香虎清婦炎顆粒對子宮肌瘤模型大鼠影響的實驗研究

韓云霞 李德鑫 趙海

(1.貴陽中醫學院第二附屬醫院藥學部，貴州 貴陽550003；2.貴陽職業技術學院，貴州 貴陽550081)

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香虎清婦炎顆粒對子宮肌瘤模型大鼠影響的實驗研究

韓云霞1#李德鑫2#趙海1△

(1.貴陽中醫學院第二附屬醫院藥學部，貴州 貴陽550003；2.貴陽職業技術學院，貴州 貴陽550081)

目的 研究香虎清婦炎顆粒(XHQFYKL)對子宮肌瘤的治療作用，探討其部分作用機理，為其臨床應用提供實驗依據。方法給大鼠肌注雌激素及孕激素造成子宮肌瘤模型，觀察XHQFYKL對大鼠子宮肌瘤的病理增生、肌瘤組織中孕激素受體(PR)和雌激素受體(ER)表達的影響，從而探討XHQFYKL治療子宮肌瘤的作用機制。結果XHQFYKL有調節卵巢激素的作用，并可抑制子宮平滑肌的增生，能顯著減少肌瘤組織中ER、PR的含量。結論XHQFYKL可通過調節卵巢激素治療子宮肌瘤。

香虎清婦炎顆粒； 子宮肌瘤; 雌激素受體; 孕激素受體

子宮肌瘤是女性生殖系統中較常見的良性腫瘤，也是導致女性切除子宮的重要因素之一。據臨床統計，育齡期婦女子宮肌瘤的發病率在20%～25%[1]。目前臨床治療子宮肌瘤多以手術治療為主，但手術治療往往具有一定的適應證，且患者的接受程度也限制了其應用，常規的藥物治療大多療效欠佳[2]。米非司酮是臨床中常用于治療子宮肌瘤的新型抗孕激素，能與孕酮受體及糖皮質激素受體結合，可使子宮肌瘤體積明顯縮小[3]。但臨床研究發現米非司酮有較多的不良反應，且治療后常易復發[4]。該病屬中醫癥瘕范疇，因患者氣血不和、血瘀凝滯及久瘀成癥等因素而引發。我們認為子宮肌瘤正氣虛弱是病變基礎，血瘀胞宮是病變本質，氣虛血瘀是子宮肌瘤的主要病機。香虎清婦炎顆粒是經貴陽中醫學院第二附屬醫院治療子宮肌瘤的經驗方香虎湯加工制備而得，在臨床使用有效的基礎上，通過實驗進一步驗證。

本研究以雌激素及孕激素造成子宮肌瘤模型，選以具有相近作用的桂枝茯苓膠囊(GZFLJN)為陽性對照。研究香虎清婦炎顆粒對其的干預，觀察子宮形態學改變，以及對血清雌二醇(E2)、孕酮(P)水平的影響，子宮系數及子宮橫徑的影響，XHQFYKL對大鼠子宮肌組織中ER、PR表達水平的影響，探討XHQFYKL治療子宮肌瘤的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物

香虎清婦炎顆粒(XHQFYKL)由貴州順健制藥有限公司提供，5 g×10袋/包，批號140601；桂枝茯苓膠囊(GZFLJN)：0.31 g/粒，購自江蘇康緣藥業股份有限公司，批號Z130801；已烯雌酚注射液：2 mg/1 mL，購自廣州明興制藥廠，批號MB130201；黃體酮注射液：20 mg/1 mL，購自浙江仙琚制藥股份有限公司，批號121201。

1.2 試驗試劑

雌二醇放射免疫分析藥盒、孕酮放射免疫分析藥盒購自天津九鼎醫學生物工程有限公司；兔抗大鼠ER、PR多克隆抗體、即用型鏈霉素親和過氧化物酶復合物(SABC)免疫組化試劑盒、DAB顯色劑由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.3 實驗動物

SD大鼠,雌性,體質量180 ～220 g，合格證號SCXK(黔)2010-0001。

1.4 方法

1.4.1 分組及給藥 取SD大鼠72只，隨機分為6組，每組12只，即正常對照組、模型組、XHQFYKL低[0.375 g/(kg·d)]、中[(0.75g/(kg·d)]、高[(1.125 g/(kg·d)]劑量組、陽性藥對照組[(桂枝茯苓膠囊0.3 g/(kg·d)]。模型組及各給藥組大鼠隔日肌注已烯雌酚0.04 mg/只，另每周肌注黃體酮1 mg/只；對照組大鼠隔日肌注花生油0.1 mL/只，共20周。造模第11周起，各給藥組及陽性藥對照組按上述劑量分別灌胃給予XHQFYKL及GZFLJN；模型組、正常對照組灌胃給予蒸餾水2 mL/只，每天1次，每周6 d，連續10周。

