法舒地爾通過抑制兔尿道成纖維細胞Rho/ROCK通路激活減少尿道損傷后狹窄的發生*

許 寧， 瞿根義， 陳少豪， 陳慧軍， 吳宇鵬， 李曉東， 林云知， 魏 勇， 鄭清水， 黃金杯， 薛學義

(福建醫科大學附屬第一醫院泌尿外科，福建 福州 350005)

法舒地爾通過抑制兔尿道成纖維細胞Rho/ROCK通路激活減少尿道損傷后狹窄的發生*

許 寧， 瞿根義， 陳少豪， 陳慧軍， 吳宇鵬， 李曉東， 林云知， 魏 勇， 鄭清水， 黃金杯， 薛學義△

(福建醫科大學附屬第一醫院泌尿外科，福建 福州 350005)

目的： 研究法舒地爾對創傷后兔尿道狹窄發生的影響及機制，觀察兔尿道成纖維細胞活力、遷移以及細胞外基質合成情況。方法:利用顯微外科技術建立兔尿道創傷動物模型，分為5組：假手術組，手術組，不同劑量(3 mg/kg、10 mg/kg、30 mg/kg)法舒地爾組，術后3個月逆行尿道造影測量狹窄直徑。從兔尿道瘢痕組織提取成纖維細胞進行傳代培養，培養液中分別加入TGF-β1(10 μg/L)和/或法舒地爾(12.5 μmol/L，25 μmol/L，50 μmol/L)。MTT比色法檢測細胞活力；用Transwell小室實驗檢測細胞遷移能力；Western blot法檢測各組Rho相關激酶(ROCK)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)以及膠原蛋白I和III的表達情況。結果:法舒地爾顯著減少尿道損傷后狹窄發生(P<0.05)。隨著法舒地爾濃度的增加，成纖維細胞的活力受到抑制，細胞遷移能力逐漸減弱，ROCK、α-SMA以及膠原蛋白I和III的表達受到抑制；法舒地爾對兔尿道成纖維細胞外基質及ROCK表達起抑制作用，并呈劑量依賴性(P<0.05)。結論:法舒地爾可以通過下調TGF-β1誘導的兔尿道成纖維細胞Rho/ROCK通路，抑制細胞外基質形成，減少尿道損傷后狹窄的發生。

法舒地爾； Rho相關激酶； 尿道成纖維細胞； 尿道損傷； 尿道狹窄

尿道損傷后狹窄是泌尿外科常見疾病，由于其發病機理尚未完全闡明，目前對損傷后尿道狹窄及狹窄復發，無論是藥物治療還是尿道內切開治療都尚未取得顯著療效，也是困擾泌尿外科醫生的一大難題[1]。研究表明，尿道瘢痕增生以膠原等細胞外基質的過度合成、沉積以及成纖維細胞旺盛增殖為主。正常情況下，成纖維細胞處于靜息狀態，當尿道受到外界損傷時，尿道成纖維細胞同時受到轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)刺激發生表型轉化，從而活化并增殖，最終引起膠原等細胞外基質的過度合成與沉積，導致尿道瘢痕的形成[2-3]。

Rho/ROCK信號通路異常激活與成纖維細胞功能異常相關瘢痕增生性疾病發生密切相關[4-6]。法舒地爾(fasudil，Fasu)為Rho相關激酶(Rho-associa-ted kinase, ROCK)抑制劑，可以通過抑制成纖維細胞Rho/ROCK通路激活，顯著減少多種纖維化相關疾病的發生[7]。

本研究用顯微外科技術建立兔尿道創傷動物模型，通過逆行尿道造影測量狹窄直徑研究法舒地爾對于尿道創傷后狹窄發生的影響；同時觀察不同濃度的ROCK抑制劑法舒地爾對TGF-β1誘導的兔尿道成纖維細胞的增殖、遷移、細胞外基質合成的影響。

