miR-330-5p負性調控ADAM17基因抑制人心臟微血管內皮細胞的間質轉化

鞠延玲 朱國偉 趙旭 臧雪蓮

(錦州市中心醫院，遼寧 錦州 121001)

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·論 著·

miR-330-5p負性調控ADAM17基因抑制人心臟微血管內皮細胞的間質轉化

鞠延玲 朱國偉 趙旭 臧雪蓮

(錦州市中心醫院，遼寧 錦州 121001)

目的 探討人心臟微血管內皮細胞(HCMEC)間質轉化(EndMT)過程中 miR-330-5p和ADAM17基因的表達，闡明miR-330-5p對EndMT的影響。方法培養HCMEC，應用TGF-β1誘導后，利用免疫熒光化學檢測CD31和α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)在細胞中的表達。運用生物信息學方法對miR-330-5p和ADAM17基因的配對關系進行預測。脂質體2000轉染miR-330-5p模擬物后，Real-time PCR檢測miR-330-5p、ADAM17和α-SMA mRNA的表達，Western blotting檢測ADAM17和α-SMA 蛋白的表達。結果光鏡下可見誘導后細胞由鵝卵石形態變為長梭形，免疫熒光化學顯示誘導前有強烈的CD31表達，誘導后出現α-SMA的高表達。生物信息學軟件TargetScan和miRanYda顯示miR-330-5p和ADAM17基因二者靶向配對良好。Real-time PCR和Western blotting檢測結果均表明過表達miR-330-5p能夠降低ADAM17和α-SMA mRNA及蛋白的表達。結論miR-330-5p通過下調人心臟微血管內皮細胞中ADAM17基因的表達，進而抑制TGF-β1誘導的EndMT。

微小RNA； 解整合素-金屬蛋白酶17； 內皮間質轉化； 人心臟微血管內皮細胞

解整合素—金屬蛋白酶17(ADAM 17)是ADAMs家族成員，參與多種纖維增生型疾病[1-2]，而血管內皮細胞向間質細胞轉分化(EndMT)是組織纖維化的重要途徑之一[3-5]，因此，推測ADAM 17可能作用于EndMT過程參與組織纖維化。MicroRNA(miRNA)是一類非編碼RNA，通過與靶基因mRNA 3’ 端非翻譯區(3’UTR)互補，降解目的基因并下調其表達[6]，以此參與疾病發生過程中基因表達的調控。

本研究培養人心臟微血管內皮細胞(HCMEC)，應用TGF-β1誘導發生EndMT，利用免疫熒光化學檢測CD31和α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)在細胞中的表達。運用生物信息學方法對miR-330-5p和ADAM17基因的配對關系進行預測。脂質體2000轉染miR-330-5p模擬物后，Real-time PCR檢測miR-330-5p、ADAM17和α-SMA mRNA的表達，Western blotting檢測ADAM17和α-SMA 蛋白的表達，以闡明miR-330-5p調控ADAM17基因對EndMT的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

HCMEC購自美國ScienCell公司，DMEM培養基、胎牛血清(FBS)和胰蛋白酶購自美國Hyclone公司，重組人TGF-β1 購于美國R&D公司，RNAiso for small RNA、反轉錄試劑盒、SYBRPremix Ex TaqTMⅡ和引物購自大連TaKaRa公司，兔抗人ADAM17、CD31和α-SMA抗體購于美國Santa Cruz公司。

1.2 HCMEC培養并TGF-β1誘導

HCMEC接種于培養瓶內，在孵箱中(37 ℃、5% CO2)培養，每3 d換1次液，細胞貼壁達80%左右，0.25% 胰酶消化細胞并傳代，向培養基中添加10 ng/mL TGF-β1，誘導細胞發生EndMT。

1.3 細胞免疫熒光檢測

取適量細胞涂片，10%甲醛固定后應用0.1%BSA封閉1 h，加兔抗人多克隆CD31和α-SMA抗體(1∶300)，室溫孵育1 h，PBS浸洗后，滴加二抗(1∶800)，DAPI復染細胞核。

1.4 生物信息學方法預測

運用miRNA生物信息學軟件TargetScan (http://www.targetscan.org/)和miRanda (http://www.microrna.org/)分別對miR-330-5p和ADAM17(NM_003183)基因的靶向配對關系進行預測。