1.4.2 觀察指標 實驗期間觀察動物的一般狀況。實驗開始至第20周結束后，股動脈取血并處死動物。取血及子宮進行以下指標檢查：(1)血清雌二醇、孕酮： 取血，靜置后分離血清，放免法測雌二醇、孕酮水平。(2)子宮系數、子宮橫徑： 取子宮，電子天平稱重，計算子宮系數(子宮重量 mg/大鼠體質量 g)，游標卡尺測量子宮分角下(子宮頸以上)及分角根部(一側分角子宮根部)橫徑。(3)病理組織檢查：對各組大鼠子宮進行肉眼觀察，再取子宮分角以上相同部位0.5 cm一段子宮，中性福爾馬林固定，石蠟包埋切片，HE染色，光鏡下行子宮組織病理檢查。

1.4.3 免疫組化方法 檢測ER和PR在子宮內膜的表達。結果判定標準： ER和PR陽性表達主要定位于局部組織的表面上皮細胞、腺上皮細胞及間質細胞的胞漿，陽性效應產物為棕黃色顆粒。采用Fromowitz組織化學評分法(H-score)[5]，每張切片隨機選擇5個不同的高倍視野(×400)，據染色程度(淺、中、深)及范圍分別計分，進行結果判定。染色程度：0分，細胞無著色記；1分，細胞輕度著色呈淡黃色記；2分，細胞著色呈棕黃色記；3分，細胞明顯著色呈棕褐色記。染色范圍：0分，染色范圍<5%；1分，染色范圍5%～25%；2分，染色范圍25%～50%；3分，染色范圍>50%。累積上述計分判定結果，0～1分為陰性(-)；2～3分為弱陽性(+)；4～5分為陽性(++)；6分為強陽性(+++)。

1.5 統計學處理

2 結 果

2.1 XHQFYKL對血清雌二醇(E2)、孕酮(P)水平的影響

模型組血清E2、P水平均明顯增高，與正常對照組比較，差異有統計學意義(P<0.01)。XHQFYKL各治療組給藥后血清E2、P水平與模型組比較差異有統計學意義(高、中劑量組P<0.01，低劑量組、GZFLJN組P<0.05)。見表1。

注：與對照組比較，▲P<0.01；與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01。

2.2 XHQFYKL對子宮系數及子宮橫徑的影響

模型組子宮重量增加，子宮系數增大，與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.01)。XHQFYKL灌胃給藥可不同程度降低子宮系數，與模型組比較，差異有統計學意義，XHQFYKL高、中劑量組(P<0.01)，低劑量組(P<0.05)。見表2。模型組子宮分角下及分角根部宮橫徑較對照組增加(P<0.01)；XHQFYKL各治療組兩處子宮橫徑均小于模型組，差異有統計學意義(高劑量組P<0.01，中劑量組、GZFLJN組P<0.05)。見表3。

組別劑量/(g/kg)動物數/只子宮重量/mg子宮系數/(mg/g)正常對照組—11719.88±163.292.95±0.65模型組—111652.15±296.15▲7.47±1.46▲低0.375111486.76±164.07*7.04±0.81*XHQFYKL組中0.75121465.61±93.58**5.89±0.66**高1.125121191.90±137.36**5.33±0.54**GZFLJN組0.3101520.75±58.817.22±0.51

注：與對照組比較，▲P<0.01；與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01。

組別劑量/(g/kg)n分角下子宮/cm分角根部子宮/cm正常對照組-110.63±0.140.30±0.06模型組-111.05±0.16▲0.49±0.06▲低0.375110.94±0.14**0.45±0.05XHQFYKL組中0.75120.85±0.12*0.41±0.05*高1.125120.78±0.09**0.36±0.05**GZFLJN組0.3100.85±0.07**0.42±0.07*

