黃酒對同型半胱氨酸誘導的內皮祖細胞功能障礙的影響*

蔣承建， 潘孫雷， 郭 艷， 孟立平， 周昌鉆， 池菊芳， 翟小亞， 郭航遠

(浙江大學紹興醫院心內科，浙江 紹興 312000)

黃酒對同型半胱氨酸誘導的內皮祖細胞功能障礙的影響*

蔣承建， 潘孫雷， 郭 艷， 孟立平， 周昌鉆， 池菊芳， 翟小亞， 郭航遠△

(浙江大學紹興醫院心內科，浙江 紹興 312000)

目的： 探索同型半胱氨酸(Hcy)誘導的內皮祖細胞(EPCs)的功能障礙能否被黃酒所逆轉。方法：密度梯度離心法從大鼠骨髓細胞懸液中獲取單個核細胞，將其接種在人纖維連接蛋白包被的培養板，誘導單個核細胞向EPCs分化，孵箱中培養7 d后，收集貼壁細胞用于實驗。激光共聚焦顯微鏡鑒定DiI-ac-LDL和FITC-UEA-I雙染色陽性細胞被認定是正在分化的EPCs。上述細胞培養24 h后收集樣品，采用MTT比色法、Transwell小室、凋亡試劑盒和體外血管生成試劑盒分別觀察EPCs的活力、遷移能力、凋亡和體外血管生成能力。結果：與對照組相比，Hcy干預下EPCs的活力、遷移和體外血管生成能力均顯著減弱(P<0.01)；黃酒或紅酒的干預則能明顯改善Hcy對EPCs上述功能的影響(P<0.01)；進一步與對照組比較后，發現黃酒或紅酒的干預還能使EPCs的活力、遷移和體外血管生成能力較對照組也有明顯改善(P<0.05)；乙醇組EPCs的上述功能較Hcy組沒有明顯的變化。各組對EPCs的凋亡沒有影響。結論：Hcy能顯著減弱EPCs的活力、遷移能力和體外血管生成能力，小劑量的黃酒能改善EPCs的上述功能。

黃酒； 動脈粥樣硬化； 內皮祖細胞； 同型半胱氨酸

當前，冠心病已成為我國的主要慢性病之一，且其患病率和死亡率呈明顯上升趨勢，嚴重危害著人民群眾的身體健康[1]。動脈粥樣硬化是冠心病病變血管的主要病理改變，而血管內皮功能障礙是動脈粥樣硬化的重要始動因素之一，并在其發展過程發揮了關鍵作用[2]。內皮功能障礙的本質是內皮損傷和修復之間動態平衡的破壞, 而內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是一類能增殖并分化為血管內皮的前體細胞，在內皮損傷后的修復中起重要作用[3-4]。新近研究證實血漿同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)水平升高也是冠心病一個獨立危險因素。高Hcy參與冠心病發病的多個環節, 機制十分復雜, 其中內皮功能障礙是高Hcy導致冠心病的中心環節[5]。我們前期通過低密度脂蛋白受體基因缺陷小鼠在體實驗發現黃酒能降低小鼠血漿同型半胱氨酸、抑制血管平滑肌細胞基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)的表達和活性進而明顯改善動脈粥樣斑塊的形成[6-7]，本課題組實驗發現黃酒能抑制Hcy誘導的大鼠血管平滑肌細胞MMP-2的表達和活性[7]。因此我們猜想Hcy誘導下的EPCs功能障礙是否能被黃酒所逆轉，進而抑制動脈粥樣斑塊的進展。

