碧蘿芷通過下調ERK磷酸化及自噬水平抑制TGF-β1誘導的肝星狀細胞活化

楊淑娟， 何英利， 馬曉華， 姜 娜

(1西安市第八醫院肝病二病科, 2西安交通大學第一附屬醫院感染科, 3西安市第八醫院重癥醫學科， 陜西 西安 710061)

碧蘿芷通過下調ERK磷酸化及自噬水平抑制TGF-β1誘導的肝星狀細胞活化

楊淑娟1△， 何英利2， 馬曉華3， 姜 娜1

(1西安市第八醫院肝病二病科,2西安交通大學第一附屬醫院感染科,3西安市第八醫院重癥醫學科， 陜西 西安 710061)

目的： 探究碧蘿芷對轉化生長因子β1(TGF-β1)誘導的肝星狀細胞活化的影響。方法：5 μg/L TGF-β1和不同濃度碧蘿芷(0、10、25、50 mg/L)分別作用于LX-2細胞，在有或無自噬抑制劑3-MA和ERK抑制劑PD98059的情況下，用MTT法檢測細胞活力的變化，Western blot實驗檢測α-SMA、ColⅠ、TIMP-1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、beclin 1、p-ERK1/2和ERK1/2蛋白水平的變化。結果：與對照組相比，5 μg/L TGF-β1組的LX-2細胞活力以及α-SMA、ColⅠ、TIMP-1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、beclin 1、p-ERK1/2和ERK1/2蛋白水平明顯增加(P<0.05)。而碧蘿芷預處理能逆轉上述效應，并呈現一定的劑量依賴性，50 mg/L碧蘿芷的抑制效果最為顯著(P<0.05)。而且，與TGF-β1組相比較，50 mg/L碧蘿芷、5 mmol/L 3-MA或者20 μmol/L PD98059預處理下，TGF-β1誘導的LX-2細胞活力以及α-SMA和LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達均明顯下調(P<0.05)。結論：碧蘿芷通過下調ERK磷酸化及自噬水平抑制TGF-β1誘導的肝星狀細胞活化。

碧蘿芷； 轉化生長因子β1； 自噬； 肝星狀細胞； 細胞活力

肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是由多種因素引起的細胞外基質(extracellular matrix，ECM)合成和降解不平衡，進而導致肝臟纖維結締組織的過度沉積，被視為各種慢性肝病向肝硬化發展所共有的病理改變和必經階段[1-2]。肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)是形成HF的主要細胞，其過度活化增殖是HF進展的中心環節，以α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)增多為最顯著的活化標志。有研究認為，阻止HSC的活化有可能阻斷HF的進程[3]，因此，尋找合適的藥物阻止HSC活化增殖是抗HF的重要途徑。

碧蘿芷(Pycnogenol，PYC)是法國海岸松樹皮的提取物，主要由低聚前花青素和其它生物類黃酮及有機酸等生物活性的水溶性成分組成[4]。它是一種較強的天然抗氧化劑，可通過多種途徑清除氧自由基，抑制炎癥因子生成。有研究表明，碧蘿芷可明顯減輕非酒精性脂肪性肝炎大鼠模型的肝損傷反應[5]。HF是繼發于各種原因引起的肝臟炎癥或肝損傷修復過程中的代償反應[1]，因此我們推測碧蘿芷可能在HF發展進程中發揮改善作用。活化的HSC可產生多種細胞因子，其中轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)被認為是最強的致纖維化細胞因子[6]。目前，有關碧蘿芷是否影響HF病理進程的研究尚未報道，因此有必要首先探討碧蘿芷是否在外源性TGF-β1誘導的HSC活化中發揮作用。本實驗以人肝星狀細胞株LX-2為研究對象，探究碧蘿芷對TGF-β1誘導的LX-2細胞活化的影響以及相關機制，旨在為臨床抗肝纖維化預防和治療提供新思路。