注：與對照組比較，▲P<0.01；與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01。

2.3 組織形態學影響

肉眼觀察模型組子宮較正常對照組體積增大，質地厚實，呈暗紅色，部分區域水腫呈空泡狀。治療組子宮體積、顏色與正常對照組接近，呈鮮紅色。

鏡下觀察模型組子宮肌纖維明顯增生肥大，肌層明顯增厚，肌纖維排列紊亂，呈輕微編織狀，出現穿插現象，病變近似平滑肌瘤樣增生。見圖1。正常對照組子宮肌層薄,肌纖維無增生肥大,內環肌、外縱肌規則排列，見圖2。XHQFYKL高、中劑量組子宮肌層明顯變薄,肌纖維細長或稍肥大,排列規則,偶見或未見內環肌和外縱肌穿插現象。見圖3，4。

圖1 模型組 (HE×100) 圖2 正常對照組 (HE×100)

圖3 高劑量組 (HE×100) 圖4 中劑量組 (HE×100)

2.4 XHQFYKL對大鼠子宮肌組織中ER表達的影響

對照組子宮內膜有大量ER陽性表達；模型組ER表達量略低于對照組，差異無統計學意義(P>0.05)，在子宮內膜上皮細胞、腺體上皮細胞和間質細胞的胞漿中都可見棕黃色顆粒狀或絲網狀陽性表達產物；XHQFYKL高、中、低劑量組ER表達量均明顯降低，僅部分細胞有少量棕黃色表達，與模型組比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

組別nER-++++++Z值對照組111640-模型組1134400.000GZFLJN組105500-2.090△高劑量組128400-2.494△中劑量組127410-2.140△低劑量組116410-2.084△

注：與模型組比較，△P<0.05。

2.5 XHQFYKL對大鼠子宮肌組織中PR表達的影響

對照組子宮內膜有PR表達；模型組PR表達量略低于對照組，但差異無統計學意義(P>0.05)，在表面上皮細胞、間質細胞和腺體的上皮細胞的胞漿中都可見棕黃色顆粒狀或絲網狀陽性表達產物；XHQFYKL高、中、低劑量組PR表達量均較模型組明顯降低，僅部分細胞有少量棕黃色表達，差異有統計學意義(P<0.05)。見表5。

組別nER(-)(+)(++)(+++)Z值對照組112540-模型組113620-0.505GZFLJN組106400-2.182△高劑量組128400-2.248△中劑量組127500-1.996△低劑量組117310-2.060△

注：與模型組比較，△P<0.05。

3 討 論

傳統認為雌激素有誘發并促進子宮肌瘤生長的作用，生物化學測定證實，子宮肌瘤較正常肌層中雌二醇(E2)的濃度明顯增高, E2向雌酮(E1)的轉化率也低于正常肌組織，提示局部高E2環境的存在可刺激肌瘤的生長[6]。近年來發現孕激素在子宮肌瘤的發生、發展中也有重要作用。分子生物學技術證實,子宮平滑肌瘤組織孕激素受體蛋白和孕激素受體mRNA表達水平比鄰近肌層增加,增殖抗原Ki-67明顯升高,提示增強的孕激素受體介導的信號與肌瘤生長有關。雌、孕激素與其相應受體結合發揮生物學作用,雌激素和孕激素通過自分泌或旁分泌互相調節,雌激素和孕激素的聯合作用使細胞DNA合成及有絲分裂能力進一步增強[7]。孕激素可提高子宮肌瘤細胞上的雌激素受體含量,并通過提高上皮生長因子樣蛋白和上皮生長因子受體的含量,間接刺激子宮肌細胞的增生[8]。本實驗通過給予大鼠注射外源性雌、孕激素，HE染色顯示子宮平滑肌層增生,平滑肌排列紊亂,細胞增大,病理改變與人子宮肌瘤病理組織學結構類似,子宮系數增大，子宮橫徑增粗，說明模型成功。本模型的成功也說明了高水平雌、孕激素是子宮肌瘤發生的主要原因之一。造模后予XHQFYKL進行治療，并以桂枝茯苓膠囊作為對照進行實驗，通過對子宮系數、子宮橫徑以及組織病理變化對比發現XHQFYKL能抑制子宮平滑肌瘤樣增生。檢測血清雌、孕激素水平，結果顯示，XHQFYKL有調節雌、孕激素的作用，這可能是其治療子宮肌瘤的機制之一。