材 料 和 方 法

1 動物和試劑

SD大鼠(8周齡)購自浙江省試驗動物中心；FITC標記的荊豆凝集素(Ulexeuropaeusagglutinin-I，UEA-I)購自Sigma；DiI標記的乙酰化低密度脂蛋白(acetylated low-density lipoprotein, ac-LDL)購自Molecular Probe；抗大鼠vWF-FITC抗體購自Abcam；抗大鼠CD31-APC抗體購自eBioscience；兔抗大鼠CD133抗體購自Proteintech；人纖維連接蛋白、血管內皮生長因子和體外血管形成試劑盒購自Chemicon；血管內皮生長培養基2(endothelial growth medium-2，EGM-2)購自Cambrex；0.25%胰蛋白酶-EDTA和胎牛血清購自Abcam；大鼠淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物；5 μm孔徑Transwell小室購自Corning；酒精度為12%的黃酒和乙醇購自紹興黃酒公司；酒精度為12%的紅葡萄酒購自法國Languedoc-Roussillon；其余試劑為國產分析純。

2 方法

2.1 大鼠EPCs的提取和培養 斷頸法處死SD大鼠，無菌下分離雙側股骨和脛骨，浸泡于體積分數為75%乙醇內5 min取出，剪開長骨兩端，用5 mL注射器吸取D-Hanks液(含體積分數為10%的胎牛血清)沖洗骨髓腔，骨髓懸浮液置于15 mL離心管中，1 000 r/min離心5 min收集細胞沉淀，加入D-Hanks液輕輕吹打，5 mL D-Hanks液充分混勻細胞。取15 mL離心管，將骨髓細胞懸液緩慢疊加于等量的淋巴細胞分離液上層，2 500 r/min離心30 min。獲得單個核細胞，用D-Hanks液洗滌2次，棄上清，加EGM-2完全培養液重懸細胞, 以1×109/L個細胞接種于包被有人纖維連接蛋白的培養皿中，在37 ℃、5% CO2、飽和濕度孵箱中培養，2～3 d更換細胞液。轉移未貼壁細胞至新包被孔中, 補加完全培養液，繼續培養誘導7 d，貼壁細胞供實驗用。

2.2 EPCs的熒光鑒定 選取生長良好的原代細胞與DiI-ac-LDL 一起于37 ℃孵育3 h后, D-Hanks液沖洗，4%多聚甲醛固定20 min，將FITC-UEA-I加于上述樣品于37 ℃繼續孵育1 h。采用多波長激光共聚焦顯微鏡觀察，液相下免疫熒光拍照[8]。

2.3 細胞表面抗原的流式細胞術檢測 晚期EPCs的主要表面抗原有CD31、vWF和CD133，搜集貼壁細胞并計數，將5×105貼壁細胞依次與抗CD31、vWF和CD133的抗體結合，在4 ℃水浴箱作用30 min，最后用D-Hanks液將其制成細胞懸浮液放在流式細胞儀上檢測。

2.4 實驗分組 探索Hcy對EPCs細胞的活性影響，將Hcy濃度分為0 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L、300 μmol/L和400 μmol/L共5組，分別與EPCs共同孵育24 h，然后確定最佳Hcy濃度，結合預實驗結果和人生理功能確定300 μmol/L Hcy對EPCs功能的影響最大，將其共同培養12 h、24 h和48 h，通過MTT法檢測細胞活力，最后選擇實驗濃度。結合前期的預實驗結果，每種酒(0%、0.2%、0.4%、0.8%、1.6%)與300 μmol/L Hcy共同孵育EPCs 24 h，MTT法檢測酒類對細胞活力的影響，確定最佳干預濃度。黃酒和紅酒對EPCs功能影響的實驗分為對照(control)組、Hcy組、Hcy+黃酒組、Hcy+紅酒組和Hcy+乙醇組(5組，各組Hcy濃度為300 μmol/L，最終酒精度為0.4%)。孵育24 h后收集樣品，采用MTT比色法、Transwell小室、凋亡試劑盒和體外血管生成試劑盒分別觀察EPCs的活力、遷移能力、凋亡和體外血管生成能力。