材 料 和 方 法

1 材料與試劑

人肝星狀細胞株LX-2(中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心)；碧蘿芷粉末(Henkel)；DMEM和胎牛血清(Gibco)；TGF-β1、二甲基亞砜(DMSO)、四甲基偶氮唑藍(MTT)、PD98059、3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)和抗α-SMA鼠單抗(Sigma)；BCA蛋白定量分析試劑盒(Thermo)；抗ERK1/2鼠單抗、抗p-ERK1/2羊多抗和抗β-actin兔多抗(Santa Cruz)；抗beclin 1兔多抗、抗LC3兔多抗、抗ColⅠ鼠單抗和抗TIMP-1兔單抗(Abcam)；PVDF膜(Millipore)；ECL、HRP標記的山羊抗鼠IgG II抗、山羊抗兔IgG II 抗和驢抗山羊 IgG II 抗(江蘇碧云天生物技術研究所)。

2 方法

2.1 細胞培養 LX-2細胞用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養基，在37 ℃、5% CO2條件下進行培養。融合度約為80%時，用0.25%胰蛋白酶消化，根據細胞生長情況，更換培養基，取對數生長期細胞用于后續實驗。

2.2 細胞處理 碧蘿芷溶解于DMSO中，-20 ℃保存。所有含10、25、50 mg/L 等濃度碧蘿芷，20 μmol/L PD98059和5 mmol/L 3-MA的培養液均由含0.2%胎牛血清的DMEM培養基配制。細胞無血清培養24 h后，加入含不同濃度碧蘿芷的培養基，預孵育1 h后，加入終濃度為5 μg/L TGF-β1，孵育24 h后，進行相關實驗。含20 μmol/L PD98059或者5 mmol/L 3-MA的培養基預處理30 min。各組細胞用相應處理的培養基孵育時間一致。

2.3 MTT法檢測細胞活力 按每孔1×104個的密度將LX-2細胞接種于96孔板，每孔200 μL培養基，24 h后換液，無血清培養24 h。隨后分5組，對照組，5 μg/L TGF-β1+碧蘿芷(0、10、25、50 mg/L)組，分別加180 μL相應處理的培養基，每組設6個復孔。作用24 h后，向待測孔加入20 μL MTT溶液(5 g/L)，37 ℃孵育4 h。棄上清，每孔加入150 μL DMSO，溶解后，酶標儀檢測490 nm處各孔的吸光度(A)，則各組細胞相對活力(%)=處理組平均A值/對照組平均A值×100%。

2.4 Western blot法檢測蛋白的水平 按每孔4×105個的密度將LX-2細胞接種于6孔板，24 h后換液，無血清DMEM培養。24 h后，分別加相應處理的培養基孵育。作用24 h后，收集細胞，PBS洗滌2次后，加入RAPI細胞裂解液，提取細胞全蛋白。經BCA定量、上樣、SDS-PAGE、轉膜、封閉、 I抗孵育、 II 抗孵育和ECL顯影等步驟，檢測各組細胞中α-SMA、ColⅠ、TIMP-1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、p-ERK1/2、ERK1/2和β-actin蛋白水平。

3 統計學分析

實驗數據采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，計量資料用均數±標準差(mean±SD)表示，各組間比較用單因素方差分析，各組均數間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 碧蘿芷抑制TGF-β1誘導的LX-2細胞活力

MTT結果顯示，細胞處理24 h后，與對照組相比，5 μg/L TGF-β1組的相對細胞活力明顯增加。而在10、25、50 mg/L碧蘿芷預處理下，TGF-β1誘導的細胞活力降低，并呈現一定的濃度依賴性，50 mg/L碧蘿芷的抑制效果最為顯著，見圖1。

2 碧蘿芷下調TGF-β1誘導的LX-2細胞活化

Western blot實驗結果顯示，細胞處理24 h后，與對照組相比，5 μg/L TGF-β1組肝星狀LX-2細胞活化標志物α-SMA、ColⅠ和TIMP-1等蛋白表達明顯升高。而在10、25、50 mg/L碧蘿芷預處理下，TGF-β1誘導的LX-2細胞活化標志物蛋白表達水平均下調，并呈現一定的濃度依賴性，50 mg/L碧蘿芷的抑制效果最為顯著，見圖2。

Figure 1.The effect of Pycnogenol (PYC) on TGF-β1-induced viability of the LX-2 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsTGF-β1 group.

