Integrin β1對胃癌細胞SGC7901多藥耐藥性的影響

邵 棋， 曹 斐， 李 梅， 張 艷

(1南通大學附屬醫院腫瘤化療科，江蘇 南通 226001； 2蘇州市立醫院北區腫瘤內科，江蘇 蘇州 215008)

Integrin β1對胃癌細胞SGC7901多藥耐藥性的影響

邵 棋1， 曹 斐2△， 李 梅1， 張 艷1

(1南通大學附屬醫院腫瘤化療科，江蘇 南通 226001；2蘇州市立醫院北區腫瘤內科，江蘇 蘇州 215008)

目的： 探究整合素β1(integrin β1)對胃癌多藥耐藥性的影響及可能的作用機制。方法:Western blot法及qPCR實驗檢測胃癌細胞株SGC-7901及胃癌耐藥細胞株SGC-7901/DDP中integrin β1的表達情況。采用integrin β1反義寡核苷酸轉染，敲減胃癌耐藥細胞株SGC-7901/DDP中integrin β1的表達，CCK-8法檢測細胞活力，流式細胞術檢測細胞凋亡，Western blot法檢測integrin β1、Bcl-2/Bax、cleaved caspase-3/caspase-3、細胞色素C(Cyt-C)和p-AKT/AKT的蛋白水平。結果:耐藥細胞株SGC7901/DDP中integrin β1的mRNA及蛋白表達水平均明顯高于親本細胞株；并且在親本細胞株SGC7901中加入順鉑、長春新堿及5-氟尿嘧啶等化療藥物刺激后，integrin β1的蛋白表達水平明顯升高。敲減integrin β1的表達可誘導胃癌耐藥細胞SGC7901/DDP的凋亡，增加細胞對化療藥物的敏感性；此外下調Bcl-2/Bax、p-AKTSer473和p-AKTThr308的蛋白水平，同時促進線粒體Cyt-C的釋放，上調cleaved caspase-3的蛋白水平。結論:敲減胃癌順鉑耐藥細胞SGC7901/DDP的integrin β1表達可恢復細胞對化療藥物的敏感性，促進細胞經線粒體路徑的凋亡，其機制可能與抑制AKT的磷酸化，阻斷該信號通路有關。

整合素β1； 胃癌； 多藥耐藥性； 細胞凋亡； AKT

胃癌是一種常見的消化系統腫瘤。隨著認知及科技的發展，目前針對胃癌的治療手段如放化療、手術治療及靶向分子療法都有了長足的進展，但其發病率及死亡率仍然居高不下，特別是腫瘤細胞耐藥性的出現，大大降低了藥物的療效[1-3]。因此，探討胃癌多藥耐藥的相關機制并尋找可以逆轉耐藥性的潛在靶點，對于提高治療效果和患者生存率具有重要的臨床意義。

腫瘤的多藥耐藥性(multidrug resistance，MDR)是指腫瘤細胞對某一化療藥物產生耐藥性之后，會對作用機制相異的其它類抗腫瘤藥物產生交叉耐藥的現象[4]。研究表明腫瘤細胞多藥耐藥的產生包括先天性和獲得性2種，但獲得性耐藥在臨床上出現的幾率較高，且其機制可能有以下幾個方面[5-10]：(1) ABC型轉運蛋白家族(ATP結合盒轉運蛋白，ATP-binding cassette transporter proteins，ABC proteins)介導的藥物外排作用增強；(2) DNA損傷修復功能加強；(3) 谷胱甘肽巰基轉移酶(glutathioneS-transferase，GST)解毒能力增強或多藥耐藥基因異常表達；(4) 細胞抗凋亡作用增強；(5) 細胞自噬活性增強及異常的微小RNA(microRNAs，miRNAs)表達等。