2.5 細胞遷移功能的測定 收集的細胞進行計數，每孔2 mL加入6孔板，各孔中加入配置好的培養基(各組最終酒精濃度0.4%)培養2 d，收集各組細胞，分別計數，無血清培養基重懸各組細胞獲得2.5×108/L細胞懸液，準備24孔板Transwell小室，下室加入600 μL完全培養基，200 μL懸液接種上室，37 ℃培養箱6 h，將小室移入0.1%結晶紫染液，室溫孵育6 h，擦拭上室殘余的結晶紫染液，200倍鏡下觀察下室遷移細胞，隨機計數7個視野。

2.6 細胞活力的檢測 上述方法收集細胞并計數，在37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養箱培養2 d，每孔加入10 μL MTT試劑孵育1 h，酶標儀上450 nm/630 nm雙波長檢測吸光度。

2.7 細胞成管能力檢測 將培養至12 d的EPCs用0.25%胰酶消化收集，細胞計數，以1×108/L細胞量，每孔2 mL接種6孔板，待細胞貼壁后，吸棄培養基，加入配置好的各組培養基(各組最終酒精濃度0.4%)，在37 ℃、5% CO2飽和濕度培養箱中培養2 d，收集各組細胞，分別計數，以3×108/L細胞量接種已鋪好Matrigel膠的96孔板中(每組3個重復)，37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養箱中培養16 h；在100倍鏡下隨機觀察5個視野計數成管管腔個數。

2.8 細胞凋亡功能的測定 如上述方法收集細胞并計數，0.25%胰酶收集各組細胞和上清，離心收集細胞沉淀，PBS沖洗，按照凋亡試劑盒的說明操作，500 μL結合緩沖液重懸，分別加入5 μL Annexin V和10 μL碘化丙啶(propidium iodide，PI)混勻，室溫孵育5 min，然后上機檢測。

3 統計學處理

采用SPSS 18.0統計軟件進行統計學處理。所有數據用均數±標準差(mean±SD)表示。兩組間比較采用t檢驗, 多組間比較用單因素方差分析,組間兩兩比較使用LSD法。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 EPCs的鑒定

使用DiI-ac-LDL和FITC-UEA-I對培養了12 d的EPCs進行染色，細胞吞噬了DiI-ac-LDL在熒光顯微鏡下顯紅色，而吞噬了FITC-UEA-I顯綠色熒光，雙熒光陽性是正在分化的EPCs，見圖1。

Figure 1.Identification of endothelial progenitor cells (EPCs). A representative EPC colony with a central core of round cells surrounded by elongated spindle-shaped cells was observed (×400). A: FITC binding to the surface of EPCs (green, exciting wave-length 488 nm); B: DiI in spindle-shaped adherent EPCs (red, exciting wave-length 555 nm); C: double positive cells appearing yellow in the overlay were identified as differentiating EPCs.

圖1 激光共聚焦顯微鏡鑒定EPCs

2 EPCs的流式細胞術分析

CD133或vWF陽性皆為EPCs,見圖2。

Figure 2.The EPC phenotype was confirmed by demonstrating the expression of stem/progenitor cell surface markers CD133 and vWF, and endothelial cell marker CD31. Because EPCs did not express CD31, endothelial cells were eliminated, and the cells with CD133 positive or vWF positive were EPCs cells.

圖2 細胞的流式細胞術鑒定

3 細胞遷移功能

在Hcy的干預下，不同組別中EPCs的遷移功能較對照組明顯下降(P<0.01)，Hcy+乙醇組對EPCs的遷移功能影響類似于Hcy組。Hcy+黃酒組和Hcy+紅酒組都能明顯改善Hcy誘導的EPCs遷移功能(P<0.01),見圖3。

4 細胞活力的變化

在Hcy的干預下，EPCs的活力較對照組明顯下降(P<0.01)，Hcy+乙醇組較Hcy組的細胞活力也有明顯的下降(P<0.01)，并且Hcy+黃酒組和Hcy+紅酒組都能明顯改善Hcy誘導的EPCs活力(P<0.01)，見圖4。

Figure 3.Migration assay of rat EPCs in response to different kinds of wine. The migratory cells were stained with hematoxylin and counted under a microscope (×200). YW: yellow wine; RW: red wine; Eth: ethanol. Mean±SD.n=5.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;△△P<0.01vsHcy.