圖1 碧蘿芷處理對TGF-β1誘導的LX-2細胞活力的影響

Figure 2.The effect of Pycnogenol (PYC) on TGF-β1-induced protein expression of α-SMA, ColⅠand TIMP-1 in the LX-2 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsTGF-β1 group.

圖2 碧蘿芷處理對TGF-β1誘導的LX-2細胞α-SMA、ColⅠ和TIMP-1蛋白表達的影響

3 碧蘿芷抑制TGF-β1誘導的LX-2細胞自噬

Western blot實驗結果顯示，細胞處理24 h后，與對照組相比，5 μg/L TGF-β1組LX-2細胞LC3-Ⅱ/Ⅰ和beclin1的蛋白表達明顯升高。而在10、25、50 mg/L碧蘿芷預處理下，TGF-β1誘導的LX-2細胞自噬相關蛋白表達水平均降低，并呈現一定的濃度依賴性，50 mg/L碧蘿芷的抑制效果最為顯著，見圖3。

4 碧蘿芷抑制TGF-β1誘導的LX-2細胞ERK磷酸化

Western blot實驗結果顯示，細胞處理24 h后，與對照組相比，5 μg/L TGF-β1組LX-2細胞p-ERK1/2的蛋白水平明顯升高。而在10、25、50 mg/L碧蘿芷預處理下，TGF-β1誘導的LX-2細胞p-ERK1/2蛋白表達均降低，并呈現一定的濃度依賴性，50 mg/L碧蘿芷的抑制效果最為顯著，見圖4。

Figure 3.The effect of Pycnogenol (PYC) on TGF-β1-induced protein expression of LC3-Ⅱ/Ⅰand beclin 1 in the LX-2 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsTGF-β1 group.

圖3 碧蘿芷處理對TGF-β1誘導的LX-2細胞LC3-Ⅱ/Ⅰ和beclin 1蛋白表達的影響

Figure 4.The effects of Pycnogenol (PYC) on TGF-β1-induced protein levels of p-ERK1/2 and ERK1/2 in the LX-2 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsTGF-β1 group.

圖4 碧蘿芷處理對TGF-β1誘導的LX-2細胞p-ERK1/2和ERK1/2蛋白水平的影響

5 碧蘿芷通過下調ERK磷酸化及自噬水平抑制TGF-β1誘導的肝星狀細胞活化

Western blot實驗結果顯示，細胞處理24 h后，與5 μg/L TGF-β1組相比較，50 mg/L碧蘿芷、20 μmol/L PD98059或者5 mmol/L 3-MA預處理下，TGF-β1誘導的LX-2細胞活力以及p-ERK1/2、α-SMA和LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白水平均明顯下調，見圖5。

Figure 5.The effects of Pycnogenol (PYC), 3-MA or PD98059 on TGF-β1-induced cell viability (A) and protein levels of p-ERK1/2 (B), α-SMA and LC3-Ⅱ/Ⅰ (C) in the LX-2 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsTGF-β1 group.