整合素β1 (integrin β1)是整合素家族的重要一員，該家族蛋白是介導細胞黏附和信號轉導的跨膜糖蛋白，通過傳導胞內外的信號，參與調控細胞的增殖、黏附及遷移等過程，與腫瘤的侵襲轉移及腫瘤微環境密切相關[11-12]。大量研究發現，在包括胃癌[13]、舌鱗狀細胞癌[14]、宮頸鱗癌[15]等多種實體腫瘤中都出現integrin β1的高表達，且與腫瘤的病理分級及惡性程度密切相關；此外有研究表明，integrin β1的異常表達在腫瘤的化療耐藥中起著重要的作用，Deng等[16]的研究提示integrin β1可介導腫瘤血管新生及下游AKT信號通路的活化，進而參與腫瘤EGFR TKI耐藥；而Dong等[17]的研究則表示integrin β1可通過與胞外基質的相互作用引起PI3K/AKT的持續活化，進而介導抗凋亡信號的轉導。這些研究提示integrin β1在腫瘤多藥耐藥中可能也發揮一定的作用。但是integrin β1在胃癌多藥耐藥中的作用并沒有明確的闡釋。本文通過integrin β1反義寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide, ASODN)轉染技術沉默細胞中內源性integrin β1的表達，研究integrin β1在胃癌細胞多藥耐藥中的作用及其相關作用機制。

材 料 和 方 法

1 材料與試劑

胃癌細胞株SGC-7901及胃癌耐藥細胞株SGC-7901/DDP購買于中科院上海細胞庫；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、RPMI-1640培養基及Opti-MEM培養基均購買于Gibco；LipofectamineTM2000、相關轉染試劑及SYBR Green I qPCR試劑盒由Invitrogen提供；胞漿線粒體蛋白分離試劑盒購于Thermo；COX IV抗體購于碧云天公司；抗integrin β1、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、caspase-3、細胞色素C (cytochrome C, Cyt-C)、AKT、p-AKT、GAPDH及β-actin單克隆抗體購自 Santa Cruz；CCK-8細胞活力分析試劑盒購買于Dojindo；細胞凋亡檢測試劑盒購買于凱基公司；順鉑購買于齊魯制藥公司；紫杉醇(paclitaxel, PTX)購買于海南海藥股份有限公司；5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil, 5-FU)購買于上海旭東海普藥業有限公司；其余試劑均為國產市售分析純。

2 方法

2.1 細胞培養 細胞常規培養于含10% FBS 的RPMI-1640培養基中，細胞培養箱的條件設置為37 ℃、飽和濕度、5% CO2。每2 d換液1次，每3～5 d用0.25%胰酶消化、傳代。

2.2 實時熒光定量PCR (qPCR)檢測integrin β1的mRNA表達 參照操作手冊用TRIzol一步法抽提細胞總RNA。取2 μg總RNA行逆轉錄實驗(終體積為20 μL)，采用SYBR Green qPCR方法檢測mRNA的表達。Integrin β1的正向引物為5’-AATGAAGGGCGTGTTGGTAG-3’，反向引物為5’-CTGCCAGTGTAGTTGGGGTT-3’；GAPDH作為內參照，正向引物為5’-ATGCTGGCGCTGAGTACGTC-3’，反向引物為5’- GGTCATGAGTCCTTCACGATA-3’。PCR反應體系包括1 μL RT逆轉錄產物，10 μL SYBR Green PCR Master Mix和500 nmol/L正反向引物。采用MyiQ單色實時PCR檢測系統(Bio-Rad)。反應參數為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s，40個循環。采用BANK SKAN圖像分析系統分析基因的相對表達量。

2.3 細胞化療藥物敏感性的檢測 采用CCK-8法檢測胃癌細胞化療藥物的半數抑制濃度(IC50)。取對數生長期的細胞以1×108/L密度接種于96孔板中，待細胞長至80%～90%融合時更換無血清培養基同步化12 h，然后加入終濃度分別為0、0.25、0.5、1、2、4、8、16 mg/L的順鉑、PTX或5-FU，繼續培養46 h，加入CCK-8試劑100 μL孵育2 h，測定450 nm波長處的吸光度(A)，計算細胞的生存率。