圖3 各種酒類對EPCs遷移能力的影響

Figure 4.The viability of rat EPCs in response to different kinds of wine measured by MTT assay. YW: yellow wine; RW: red wine; Eth: ethanol. Mean±SD.n=5.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;△△P<0.01vsHcy.

圖4 各種酒類對大鼠EPCs活力的影響

5 細胞成管能力

在對照組、Hcy組、Hcy+黃酒組、Hcy+紅酒組和Hcy+乙醇組5組中，Hcy組和Hcy+乙醇組較對照組的細胞成管能力明顯下降(P<0.01)，Hcy+黃酒組較Hcy組體外成管能力增強，并且小管的復雜程度較高(P<0.01)，紅酒也表現了升高的趨勢，見圖5。

6 細胞的凋亡水平

對照組與Hcy組EPCs凋亡水平無明顯差異；黃酒組+Hcy組、Hcy+紅酒組和Hcy+乙醇組較Hcy組，EPCs凋亡水平都沒有明顯改善，見圖6。

討 論

EPCs是由造血干細胞分化而來，并能增殖和分化為成熟內皮細胞，但尚未表達成熟血管內皮表型，也未形成血管的前體細胞，在骨髓、脾臟和外周血都能分離到。Murayama等[8]研究發現，EPCs不僅參與血管的形成，同時也參與內皮損傷后的修復，新生血管中25%內皮細胞是由EPCs分化而來。動脈粥樣硬化是冠心病病變血管的主要病理改變，而血管內皮功能障礙是動脈粥樣硬化始動因素之一，并在其發展過程中發揮了關鍵作用[2]。內皮功能障礙的本質是內皮損傷和修復之間的動態平衡受到破壞[3]，而近來研究顯示EPCs是一類能增殖并分化為血管內皮的前體細胞，廣泛參與內皮受損后的修復，對于改善內皮功能障礙意義重大。研究表明，動脈粥樣硬化患者外周血中EPCs數量明顯減少，遷移和黏附功能均下降[9-10]，且這一改變在粥樣病變尚未形成之前便已出現[11-12]，嚴重影響了受損內皮的修復，而輸注良好功能的EPCs則能明顯改善內皮功能并能抑制粥樣斑塊的進展[13-14]。進一步分析還發現，在動物造模的同時行EPCs移植可有效抑制粥樣斑塊的形成[13-14]。上述所有研究提示良好功能的EPCs在冠心病的發生、發展中可能扮演重要的角色。

Figure 5.Aninvitrovasculogenesis assay for late EPCs was used with ECMatrix gel (×100). YW: yellow wine; RW: red wine; Eth: ethanol. Mean±SD.n=5.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;△△P<0.01vsHcy.

圖5 各種酒類對大鼠EPCs成血管能力的比較

Figure 6.The effect of different kinds of wine on the apoptosis of Hcy-induced EPCs analyzed by flow cytometry. YW: yellow wine; RW: red wine; Eth: ethanol. Means±SD.n=5.

圖6 各種酒類對大鼠EPCs凋亡程度的影響

Hcy是蛋氨酸和半胱氨酸代謝過程中重要的中間產物，由于環境或遺傳因素導致Hcy的關鍵酶缺失或活性的降低，引起血漿中Hcy濃度升高。高同型半胱氨酸(HHcy)是指空腹血漿中Hcy大于15 μmol/L[15]。近些年，國內外相關研究顯示，除了傳統的危險因素，比如高血壓、糖尿病、血脂異常、肥胖等，HHcy已經成為心血管疾病的發病特別是動脈粥樣硬化重要的一危險因素，并且其通過眾多機制參與到動脈粥樣硬化的形成，內皮細胞功能的障礙是其關鍵環節[5]。王興祥等[16]研究發現Hcy主要影響EPCs的數量、黏附、遷移等功能。