圖5 碧蘿芷、3-MA和PD98059處理對TGF-β1誘導的LX-2細胞活力以及p-ERK1/2、α-SMA和LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白水平的影響

討 論

目前，我國各種肝病發病率呈上升趨勢，HF是各種肝病的共同病理學基礎，如果得不到有效的治療，最終發展成肝硬化，甚至引起肝功能衰竭等嚴重的并發癥，并導致死亡。HF形成是由各種致病因子引起肝內結締組織異常增生，導致肝內ECM過度沉淀的極為復雜的生理病理過程。由于肝纖維化發生的機制極其復雜，目前臨床上實用的藥物療效并不理想。TGF-β1是促進HF形成的關鍵細胞因子，它通過促進HSC活化，使其失去脂質液滴及其向肌成纖維樣細胞和成纖維細胞的轉化，導致大量ECM合成，加重并最終導致HF。因此，肝纖維化發生的最終途徑是HSC活化，如何抑制HSC活化是HF治療的重要研究方向。

碧蘿芷是法國西南部沿海森林中生長的松樹的提取物，是一種水溶性復合抗氧化劑。它含有包括生物類黃酮、有機酸及其他有生物活性在內的40多種成分，其中以前花青素為主。原花青素注射的大鼠的血清代謝物可降低HepG2細胞脂類合成[7]。研究發現，碧蘿芷具有清除自由基、皮膚保健、抗炎和防治心血管疾病等多種保健功能。碧蘿芷可改善免疫缺陷小鼠的肝氧化應激狀態[7]，有效減輕Ⅱ型糖尿病大鼠中高血糖誘導的肝臟氧化損傷[8]和Ⅰ型糖尿病大鼠模型的糖尿病相關并發癥，并抑制TNF-α和IL-1β等炎癥因子表達[9]。大量文獻顯示，碧蘿芷對順鉑誘導的大鼠急性肝損傷[10]以及四氯化碳誘導的大鼠肝氧化損傷和急性肝損傷均有明顯的抑制作用[11-12]。而且，碧蘿芷能顯著抑制非酒精性脂肪性肝炎大鼠模型中的肝脂肪變性和和纖維化等肝損傷病理進程[5]。文獻報道TGF-β1在人體HF組織中高表達，可在HF過程中誘導α-SMA和ColⅠ的表達[13]，并促進HSC的活化增殖[14]。本研究發現，碧蘿芷能下調TGF-β1誘導的α-SMA、ColⅠ和TIMP-1等蛋白表達，從而抑制LX-2細胞的活化。

自噬是細胞內大分子物質及細胞器參與自我更新及能量代謝的重要生物學過程，在促進HSC能量代謝并維持HSC活化狀態過程中具有重要作用。HSC活化伴隨著自噬流升高，下調HSC自噬則顯著抑制其活化[15]。自噬抑制劑3-MA通過降低細胞增殖，并下調α-SMA、ColⅠ和LC3-Ⅱ/Ⅰ等蛋白表達，抑制HSC的活化增殖[16]。而且，TGF-β1可通過誘導自噬降低HSC凋亡[17]，碧蘿芷能降低萬古霉素誘導的凋亡和自噬相關蛋白表達[18]。本實驗發現，碧蘿芷抑制TGF-β1誘導的LX-2細胞自噬。此外，ERK信號通路參與了細胞增殖分化、穩態維持、細胞凋亡等生物學反應，最近發現不同處理因素下ERK磷酸化的增強是自噬發生的一個重要因素[19]。TGF-β1促進ERK磷酸化[20]，并刺激上調HSC中α-SMA和TIMP-1蛋白的表達[21]。另外，有研究表明，ERK磷酸化水平的下降和ECM沉積的減少能夠有效抑制HF過程中HSC活化[22-23]。ERK抑制劑PD98059可有效抑制HSC中α-SMA的表達[24]。本實驗結果表明，碧蘿芷通過下調ERK磷酸化及自噬水平抑制TGF-β1誘導的肝星狀細胞的活化。結合參考文獻，我們推測，碧蘿芷可能通過下調ERK介導的自噬抑制TGF-β1誘導的肝星狀細胞活化。

[1] Bataller R, Brenner DA. Liver fibrosis[J]. J Clin Invest, 2005, 115(2): 209-218.

[2] 韓 冰, 謝汝佳, 洪 琴, 等. 肝纖維化病理過程中ZEB1和ZEB2的動態表達變化及意義[J]. 中國病理生理雜志, 2012, 28(9): 1639-1643.