材 料 和 方 法

1 主要材料試劑

TGF-β1購自Sigma；抗ROCK、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)、膠原蛋白(collagen) I、 collagen III、GAPDH抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG II 抗均購自Santa Cruz；鹽酸法舒地爾購自山東羅欣藥業；Gibco胎牛血清購自博豐生物技術有限公司；雄性新西蘭兔40只，體質量 2.8～3.3 kg，由福建醫科大學實驗動物中心提供，合格證編號為200700102092。Quantity One 4.6.2來自Bio-Rad的1 D凝膠定量軟件；其余有關分子生物學試劑由福建醫科大學附屬第一醫院中心實驗室提供。

2 方法

2.1 動物模型建立及分組[8-9]將40只雄性成年新西蘭兔隨機分成假手術(sham)組，模型(model)組、法舒地爾組(根據參考文獻[8-9]和我們前期的預實驗結果，確定法舒地爾劑量為3 、10 、30 mg/kg)，共5組，每組8只。假手術組、模型組每天耳緣靜脈注射同等劑量生理鹽水，法舒地爾組每天耳緣靜脈分別注射法舒地爾3 mg/kg、10 mg/kg、30 mg/kg，共30 d。

利用顯微外科技術建立尿道創傷模型。動物麻醉后(氯胺酮 2.5 mg/kg及地西泮25 mg/kg 耳緣靜脈注射)，取仰臥位置于操作臺上，固定四肢及頭部，會陰部碘伏消毒鋪巾。利用顯微外科器械在 10 倍放大鏡下分離切除陰莖腹側面尿道黏膜約 1 cm，逐層關閉切口[10]。繼續飼養并注射生理鹽水與法舒地爾3個月建立尿道創傷動物模型。

2.2 尿道狹窄的評估 X線透視下行逆行尿道造影：尿道灌注石蠟油2 mL潤滑，將76%復方泛影葡胺用0.9%氯化鈉1∶1稀釋備用，留置6F輸尿管導管，在鉛衣防護下進行逆行尿道造影，從輸尿管導管邊推注泛影葡胺造影劑邊后退，同時進行X攝片，直至手術瘢痕修復處，保存造影圖片，測量狹窄直徑。

2.3 尿道成纖維細胞原代培養、傳代及鑒定 在無菌條件下手術分離兔尿道瘢痕組織，從其中提取尿道瘢痕成纖維細胞，錐蟲藍計數測存活率約95%，方法參考文獻[2]進行操作。將細胞接種于培養瓶中培養(5% CO2、37 ℃)，按常規方法傳代或進行后續實驗。細胞鑒定采用免疫化學染色ABC 法。取第 3 代細胞進行細胞爬片、固定、滅活過氧化物酶，順序滴加血清封閉液、 I 抗、II 抗及 ABC復合物，以 DAB 顯色，然后脫水、透明、封片，顯微鏡觀察。成纖維細胞的特異性標記蛋白是波形蛋白。免疫組化簽定成纖維細胞I抗采用兔抗波形蛋白抗體[11]。

2.4 藥物分組培養方法 培養液中分別加入TGF-β1(10 μg/L)和法舒地爾(0 μmol/L、12.5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L)。實驗共分成5個組，

2.5 MTT法檢測細胞存活率 取對數期細胞，調整細胞懸液濃度，每孔加入100 μL。5% CO2、37 ℃條件下孵育至細胞單層鋪滿96孔平底板孔底，分別加入TGF-β1 (10 μg/L)和法舒地爾(0 μmol/L、12.5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L)濃度梯度的藥物。孵育16～48 h，倒置顯微鏡下觀察。于24 h和48 h每孔加入20 μL MTT溶液(5 g/L)，繼續培養4 h。分別在570 nm處記錄吸光度(A)值。同等條件下重復檢測3次。存活率(%) = (實驗組細胞平均吸光度值/對照組平均吸光度值)×100%。