2.4 反義寡核苷酸轉染敲減integrin β1的表達 取對數生長期細胞以1×108/L密度接種于6孔板中，待細胞長至60%～80%融合時進行轉染。組別為空白對照(control，Ctrl)組、陰性對照(nonsense oligodeoxynucleotide，NSODN)組和實驗組(ASODN組)。將上述寡核苷酸分別溶解于Opti-MEM培養基中，室溫靜置5 min，為A液；另取LipofectamineTM2000，溶解于Opti-MEM培養基中，室溫靜置5 min，為B液；輕柔混合A液和B液，室溫靜置25 min，形成復合體。將復合體加入相應組別的細胞中，室溫孵育4 h后更換為正常細胞培養基繼續培養48 h。檢測轉染效率并進行后續實驗分析。integrin β1的ASODN序列為 5’-T*G*CAGTAAGCATCCAT*G*T-3’；無意義NSODN序列為 5’-G*C*AACGAGAGAGCCGT*C*G-3’。

2.5 細胞凋亡的檢測 流式細胞術檢測細胞凋亡情況，將各組細胞消化后1 000×g離心5 min收集細胞，然后加入binding buffer 重懸細胞。向細胞懸液中加入Annexin V-FITC混勻，室溫避光靜置10 min；然后加碘化丙啶(propidium iodide，PI)染液，室溫下避光染色10 min，采用流式細胞儀檢測，激發波長Ex=488 nm；發射波長Em=530 nm。

2.6 Western blot法檢測蛋白水平 收集各組蛋白樣品，其中胞漿線粒體蛋白的分離依據Thermo的線粒體分離提取試劑盒提供的說明書進行。用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量，調整各組蛋白上樣量(80 μg)后加入4倍體積的上樣緩沖液，98 ℃水浴變性5 min。上樣后采用8%的分離膠行SDS-PAGE，而后將蛋白電轉至PVDF膜(約90 min)，5%脫脂牛奶室溫封閉90 min，加入相應比例的 I 抗4 ℃孵育過夜，TBST洗滌5 min 3次；分別加入相應的抗HRP標記的 II 抗，室溫孵育90 min，TBST洗滌10 min 3次。于暗室中將PVDF膜的蛋白面浸入HRP-ECL發光液中激發熒光，壓X片、顯影并定影。實驗結果采用ImageJ灰度分析軟件進行蛋白半定量分析。

3 統計學處理

將本組研究涉及數據錄入SPSS 13.0標準版統計軟件行數據分析，實驗結果以均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用方差分析，各組均數間的兩兩比較用Bonferroni校正的t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 integrin β1的表達與胃癌細胞化療耐藥之間的關系

我們首先檢測了胃癌耐藥細胞株SGC7901/DDP及其對照親本細胞株SGC7901中化療藥物的IC50(表1)，結果證明SGC7901/DDP對不同化療藥物的耐藥性明顯強于其親本細胞株。同時我們還檢測了這2株細胞中integrin β1的mRNA及蛋白表達情況，如圖1所示，耐藥細胞株SGC7901/DDP中integrin β1的mRNA及蛋白表達水平均明顯高于親本細胞株；此外，在親本細胞株SGC7901中，加入低濃度化療藥物刺激后，integrin β1的蛋白表達水平明顯升高(圖2)，提示integrinβ1的表達可能與胃癌多藥耐藥性之間存在相關關系。

表1 胃癌細胞對化療藥物的敏感性

Table 1.The sensitivity (IC50) of GC cells to chemotherapeutics (mg/L. Mean±SD.n=6 )

CelllineCisplatinPTX5-FUSGC7901/DDP5.52±0.21*3.67±0.33*4.52±0.46*SGC79010.61±0.020.42±0.030.73±0.05

*P<0.05vsSGC7901.

Figure 1.The relationship between integrin β1 expression and multidrug resistance in the gastric cancer cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsSGC7901 cells.

圖1 integrin β1的表達與胃癌細胞多藥耐藥性之間的關系

Figure 2.The protein expression of integrin β1 was increased in the SGC7901 cells treated with chemotherapeutic agents. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol (Ctrl).

