溶液中，于室溫反應(yīng)1 h, 室溫洗膜后用Odyssey發(fā)光。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。均數(shù)先進(jìn)行單因素方差分析，然后用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)行各組均數(shù)間兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Am80抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖

細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)顯示，Am80不同濃度刺激EA-hy926細(xì)胞24 h后，細(xì)胞數(shù)量隨濃度增加逐漸減少；而且MTT分析結(jié)果也顯示，Am80刺激EA-hy926細(xì)胞后，細(xì)胞活力隨濃度逐漸下降，這一結(jié)果與細(xì)胞周期數(shù)據(jù)分析具有一致性，見(jiàn)圖1。

Figure 1.Am80 inhibited the proliferation of EA-hy926 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group.

圖1 Am80 抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖

2 Am80阻滯血管內(nèi)皮細(xì)胞周期進(jìn)程和抑制周期蛋白的表達(dá)

用不同濃度的Am80刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞24 h后發(fā)現(xiàn)，Am80可使內(nèi)皮細(xì)胞周期停滯在G2/S期(P<0.05)，說(shuō)明Am80可誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯。為了探討 Am80 誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯的作用機(jī)制，我們選用不同濃度Am80刺激EA-hy926細(xì)胞24 h和濃度為4 μmol/L的Am80刺激EA-hy926細(xì)胞不同時(shí)點(diǎn)后，提取細(xì)胞總RNA，通過(guò)real-time PCR方法檢測(cè)細(xì)胞周期抑制蛋白 P21和細(xì)胞周期蛋白cyclinB1以及MMP-2 mRNA的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，在Am80 濃度為 0～4 μmol/L范圍內(nèi)，P21 的mRNA表達(dá)水平呈劑量依賴(lài)性升高，而cyclinB1和MMP-2的mRNA表達(dá)水平呈劑量依賴(lài)性降低；P21的mRNA表達(dá)水平呈時(shí)間依賴(lài)性升高，而cyclinB1和MMP-2的mRNA表達(dá)水平呈時(shí)間依賴(lài)性降低。見(jiàn)圖2。

3 Am80顯著抑制血管新生內(nèi)膜增生

大鼠球囊內(nèi)皮剝脫后28 d的損傷組頸總動(dòng)脈中的內(nèi)膜明顯增生，呈彌散性增厚，管腔變小，內(nèi)膜與中膜的厚度比值(I/M比值)，明顯高于對(duì)照組；Am80組新生內(nèi)膜的增生程度和 I/M 比值明顯小于模型組(P<0.05)。以上結(jié)果顯示，Am80 可以明顯抑制球囊損傷誘導(dǎo)的血管內(nèi)增生，見(jiàn)圖3。

Figure 2.The effects of Am80 on the cell cycles and the mRNA expression of P21, cyclinB1 and MMP-2 in EA-hy926 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group;#P<0.05vs0 h.

圖2 Am80 阻滯血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞周期進(jìn)程和抑制周期蛋白mRNA的表達(dá)

Figure 3.Inhibitory effects of Am80 on intimal hyperplasia of carotid arteries after balloon injury. I/M： intima/tunicae media. Mean±SD.n=6.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsinjuried group.

圖3 Am80 抑制球囊損傷誘導(dǎo)的血管內(nèi)膜增生

4 Am80抑制血管內(nèi)膜中cyclinB1和 MMP-2蛋白的表達(dá)，促進(jìn)P21蛋白的表達(dá)

免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，棕黃色顆粒光密度明顯增強(qiáng)，球囊損傷組新生內(nèi)膜中cyclinB1的蛋白表達(dá)明顯增多；而Am80組中，cyclinB1的表達(dá)與損傷模型組比較明顯減少。而且在Western blot的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，Am80可以抑制cyclinB1和MMP-2的表達(dá)，但促進(jìn)P21蛋白的表達(dá)。提示Am80可以通過(guò)抑制cyclinB1的蛋白表達(dá)而促進(jìn)P21的表達(dá),進(jìn)而抑制細(xì)胞周期，見(jiàn)圖4。

Figure 4.The protein expression (n=6) of cyclinB1, MMP-2 and P21 in the carotid arteries on day 28 after balloon injury and immunohistochemistry staining (n=3) of cyclinB1 in the carotid arteries (×200). Mean±SD.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsinjuried group.

圖4 各組中cyclinB1、MMP-2和P21的蛋白表達(dá)以及免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

討 論

血管內(nèi)膜的異常增殖是許多血管增殖性疾病如高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動(dòng)脈成形術(shù)術(shù)后再狹窄、血管移植術(shù)后新生內(nèi)膜形成等發(fā)生發(fā)展的重要的細(xì)胞病理學(xué)基礎(chǔ)。血管內(nèi)膜的異常增殖主要是血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞異常增生所致。所以，了解血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞異常增生的分子機(jī)制對(duì)防治血管增殖性疾病非常重要。