2.6 Transwell小室遷移實驗 將Transwell小室放于24孔板內，用BD Matrigel基質膠在每個Transwell小室上層鋪50 μL，再加入100 μL不含血清的DMEM，同時將含10%胎牛血清的DMEM 500 μL加入小室下層中，取100 μL制成的細胞懸液加入Transwell小室上室，使每孔含1.0×105個細胞。 在各實驗組細胞分別加入TGF-β1(10 μg/L)和法舒地爾(0 μmol/L、12.5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L)，37 ℃、5% CO2恒溫培養箱培養24 h。取出Transwell小室，在400倍顯微鏡下隨機選取10個視野計數中心、左、右、上、下侵襲細胞數，計算平均值。

2.7 Western blot法檢測蛋白水平 分組處理結束后，6孔板每孔加入100～200 μL裂解液，細胞裂解后，采用離心機以10 000～14 000 r/min離心5 min，用RIPA蛋白裂解液稀釋上清液，調整各組裂解液中蛋白質的濃度，使其達到一致后進行SDS-PAGE 。再采用濕法轉膜，將膜浸沒在Western blot 封閉液中37 ℃輕搖1 h封閉，再用 I 抗孵育，HRP 標志的 II 抗孵育，最后ECL反應、膠片曝光，底片通過凝膠灰度分析軟件Quantity One 4.6.2進行灰度值定量。

3 統計學處理

“回首向來蕭瑟處，也有風雨也有晴”。改革開放40年是中國制造業從低端走向中高端的關鍵發展階段，在這個偉大的歷史變革過程中，我們的制造業通過大浪淘沙涌現了一批有影響力的優秀企業。正是他們的堅守、成就與貢獻，推動了行業轉型升級，引領了行業發展方向，從而真正促進了中國制造業大踏步從高速度增長向高質量發展邁進。

采用SPSS 22.0統計軟件進行統計學處理。計量資料用均數±標準差(mean±SD)表示，各組之間的比較采用單因素方差分析，多重比較采用SNK-q法。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 法舒地爾對尿道損傷后狹窄發生的影響

給藥30 d后，模型組死亡2只，3 mg/kg Fasu組死亡1只，10 mg/kg Fasu組無死亡，30 mg/kg Fasu組死亡1只。在X線透視下逆行尿道造影，測量各組尿道狹窄的直徑，結果顯示，經不同濃度法舒地爾給藥后，尿道創傷后狹窄的程度有所下降，且隨著法舒地爾濃度的升高，尿道狹窄程度明顯降低(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.The effect of fasudil on formation of urethral stricture after injury. Mean±SD.n=6～8.★P<0.05vssham group;#P<0.05vsmodel group;▲P<0.05vsFasu (3 mg/kg) group;●P<0.05vsFasu (10 mg/kg) group.

圖1 法舒地爾對尿道創傷后狹窄發生的影響

2 法舒地爾對兔尿道瘢痕成纖維細胞活力的影響

MTT實驗結果顯示，隨著法舒地爾濃度升高，兔尿道成纖維細胞活力受到抑制，A570 nm出現不同程度下降，且與對照組比較差異有統計學顯著性(P<0.05)。法舒地爾干預TGF-β1誘導下兔尿道成纖維細胞在24 h、48 h后的半數存活率(IC50)濃度分別為39.45、31.75 μmol/L。經統計分析得出，隨著干預時間的延長，法舒地爾對尿道瘢痕成纖維細胞的存活率影響越顯著(P<0.05)。且法舒地爾濃度的越高，尿道瘢痕成纖維細胞活力越弱，見圖2。

3 法舒地爾對兔尿道瘢痕成纖維細胞遷移能力的影響

Transwell小室遷移實驗結果顯示，法舒地爾濃度越高，對兔尿道成纖維細胞遷移抑制作用越強，細胞遷移的個數明顯減少，其遷移能力逐漸減弱，總體呈現濃度依賴關系(P<0.05)，見圖3。

Figure 2.The effect of fasudil on the growth inhibitory rate of urethral scar fibroblasts. Mean±SD.n=5.★P<0.05vsTGF-β1 group;#P<0.05vsTGF-β1+Fasu 12.5 μmol/L group;▲P<0.05vsTGF-β1+Fasu 25 μmol/L group.