過量飲酒和酗酒不利于身體健康，但國外針對紅葡萄酒的研究結果發現適量飲酒卻能減少冠心病意外事件的發生[17]。研究[18-21]發現紅酒中的多酚具有抑制炎癥因子、減少血小板凝集、提高血液循環中EPCs的數量和功能以及保護血管內皮等作用，能延緩甚至抑制粥樣斑塊的進展，最終可以有效減少心肌梗死等嚴重心血管事件的發生，而上述作用與酒精則無明顯相關性。作為我國特有民族產品的紹興黃酒富含與紅酒相似的多酚[22]。本研究發現黃酒組能顯著增加Hcy誘導的EPCs的數量，并且在酒精終濃度為0.4%達到峰值，并且也顯著改善了遷移和體外成血管能力，但是細胞的凋亡的水平未見明顯改善，或許與細胞的生長周期有關[23]。本實驗發現黃酒組與Hcy組、Hcy+酒精比較，EPCs的功能有明顯的改善，提示少量的黃酒能通過增強Hcy誘導的EPCs的增殖能力和改善其功能來抑制動脈粥樣硬化的形成和發展，進而減少臨床心血管事件的發生。但是具體機制尚不明確。我們課題組前期研究發現少量黃酒能減低血漿Hcy水平[6-7]，并且類似于紅酒改善動脈粥樣硬化的機制即黃酒中黃酒多酚成分來發揮其改善EPCs功能和增加數量。

綜上所述，少量的黃酒能改善Hcy誘導的EPCs的功能以及增加細胞的數量，從而抑制動脈粥樣硬化的形成，針對其具體機制的研究將在本系列實驗中進一步探索。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Effects of Chinese yellow wine on homocysteine-induced dysfunction in rat endothelial progenitor cells

JIANG Cheng-jian, PAN Sun-lei, GUO Yan, MENG Li-ping, ZHOU Chang-zuan, CHI Ju-fang, ZHAI Xiao-ya, GUO Hang-yuan

(DepartmentofCardiovascularDiseases,ShaoxingHospitalofZhejiangUniversity,Shaoxing312000,China.E-mail:ghangyuan@hotmail.com)

AIM: To investigate whether Chinese yellow wine has influences on homocysteine (Hcy)-induced dysfunction in rat endothelial progenitor cells (EPCs). METHODS: Rat bone marrow was extracted to harvest mononuclear cells (MNCs) by density gradient centrifugation. The MNCs were plated on fibronectin-coated culture dishes, and were induced into EPCs by EGM-2 complete medium supplemented with cell growth factor. The adherent cells were collected 7 d later for all studies. EPCs were characterized as adherent cells double positive for DiI-ac-LDL uptaking and lectin binding by direct fluorescent staining under a laser scanning confocal microscope. The viability, migration, apoptosis andinvitrovasculogenic activity of the EPCs were determined by MTT assay, Transwell chamber assay, apoptosis kit andinvitrovasculogenesis kit, respectively. RESULTS: Compared with control group, the viability, migration andinvitrovasculogenic capacity of the EPCs in Hcy group were significantly decreased (P<0.01). Compared with Hcy group, yellow wine group and red wine group both significantly improved the viability, migration andinvitrovasculogenic capacity of Hcy-induced EPCs (P<0.01). Compared with control group, yellow wine group and red wine group both significantly improved the above-mentioned functions of EPCs (P<0.05). However, no significant difference of apoptosis in all groups was observed. CONCLUSION: Hcy may result in dysfuction of EPCs. Treatment with yellow wine improves Hcy-induced EPC functions.

Yellow wine; Atherosclerosis; Endothelial progenitor cells; Homocysteine

1000- 4718(2016)12- 2216- 06

2016- 07- 28

2016- 09- 27

衛生部科學研究基金-浙江省醫藥衛生重大科技計劃項目(No.Wkj2011-2-018)；浙江省自然科學基金資助項目(No.LY14H020002)

R363; R543

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.12.015

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