圖2 SGC7901細胞與低濃度化療藥物共培養后，integrin β1的表達升高

2 轉染效率的檢測

用qPCR和Western blot實驗檢測胃癌耐藥細胞株SGC7901/DDP轉染ASODN后integrin β1的表達情況，結果顯示轉染integrin β1 ASODN后，細胞中integrin β1的mRNA及蛋白水平明顯降低(P<0.05),見圖3。

3 敲減integrin β1對耐藥細胞株SGC7901/DDP化療敏感性的影響

為進一步證明integrin β1的表達與胃癌細胞多藥耐藥之間的相互關系，我們在耐藥細胞株SGC7901/DDP中敲減integrin β1，并檢測其對化療藥物敏感性的變化，CCK-8實驗的結果顯示，敲減SGC7901/DDP細胞的integrin β1表達后，細胞對順鉑、紫杉醇及5-FU的敏感性明顯增加，差異具有統計學顯著性(P<0.05)，見表2。

Figure 3.The expression of integrin β1 in the SGC7901/DDP cells after transfected with integrin β1 ASODN. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol (Ctrl).

圖3 SGC7901/DDP細胞轉染integrin β1 ASODN后integrin β1的表達水平

表2 敲減integrin β1可提高耐藥細胞SGC7901/DDP對化療藥物的敏感性

Table 2.Knockdown of integrin β1 increased the sensitivity (IC50) of SGC-7901/DDP cells to chemotherapeutics (mg/L. Mean±SD.n=6)

GroupCisplatinPTX5-FUControl5.56±0.213.67±0.324.54±0.46NSODN5.61±0.233.66±0.294.51±0.38ASODN1.89±0.11*1.04±0.09*2.21±0.14*

*P<0.05vscontrol.

4 敲減integrin β1對細胞凋亡的影響

接著我們考察了敲減integrin β1表達對細胞凋亡的影響，結果顯示，在SGC7901/DDP細胞中敲減integrin β1之后，早期凋亡率由(17.13±2.43)%增加至(43.29±2.48)%(P<0.05)。而中晚期細胞凋亡/壞死率由(9.37±1.02)%增加至(13.56 ± 2.43)%。抑制integrin β1的表達可明顯促進耐藥細胞的凋亡，見圖4。

5 敲減integrin β1對凋亡相關信號通路的影響

Western blot實驗的檢測結果顯示，敲減SGC7901/DDP細胞的integrin β1表達之后，抑凋亡蛋白Bcl-2及線粒體Cyt-C的表達顯著下降，而凋亡蛋白Bax、胞漿Cyt-C和激活型caspase-3的蛋白水平明顯增加，提示線粒體凋亡信號通路被激活，見圖5。

除此之外，我們還檢測了AKT信號通路的磷酸化情況，結果顯示，敲減SGC7901/DDP細胞中integrin β1的表達之后，Ser473 和Thr308位AKT的磷酸化水平顯著降低，但是對AKT總蛋白的表達沒有明顯影響，提示敲減integrin β1可抑制耐藥細胞中AKT信號通路的磷酸化活化，見圖6。

Figure 4.The effect of integrin β1 knockdown on the SGC7901/DDP cell apoptosis analyzed by flow cytometry. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol (Ctrl).

圖4 敲減integrin β1對SGC7901/DDP細胞凋亡的影響

Figure 5.The effect of integrin β1 knockdown on the mitochondrial apoptosis pathway in the SGC7901/DDP cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol (Ctrl).

圖5 敲減integrin β1 過表達對線粒體凋亡信號通路的影響

討 論

Integrin β1已被證實是一種重要的參與腫瘤細胞黏附轉移的分子，作為一類跨膜蛋白，它還介導了細胞內外信號的轉導過程，并與腫瘤獲得性耐藥的出現密切相關[13,16-17]。我們的研究發現，在胃癌耐藥細胞株SGC7901/DDP中integrin β1的mRNA和蛋白表達水平均顯著增加，且低濃度化療藥物刺激可引起SGC7901細胞中integrin β1的表達，提示integrin β1可能參與調控胃癌化療耐藥現象的發生。此外通過轉染integrin β1反義寡核苷酸敲減其表達，可提高耐藥細胞對化療藥物的敏感性。因此我們認為，integrin β1介導胃癌化療耐藥性的出現。