圖2 法舒地爾對兔尿道瘢痕成纖維細胞的細胞存活率影響

Figure 3.The Transwell chamber assay for measuring cell migration ability. Mean±SD.n=5.★P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsTGF-β1 group;▲P<0.05vsTGF-β1+Fasu 12.5 μmol/L;●P<0.05vsTGF-β1+Fasu 25 μmol/L group.

圖3 Transwell小室遷移實驗對細胞遷移能力的測定結果

4 Western blot法檢測各組ROCK、α-SMA以及膠原蛋白I和III的表達變化

Western blot實驗結果顯示，TGF-β1誘導兔尿道瘢痕成纖維細胞的ROCK、α-SMA以及I和III型膠原蛋白表達，與對照組比較差異具有統計學顯著性(P<0.05)。法舒地爾對TGF-β1作用的尿道瘢痕成纖維細胞ROCK、α-SMA以及膠原蛋白I和III的表達有顯著抑制作用，且隨著法舒地爾濃度的升高，抑制作用逐漸增強，見圖4。

討 論

TGF-β1是一種強效的細胞趨化因子，直接或間接等方式參與尿道成纖維細胞損傷后修復，可誘導成纖維細胞活化及大量膠原等細胞外基質的過度合成和分泌[12]。同時研究表明，TGF-β1還可以誘導尿道成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞，使α-SMA的合成表達增加，其中損傷后組織的過度收縮，是由于損傷后肌成纖維細胞過度表達α-SMA形成的肌動蛋白應力纖維所致，最終導致尿道瘢痕的形成[13]。

尿道狹窄形成過程中，尿道瘢痕成纖維細胞扮演著十分重要的角色。在外界炎癥、損傷等刺激下，Rho/ROCK信號激活誘導成纖維細胞轉型為肌成纖維細胞及異常增殖，亦參與調節成纖維細胞遷移和活化，是機體各組織中普遍存在的一條信號通路[14-15]。研究發現成纖維細胞ROCK 接受Rho的活化信號后而激活，發生絲氨酸/蘇氨酸磷酸化，導致肌球蛋白輕鏈磷酸化增加，提高成纖維細胞內肌球蛋白輕鏈磷酸化水平，促使肌動蛋白聚合、重組，導致肌成纖維細胞發生收縮，在損傷早期其收縮可阻止傷口擴大，后期則導致瘢痕形成[16]。馬文東等[17]研究發現TGF-β1可介導Rho/ROCK信號轉導通路的激活，誘導肺成纖維細胞的轉化，促進膠原等細胞外基質的合成。姜大朋等[4]研究證實Rho/ROCK信號轉導通路在TGF-β1誘導尿道瘢痕組織的發生和發展中具有重要作用，參與尿道瘢痕成纖維細胞表型轉化及膠原等細胞外基質合成。汪祥海等[18]發現Rho/ROCK信號通路介導心肌成纖維細胞增殖和膠原合成。通過抑制Rho/ROCK信號通路激活是纖維化相關疾病的有效治療方法[19]。

法舒地爾目前在臨床上主要應用于預防和改善蛛網膜下腔出血術后腦血管痙攣及其引起的腦缺血癥狀。由日本60個神經外科中心共267例患者組成的研究證實法舒地爾治療動脈瘤性蛛網膜下腔出血，有癥狀的血管痙孿減少了30%，腦血管痙攣發生率降低了38%，腦血管痙攣相關的腦內低密度灶減少了58%[20]。同時研究證實法舒地爾在肺成纖維化、尿道瘢痕形成中具有顯著的作用，參與肺成纖維細胞和尿道瘢痕成纖維細胞表型轉化以及膠原等細胞外基質的合成[4, 17]。