[3] 俞富祥, 宋才鑫, 吳志偉, 等. 脂肪特異性蛋白27對大鼠肝星狀細胞活化的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2013, 29(9): 1597-1602.

[4] Rohdewald P. A review of the French maritime pine bark extract (Pycnogenol), a herbal medication with a diverse clinical pharmacology[J]. Int J Clin Pharmacol Ther, 2002, 40(4): 158-168.

[5] Mei L, Mochizuki M, Hasegawa N. Hepatoprotective effects of pycnogenol in a rat model of non-alcoholic steatohepatitis[J]. Phytother Res, 2012, 26(10): 1572-1574.

[6] Gressner AM, Weiskirchen R, Breitkopf K, et al. Roles of TGF-beta in hepatic fibrosis[J]. Front Biosci, 2002, 7: d793-d807.

[7] Lee J, Nam DE, Kim OK, et al. Pycnogenol attenuates the symptoms of immune dysfunction through restoring a cellular antioxidant status in low micronutrient-induced immune deficient mice[J]. Nutr Res Pract, 2014, 8(5): 533-538.

[8] Parveen K, Khan MR, Mujeeb M, et al. Protective effects of Pycnogenol on hyperglycemia-induced oxidative damage in the liver of type 2 diabetic rats[J]. Chem Biol Interact, 2010, 186(2): 219-227.

[9] Parveen K, Ishrat T, Malik S, et al. Modulatory effects of Pycnogenol in a rat model of insulin-dependent diabetes mellitus: biochemical, histological, and immunohistochemical evidences[J]. Protoplasma, 2013, 250(1): 347-360.

[10]Ko JW, Lee IC, Park SH, et al. Protective effects of pine bark extract against cisplatin-induced hepatotoxicity and oxidative stress in rats[J]. Lab Anim Res, 2014, 30(4): 174-180.

[11]Ahn TH, Yang YS, Lee JC, et al. Ameliorative effects of pycnogenol on carbon tetrachloride-induced hepatic oxidative damage in rats[J]. Phytother Res, 2007, 21(11): 1015-1019.

[12]Yang YS, Ahn TH, Lee JC, et al. Protective effects of Pycnogenol on carbon tetrachloride-induced hepatotoxicity in Sprague-Dawley rats[J]. Food Chem Toxicol, 2008, 46(1): 380-387.

[13]Liu Z, Yi J, Ye R, et al. miR-144 regulates transforming growth factor-β1-induced hepatic stellate cell activation in human fibrotic liver[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2015, 8(4): 3994-4000.

[14]Xu T, Ni MM, Xing L, et al. NLRC5 regulates TGF-β1-induced proliferation and activation of hepatic stellate cells during hepatic fibrosis[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2016, 70: 92-104.

[15]Thoen LF, Guimaraes EL, Dolle L, et al. A role for autophagy during hepatic stellate cell activation[J]. J Hepatol, 2011, 55(6): 1353-1360.

[16]劉 曼, 何 月, 張吉翔. 自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤對肝星狀細胞增殖活化的影響[J]. 細胞與分子免疫學雜志, 2013, 29(8): 809-812, 817.

[17]Fu MY, He YJ, Lv X, et al. Transforming growth factorbeta1 reduces apoptosis via autophagy activation in hepatic stellate cells[J]. Mol Med Rep, 2014, 10(3): 1282-1288.

[18]Bayomy NA, Abdelaziz EZ, Said MA, et al. Effect of pycnogenol and spirulina on vancomycin-induced renal cortical oxidative stress, apoptosis, and autophagy in adult male albino rat[J]. Can J Physiol Pharmacol, 2016, 94(8): 838-848.

[19]Hu P, Lai D, Lu P, et al. ERK and Akt signaling pathways are involved in advanced glycation end product-induced autophagy in rat vascular smooth muscle cells[J]. Int J Mol Med, 2012, 29(4): 613-618.