維甲酸衍生物Am80是RARα的特異性激動(dòng)劑。研究表明，Am80通過(guò)RARα能誘導(dǎo)細(xì)胞的分化[9]，同時(shí)，Am80也可以不通過(guò)RARα而通過(guò)其它通路來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞的分化[2,10]。我們前期的研究也顯示，Am80可通過(guò)促進(jìn)KLF4與RARα的相互作用而阻止血管新生內(nèi)膜形成。但是對(duì)Am80通過(guò)什么通路、如何抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的分子機(jī)制知之甚少。細(xì)胞的異常增生可導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生，維持細(xì)胞數(shù)目的穩(wěn)態(tài)需要維持增殖和凋亡平衡，而增殖和凋亡的作用均依賴(lài)于細(xì)胞周期。P21作為細(xì)胞周期的負(fù)調(diào)控因子,與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。P21是細(xì)胞周期蛋白激酶抑制因子，P21不僅可直接抑制細(xì)胞周期蛋白激酶的活化，而且還能與DNA聚合酶σ的輔助因子增殖細(xì)胞核抗原結(jié)合，直接抑制DNA合成[11-12]。新的研究表明，P21與CK2蛋白相互作用影響組蛋白去乙酰化酶2的乙酰化從而通過(guò)調(diào)控KLF4的乙酰化水平，進(jìn)而抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖[13]。而且在P21啟動(dòng)子的核心序列-150 bp內(nèi)有GKLF家族結(jié)合的DNA序列，我們前期的研究已經(jīng)證實(shí)，Am80可以促進(jìn)核轉(zhuǎn)錄因子KLF4與RARα的相互作用從而抑制血管內(nèi)膜的增生，從而我們推測(cè)，Am80也可能通過(guò)促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子KLF4在P21啟動(dòng)子上與GKLF結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，從而促進(jìn)P21的轉(zhuǎn)錄活性。在本研究中我們證實(shí)了Am80的抗增殖活性，而且也發(fā)現(xiàn)Am80可促進(jìn)P21的表達(dá)，這可能是其阻滯細(xì)胞周期調(diào)控的機(jī)制之一。

CyclinB1是第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞周期蛋白，研究表明，cyclinB1主要參與細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)的調(diào)控，并維持基因組的穩(wěn)定性[14]。而且在細(xì)胞周期進(jìn)程中，cyclinB1的mRNA水平與蛋白水平呈平行變化，也就是說(shuō)，細(xì)胞周期不同階段的轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白可以結(jié)合于其啟動(dòng)子的不同區(qū)域，從而調(diào)控細(xì)胞周期不同時(shí)期的轉(zhuǎn)換。而且研究表明，過(guò)表達(dá)cyclinB1能促進(jìn)細(xì)胞周期中G2/M期的轉(zhuǎn)換，甚至導(dǎo)致細(xì)胞增生的失控或者惡化[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，給予內(nèi)皮細(xì)胞Am80刺激后，cyclinB1的表達(dá)水平明顯呈時(shí)間和濃度依賴(lài)方式下降，而且流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布時(shí)也發(fā)現(xiàn)，給予Am80刺激24 h后，細(xì)胞周期停滯在G2/S期，以上結(jié)果也表明了，Am80通過(guò)降低內(nèi)皮細(xì)胞中cyclinB1的表達(dá)，從而影響了內(nèi)皮細(xì)胞中G2/S期的轉(zhuǎn)換，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖。通過(guò)體內(nèi)動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)我們也證實(shí)了Am80可以通過(guò)降低血管內(nèi)膜中cyclinB1的表達(dá)而抑制血管內(nèi)膜的增生。MMP-2以無(wú)活性的酶原形式存在，一旦被激活后，可以水解許多細(xì)胞外基質(zhì)成分，從而促進(jìn)細(xì)胞的遷移。在本研究中，Am80刺激可抑制MMP-2的表達(dá)。

通過(guò)本研究，我們證實(shí)了Am80可以在正常血管內(nèi)皮細(xì)胞中通過(guò)提高P21蛋白而抑制cyclinB1蛋白的表達(dá)，從而間接使內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯在G2/S期中，進(jìn)而減少了內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)目的增多并抑制了球囊損傷造成的血管內(nèi)膜的異常增殖。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 余小慧)

Inhibitory effects of Am80 on proliferation in vascular endothelial cells and neointima hyperplasia of carotid arteries

WANG Ying1, Lü Xin-rui2

(1TheFirstAffiliatedHospital,2DepartmentofPhysiology,MedicalCollege,HenanUniversity,Kaifeng475004,China.E-mail:lvxinrui@126.com)

AIM: To explore the inhibitory effects of Am80 on the proliferation in the vascular endothelial cells (VECs) and neointima hyperplasia of the carotid arteries after balloon injury in the rats. METHODS: The proliferation of EA-hy926 cells were detected by cell counting and MTS assay after the cells were treated with various doses of Am80 for 24 h. The cell cycle was analyzed by flow cytometry after the cells were stained with PI. The mRNA expression of cyclinB1, P21 and matrix metalloproteinase (MMP)-2 in the EA-Hy926 cells was detected by real-time PCR. The changes of neointima hyperplasia in the carotid arteries were observed under microscope with hemotoxylin and eosin (HE) staining, and the expression of cyclinB1 was examined by the method of immunohistochemistry. RESULTS: The proliferation of EA-Hy926 cells was obviously inhibited in a dose-dependent manner when the cells were treated with various doses of Am80 for 24 h. The cell cycle was arrested at G2/S stage in response to Am80 treatment. The mRNA expression of P21 was increased, however, the mRNA expression of cyclinB1 and MMP-2 was decreased when the cells were treated with Am80 at 4 μmol/L for various times. In addition, thevivoexperiment demonstrated that Am80 not only significantly reduced neointimal hyperplasia and the thickness ratio of intima to tunicae media compared with injured group, but also inhibited cyclinB1 expression in the carotid arteries. CONCLUSION: Am80 inhibits the proliferation of VECs and neointima hyperplasia in the carotid arteries after balloon injury by promoting P21 expression and decreasing cyclinB1 expression.

Am80; Vascular endothelial cells; Neointima hyperplasia; Cell cycle

1000- 4718(2016)12- 2205- 06

2016- 08- 17

2016- 11- 03

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. U1404310; No. 81600940)；河南大學(xué)博士啟動(dòng)基金(No. B2013043)

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.12.013

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△通訊作者 Tel: 0371-23880585； E-mail: lvxinrui@126.com