我們通過構建新西蘭兔尿道創傷模型發現，Rho相關激酶抑制劑法舒地爾可以抑制尿道創傷后狹窄的發生，隨著給予法舒地爾治療劑量的升高，手術組新西蘭兔尿道狹窄的程度逐漸減少，且呈現劑量依賴性，對照組發生嚴重尿道狹窄。我們進一步的細胞學實驗研究證實Rho/ROCK信號通路參與兔尿道瘢痕狹窄的形成，法舒地爾對TGF-β1誘導的尿道瘢痕成纖維細胞ROCK、α-平滑肌肌動蛋白以及膠原蛋白I和III的表達、細胞活力及遷移能力具有明顯抑制作用，而TGF-β1誘導尿道瘢痕成纖維細胞ROCK、α-平滑肌肌動蛋白以及膠原蛋白I和III的表達增加，也證實了TGF-β1可以通過活化Rho/ROCK信號通路誘導尿道瘢痕成纖維細胞表型轉化以及促進細胞外基質合成。本實驗初步證實法舒地爾可以通過抑制Rho/ROCK信號通路激活減少新西蘭兔尿道創傷后狹窄發生，但Rho/ROCK信號調控尿道瘢痕形成及發展的具體分子機制有待進一步探索。

Figure 4.The protein expression of ROCK, α-smooth muscle actin (α-SMA), collagen I and collagen III. Mean±SD.n=5.★P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsTGF-β1 group;▲P<0.05vsTGF-β1+Fasu 12.5 μmol/L;●P<0.05vsTGF-β1+Fasu 25 μmol/L group.

圖4 Western blot法檢測各組ROCK、α-SMA以及膠原蛋白I和III表達的變化

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(責任編輯： 盧 萍， 余小慧)

Fasudil reduces formation of urethral stricture after injury via inhibiting Rho/ROCK pathway activation in rabbit urethra fibroblasts

XU Ning, QU Gen-yi, CHEN Shao-hao, CHEN Hui-jun, WU Yu-peng, LI Xiao-dong, LIN Yun-zhi, WEI Yong, ZHENG Qing-shui, HUANG Jin-bei, XUE Xue-yi

(DepartmentsofUrology,TheFirstAffiliatedHospitalofFujianMedicalUniversity,Fuzhou350005,China.E-mail:drxun@163.com)

AIM: To investigate the role of Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor fasudil in the formation of rabbit urethral stricture after injury and to observe the cell activity, migration and extracellular matrix synthesis in the rabbit urethra fibroblasts.METHODS: The rabbit model of urethral stricture was established by microsurgical techniques. The rabbits were divided into sham operation group, operation group and fasudil (3 mg/kg, 10 mg/kg, 30 mg/kg) groups. The diameter of the stenosis was measured by retrograde urethrography 3 months after surgery. The fibroblasts were isolated from urethral scar, and then incubated with fasudil (12.5 μmol/L, 25 μmol/L, 50 μmol/L) in the presence of transforming growth factor-β1 (TGF-β1, 10 μg/L). The untreated cells were used for control. The cell activity was measured by MTT assay. The cell migration ability was tested by the method of Transwell chambers. The protein expression of ROCK, α-smooth muscle actin (α-SMA), collagen I and collagen III was determined by Western blot analysis.RESULTS: Fasudil significantly reduced formation of urethral stricture after injury (P<0.05). Cultured rabbit fibroblasts with different concentrations of fasudil inhibited the cell activity and cell migration ability (P<0.05). The protein expression of ROCK, α-SMA, collagen I and collagen III was also inhibited by treatment with fasudil in a dose-dependent manner (P<0.05).CONCLUSION: Fasudil inhibits the formation of extracellular matrix and reduces the incidence of urethral stricture after injury by down-regulating TGF-β1-induced Rho/ROCK pathway activation in the rabbit urethra fibroblasts.

Fasudil; Rho-associated kinase; Fibroblast urethra; Urethral injury; Urethral stricture

1000- 4718(2016)12- 2266- 06

2016- 07- 25

2016- 10- 17

國家自然科學基金資助項目(No. 81400692)； 福建省衛計委中青年骨干人才培養項目(No. 2015-ZQN-JC-20)

R363； R691.6

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.12.024

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△通訊作者 Tel: 0591-87981687； E-mail: drxun@163.com