[20]潘霄羽, 王 燕, 黃高翔, 等. TGF-β1激活的p38 MAPK在TGF-β1上調人卵巢癌細胞PAI-1表達中的作用[J]. 中國病理生理雜志, 2015, 31(2): 284-288.

[21]吳艷玲， 安仁波， 宋順宗. 山楂葉懸鉤子水提取物對轉化生長因子-β刺激的肝星狀細胞活化的抑制作用及其機制[J]. 延邊大學醫學學報, 2013, 36(3): 170-173.

[22]Zhong C, Jiang C, Xia X, et al. Antihepatic fibrosis effect of active components isolated from green asparagus (AsparagusofficinalisL.) involves the inactivation of hepatic stellate Cells[J]. J Agric Food Chem, 2015, 63(26): 6027-6034.

[23]Xu Y, Peng Z, Ji W, et al. A novel matrine derivative WM130 inhibits activation of hepatic stellate cells and attenuates dimethylnitrosamine-induced liver fibrosis in rats[J]. Biomed Res Int, 2015, 2015:203978.

[24]宋雅芳, 呂志剛, 徐列明. 丹參酚酸B鹽對轉化生長因子β1活化的大鼠肝星狀細胞內細胞外信號調節激酶信號轉導通路的抑制作用(英文)[J]. 中西醫結合學報, 2012, 10(4): 454-461.

(責任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Pycnogenol suppresses TGF-β1-induced hepatic stellate cell activation via ERK-mediated autophagy inhibition

YANG Shu-juan1, HE Ying-li2, MA Xiao-hua3, JIANG Na1

(1DepartmentofHepatologySectionII,TheEighthHospitalofXi’an,2DepartmentofInfectiousDiseases,TheFirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,3DepartmentofIntensiveCareMedicine,TheEighthHospitalofXi’an,Xi’an710061,China.E-mail:pingxuqingdao@163.com)

AIM: To explore the effect of Pycnogenol on transforming growth factor-β1 (TGF-β1)-induced hepatic stellate cell activation. METHODS: Cultured LX-2 cells were treated with 5 μg/L TGF-β1 and different concentrations (0, 10, 25 and 50 mg/L) of Pycnogenol. The viability of the LX-2 cells under the conditions with or without autophagy inhibitor 3-MA and ERK inhibitor PD98059 was determined by MTT assay. The protein levels of α-SMA, ColⅠ, TIMP-1, LC3-Ⅱ/Ⅰ, beclin 1, p-ERK1/2 and ERK1/2 were detected by Western blot. RESULTS: Compared with control group, 5 μg/L TGF-β1 treatment elevated the cell viability, and increased the protein levels of α-SMA, ColⅠ, TIMP-1, LC3-Ⅱ/Ⅰ, beclin 1, p-ERK1/2, and ERK1/2 in the LX-2 cells (P<0.05). However, these effects were reversed by Pycnogenol pretreatment in a dose-dependent manner and the inhibitory effect of 50 mg/L Pycnogenol was the most significant in the LX-2 cells (P<0.05). Furthermore, compared with TGF-β1 group, pretreatment with 50 mg/L Pycnogenol, 5 mmol/L 3-MA or 20 μmol/L PD98059 downregulated TGF-β1-induced cell viability and the protein levels of α-SMA and LC3-Ⅱ/Ⅰ in the LX-2 cells (P<0.05). CONCLUSION: Pycnogenol suppresses TGF-β1-induced hepatic stellate cell activation via p-ERK and autophagy inhibition.

Pycnogenol; Transforming growth factor-β1; Autophagy; Hepatic stellate cells; Cell viability

1000- 4718(2016)12- 2261- 05

2016- 06- 22

2016- 09- 20

R575.2; R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.12.023

雜志網址： http://www.cjpp.net

△通訊作者 Tel: 18700993968； E-mail: pingxuqingdao@163.com