1.5 細胞分組

普通常規培養HCMEC為空白對照組(control)；TGF-β1誘導HCMEC為陽性對照組(TGF-β1)；脂質體 2000轉染miR-330-5p模擬物為轉染組(mimics)；轉染后繼續應用 TGF-β1誘導為mimics +TGF-β1組。

1.6 Real-time PCR

取上述4組細胞分別加入Trizol 或RNAiso for small RNA提取總mRNA或總miRNA，應用反轉錄試劑盒反轉錄得到cDNA，稀釋后加入SYBRPremix Ex Taq Ⅱ和引物，見表1，跑40 個循環的PCR 反應，應用軟件對反應結果進行分析。

表1 引物序列

1.7 Western blotting

取上述4組細胞分別加入RIPA裂解液充分震蕩后，超聲破碎，4 ℃離心20 min，采用BCA法測定樣品總蛋白量。取15 μL 樣品SDS-PAGE分離后轉膜，應用4% BSA封閉1 h，加入兔抗人多克隆ADAM17和α-SMA抗體(1∶300)，4 ℃過夜后，滴加二抗(1∶800)，4 ℃搖床1 h后凝膠成像系統ECL發光顯影。

1.8 統計學處理

2 結 果

2.1 細胞形態學觀察

倒置相差顯微鏡下可見誘導前(control)HCMEC均勻分布，呈鵝卵石形態；經TGF-β1誘導后細胞形態伸長，呈長梭形，排列較松散。免疫熒光化學顯示誘導前細胞內有強烈CD31蛋白表達，顯示紅色熒光；經TGF-β1誘導后出現α-SMA的表達，呈現綠色熒光，CD31蛋白仍有表達。見圖1。

圖1 誘導前后細胞形態學觀察

2.2 miR-330-5p和ADAM17的配對關系

分別運用TargetScan和miRanda對miR-330-5p和ADAM17基因的靶向配對關系進行預測，TargetScan顯示miR-330-5p在ADAM17 mRNA 3’UTR上有一個保守的靶位點，其類型為7mer-m8，匹配得分為92。miRanda結果表明miR-330-5p與靶位點的mirSVR 得分為-0.980 3，綜合兩個生物信息學軟件預測結果可以看出miR-330-5p與ADAM17基因配對良好。見表2。

表2 miR-330-5p 與ADAM17基因配對關系

2.3 Real-time PCR檢測結果

應用Real-time PCR對各組細胞進行檢測，發現如果將control組細胞miR-330-5p的表達量設定為1，則mimics組和TGF-β1組分別是control組的(30.77±7.62)和(0.23±0.06)倍，差異有統計學意義；而mimics +TGF-β1組是control組的(12.47±4.06)倍，與TGF-β1組比較差異有統計學意義。如果將control組ADAM17的表達量設定為1，則mimics組和TGF-β1組分別是control組的(0.17±0.04)和(19.68±5.81)倍，差異有統計學意義；而mimics +TGF-β1組是control組的(0.71±0.19)倍，與TGF-β1組比較差異有統計學意義。如果將control組α-SMA的表達量設定為1，則TGF-β1組是control組的(20.59±6.32)倍，差異有統計學意義。見圖2。由此可見，miR-330-5p通過下調ADAM17基因表達能夠抑制TGF-β1誘導的EndMT過程。

圖2 基因在各組中的相對表達水平(*P<0.05,**P<0.05)

2.4 Western blotting檢測結果

應用Western blotting對各組細胞進行檢測，條帶結果顯示ADAM17蛋白表達量在mimics組最低，可見miR-330-5p的過表達能直接抑制ADAM17蛋白的生成，而在TGF-β1組最高，表明ADAM17參與TGF-β1誘導的EndMT過程，且可作為間質轉化程度的標志。間質細胞標記物α-SMA蛋白在TGF-β1組最高，表明TGF-β1成功誘導HCMEC發生EndMT。隨著miR-330-5p轉染進細胞，α-SMA表達量有所下降，表明miR-330-5p的過表達間接抑制TGF-β1誘導的EndMT。見圖3。這顯示了miR-330-5p通過負性調控ADAM17基因表達能抑制TGF-β1誘導的EndMT。