為進一步了解integrin β1介導胃癌化療耐藥的作用機制，我們檢測了耐藥細胞SGC7901/DDP敲減integrin β1后細胞的凋亡水平，結果發現，敲減integrin β1可促進SGC7901/DDP的凋亡。由此我們認為，敲減integrin β1提高胃癌耐藥細胞的化療敏感性可能是通過促進耐藥細胞的凋亡實現的。細胞的凋亡是一個涉及多條信號通路、調控精細復雜的過程。目前認為細胞的凋亡途徑包括死亡受體通路介導的細胞凋亡和線粒體途徑介導的細胞凋亡[18-19]。實驗中我們發現，integrin β1敲減可促進耐藥細胞中促凋亡蛋白Bax的表達，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達；同時促進線粒體細胞色素C的釋放，激活死亡蛋白酶caspase家族中的關鍵效應蛋白分子caspase 3。結果表明，沉默integrin β1提高胃癌耐藥細胞的化療敏感性可能與線粒體凋亡信號通路的激活有關。近來研究表明AKT信號通路也參與調控細胞的凋亡過程[20-21]，故而我們還檢測了integrin β1對AKT信號通路的影響，結果表明沉默integrin β1可抑制AKT Ser473及Thr308位點的磷酸化，進而阻斷AKT信號通路的活化；但是除AKT磷酸化信號通路之外，是否還有其它信號通路的參與及其具體的調控機制還有待進一步深入的研究。

Figure 6.The effect of integrin β1 knockdown on the activation of AKT. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol (Ctrl).

圖6 敲減integrin β1 過表達對AKT活性的影響

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Effect of integrin β1 on multidrug resistance in gastric cancer SGC-7901 cells

SHAO Qi1, CAO Fei2, LI Mei1, ZHANG Yan1

(1DepartmentofOncochemotherapy,AffiliatedHospitalofNantongUniversity,Nantong226001,China;2DepartmentofOncology,NorthDistrictofSuzhouMunicipalHospital,Suzhou215008,China.E-mail:drcaofei@126.com)

AIM: To study the effect of integrin β1 on multidrug resistance in gastric cancer and its possible mechanisms. METHODS: The expression of integrin β1 at mRNA and protein levels in the SGC-7901 cells and SGC-7901/DDP cells was determined by qPCR and Western blot. The expression of integrin β1 in the SGC-7901/DDP cells was silenced by antisense oligodeoxynucleotide. The cell viability was detected by the CCK-8 assay, the cell apoptosis were analyzed by flow cytometry, and the protein levels of integrin β1, Bcl-2/Bax, cleaved caspase-3/caspase-3, cytochrome C (Cyt-C) and p-AKT/AKT were determined by Western blot.RESULTS: The expression of integrin β1 at both mRNA and protein levels was significantly upregulated in SGC-7901/DDP cells. The expression of integrin β1 was increased in SGC-7901 cells treated with chemotherapeutic agents such as cisplatin, paclitaxel and 5-fluorouracil. Knockdown of integrin β1 induced apoptosis of SGC-7901/DDP cells with an increased sensitivity to the chemotherapeutic agents. Meanwhile, knockdown of integrin β1 downregulated the protein levels of Bcl-2/Bax, p-AKTSer473and p-AKTThr308, while promoted the release of Cyt-C and upregulated the protein level of cleaved caspase-3. CONCLUSION: Knockdown of integrin β1 increases the sensitivity of SGC-7901/DDP cells to the chemotherapeutic agents, and promotes the cell apoptosis via mitochondrial apoptosis pathway. The mechanism may be related to the attenuation of AKT pathway by inhibiting phosphorylations of AKT at Ser473 and Thr308.

Integrin β1; Gastric cancer; Multidrug resistance; Apoptosis; AKT

1000- 4718(2016)12- 2233- 06

2016- 07- 05

2016- 09- 27

R730.23; R735.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.12.018

雜志網址： http://www.cjpp.net

△通訊作者 Tel: 0512-62363011； E-mail： drcaofei@126.com