子宮肌瘤是雌激素敏感性腫瘤，多見于性激素功能活躍的育齡婦女，少見于絕經后婦女。臨床發現當給予外源性雌激素或妊娠時，子宮肌瘤迅速增大；而絕經后出現的低雌二醇(E2)、低孕酮(P)狀態則可引起肌瘤的縮小甚至消失。故長期以來雌激素一直被認為是子宮肌瘤發生和發展的促進劑。激素主要的生物學效應是靠與受體結合后才能得以實現。靶組織保留激素的多少取決于其細胞內相應受體的含量；在同一激素水平下，激素在靶組織中產生生物學效應的強弱也取決于靶細胞受體的含量，說明肌瘤的生長與ER、PR的水平密切相關。

本實驗結果顯示，大鼠模型組子宮肌組織均有ER、PR表達，但表達量略低于對照組。ER、PR受雌激素調節，雌激素上調ER與PR的表達，孕激素對ER與PR有降調作用。XHQFYKL高、中、低劑量組子宮肌組織中ER、PR表達較模型組均明顯減少，表明降低子宮肌瘤組織中ER、PR的表達水平是XHQFYKL治療子宮肌瘤的可能機制之一。

[1] 張桂珍.子宮肌瘤的中醫藥治療概況[J].中國社區醫師：醫學專業，2010(3):7.

[2] 許玉釵.活血散結湯治療子宮肌瘤40例[J].河南中醫，2015(5):1110-1112.

[3] Himabindu Y,Sriharibabu M,Nyapathy V,et al.Early evaluation of magnetic resonance imaging guided focused ultrasound sonication in the treatment of uterine fibroids[J].Indian J Med Res,2014,139(2):267-272.

[4] 耿中花.小劑量米非司酮治療子宮肌瘤療效觀察[J].山東醫藥，2011 (18):89.

[5] Fromowitz FB，Viola MV，Chao S，et al.Ras p21 expression in the progression of breast cancer[J].Hum Pathol，1987，18：1268-1275.

[6] 龍梅,姚麗艷.子宮肌瘤的病因學研究進展[J].中國婦產科臨床雜志，2006(3):229-230.

[7] 秦保鋒,張婷婷.子宮肌瘤發病相關因素研究進展[J].現代診斷與治療，2005(4):231.

[8] 王立群，趙靜，趙秀芝.子宮肌瘤中IGF-1受體的變化及其與雌、孕激素受體的關系[J].中國婦幼保健，2010(36):5389-5390.

讀者·作者·編者

醫學出版物中部分約定俗成的字詞

(1)“癥”：用于“癥狀”、“并發癥”、“病癥”。(2)“證”：用于“適應證”、“禁忌證”、“證候”。(3)“征”：用于“綜合征”、“體征”、“指征”、“征象”。(4)“堿”：用于“酸堿平衡”、“堿性磷酸酶”、“氨茶堿”，不用“鹼”。(5)“瘀”：用于“瘀血”、“瘀斑”、“瘀點”，不用“淤”字，中醫使用“瘀”、西醫多用“淤”。

貴州醫藥雜志社

Xiang Hu Qing Fu Yan granule experimental study of the effect of the granule on the model of uterine leiomyoma in rats

HanYunxia1#,LiDexin2#,ZhaoHai1.

1.PharmacyDepartment,theSecondAffiliatedHospitalofGuiyangCollegeofTraditionalChineseMedicine,Guiyang550001,Guizhou,China. 2.PharmaceuticalLaboratoryofCareerTechnicalCollegeGuiyang，Guiyang550081,Guizhou,China.

Objective To study the fragrant tiger clear therapeutic effect of Fuyan particles (XHQFYKL) on uterine myoma and to explore the action mechanism and for its clinical application to provide experimental basis. Methods Rats intramuscular injection of estrogen and progesterone caused by uterine myoma model to observe XHQFYKL on rat uterine smooth muscle tumor pathological proliferation, leiomyoma progesterone receptor (PR), the effect of expression of estrogen receptor (ER), so as to explore the mechanism of treatment of uterine fibroids XHQFYKL. Results XHQFYKL there was the role of regulation of ovarian hormones, and can inhibit the proliferation of uterine smooth muscle, can significantly reduce the amount of PR, ER in the uterine leiomyoma tissue.Conclusion XHQFYKL can regulate ovarian hormone treatment of uterine fibroids.

XHQFYKL； Uterine leiomyoma； Estrogen receptor； Progesterone receptor

貴州省科技廳中藥現代化科技產業研究開發專項項目[黔科合中藥字(2013)5015號

R737.33

A

1000-744X(2016)10-1028-04

2016-07-11)

#均為本課題主要負責人

△通信作者,E-mail:670082381@qq.com