圖3 ADAM17和α-SMA蛋白的表達水平

3 討 論

研究發現肌成纖維細胞是組織器官纖維化的主要效應細胞[7-8]，而內皮細胞向間質細胞轉分化(EndMT)是纖維化組織肌成纖維細胞的重要來源。Zeisberg 等[9]發現大約 30%活化的成纖維細胞是由內皮細胞間質轉化形成的，進一步研究發現，骨形態發生蛋白7(BMP-7)可抑制 TGF-β1 誘導的人冠狀動脈內皮細胞EndMT過程，改善小鼠心肌纖維化程度。本研究發現采用TGF-β1能夠成功誘導HCMEC發生EndMT，倒置相差顯微鏡下可見誘導前HCMEC均勻分布，呈鵝卵石形態；經TGF-β1誘導后細胞形態伸長，呈長梭形，排列較松散。免疫熒光化學顯示誘導前細胞內有強烈CD31蛋白表達；經TGF-β1誘導后出現α-SMA的高表達。Real-time PCR結果顯示誘導后有ADAM 17蛋白的高表達，提示其或可作為間質轉化程度的標志。

MicroRNA作為非編碼RNA，其長度大約為21～25nt，與EndMT過程密切相關。Thum 等[10]發現在心肌纖維化模型小鼠內皮細胞中敲除 miR-21，能夠顯著減少α-SMA陽性細胞數，并能夠降低Ⅰ型膠原蛋白和纖維連接蛋白的表達。Kumarswamy 等[11]進一步研究發現miR-21能夠通過調控 PTEN/Akt 信號通路，參與EndMT過程。本研究運用生物信息學方法對miR-330-5p和ADAM17基因的靶向配對關系進行預測，發現二者匹配良好。應用Real-time PCR對各組細胞進行檢測，發現誘導后內源性miR-330-5p顯著降低而ADAM17蛋白顯著升高；通過對mimics組數據分析發現miR-330-5p模擬物轉染成功同時ADAM17蛋白低表達，以上均表明miR-330-5p能夠靶向作用于ADAM17 蛋白并抑制其表達。分析α-SMA在各組中的表達量，發現誘導后其顯著升高，表明HCMEC發生EndMT；而轉染miR-330-5p模擬物后，無論誘導與否，其表達量與control組比較差異無統計學意義，表明miR-330-5p并不直接作用于α-SMA蛋白，但其過表達能夠抑制HCMEC的EndMT，Western blotting結果進一步印證了以上結論。由此可見，miR-330-5p通過下調ADAM17基因表達能夠抑制TGF-β1誘導的EndMT過程。

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MiR-330-5p down-regulated ADAM17 expression in human cardiac microvascular endothelial cells and inhibited endothelial-to-mesenchymal transition

JuYanling,ZhuGuowei,ZhaoXu,ZangXuelian.

JinzhouCentralHospital,Jinzhou121001,Liaoning,China.

Objective To identify expressions of miR-330-5p and ADAM17 in human cardiac microvascular endothelial cells (HCMEC) and explore the role of miR-330-5p on endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT) which may regulate ADAM17 expression. Methods HCMEC were purchased and then cultured in vitro. Cell morphology was observed with phase contrast microscope and expressions of CD31 and α-SMA in HCMEC were determined by immunofluorescence cytochemistry. MiR-330-5p which may regulate ADAM17 expression was predicted by bioinformatics. After transfection of miR-330-5p mimics into cells, the expressions of miR-330-5p, ADAM17 and α-SMA were determined by real-time PCR and western blotting (WB). Results Before the induction of TGF-β1 in HCMEC, CD31 expression was positive. However, α-SMA was found after the induction by immunofluorescence cytochemistry. Real-time PCR and western blotting was showed over-expression of miR-330-5p down-regulated ADAM17 and α-SMA expressions. Conclusion MiR-330-5p down-regulated ADAM17 expression in HCMEC and then inhibit EndMT.

miRNA； ADAM17； EndMT； HCMEC

R331.3

A

1000-744X(2016)10-1011-04

2016-06-10)