MEV滅活疫苗免疫后雞蛋卵黃抗體消長規律的探究

王小柱

（遼寧省畜產品安全監察所，遼寧 沈陽 110003）

MEV滅活疫苗免疫后雞蛋卵黃抗體消長規律的探究

王小柱

（遼寧省畜產品安全監察所，遼寧 沈陽 110003）

為了解產蛋雞在疫苗接種后卵黃抗體濃度和效價的消長規律，本試驗以商品化水貂病毒性腸炎病毒（MEV）滅活疫苗免疫成年海蘭褐蛋雞。經免疫后，采集雞蛋樣本，通過水溶法提取卵黃抗體，經硫酸銨兩步沉淀，透析純化，過濾除菌后制得純凈的卵黃抗體。結果顯示，水溶法制備的卵黃抗體純度為60%～80%，得率為60%，免疫后抗體濃度和效價迅速上升，到30 d達到峰值而后逐步下降，在120 d內二者消長規律基本一致。至150～180 d時抗體濃度下降為峰值的50%，而此時其HI效價已與陰性組相差不大。因此一免后150 d內卵黃抗體滴度有良好的保護作用。

水貂病毒性腸炎病毒；卵黃抗體；濃度；效價；消長規律

水貂病毒性腸炎（Mink enteritis）是危害毛皮動物養殖的三大疫病之一，其病原是水貂病毒性腸炎病毒（mink enteritis parvovirus，MEV）。水貂、狐貍、貉等毛皮動物普遍易感，幼獸致死率可達80%～100%[1]。20世紀80年代在我國首次發現，呈群發性流行，目前尚無特效的治療藥物，疫苗接種是有效的的預防手段。但臨床上MEV的滅活疫苗只能誘發體液免疫應答，近年來人們開始尋求新的替代性免疫方案。隨著生物制品技術的迅速發展，卵黃抗體技術因其價格低廉、技術簡單、便于推廣等優點而進入人們的視野[2]。

卵黃抗體（Immunoglobulin of yolk，IgY）是一類在禽類動物體內廣泛存在的特異性免疫球蛋白，伴隨血液循環在卵巢中富集蓄積并最終進入卵黃[3]。IgY具有良好的穩定性，可耐熱、耐酸和抗酶解，在4℃條件下貯存6～7年活性僅下降5%，室溫貯存6個月活性無明顯下降，在-20℃條件下可長久保存。目前，在臨床生產上多采用水溶法（water dilution，W.D.）提取卵黃抗體[4]。

研究證實，疫苗接種蛋雞后可迅速產生相應卵黃抗體，但對于免疫后卵黃抗體的消長規律還不熟知[4]。本研究中，利用MEV商品化滅活疫苗免疫背景清晰的海蘭褐蛋雞，在一免后180 d內對卵黃抗體水平進行了采樣監測，繪制出IgY抗體濃度和效價消長規律曲線，為MEV卵黃抗體相關生物制品的臨床生產和蛋雞制定免疫程序提供了理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料免疫抗原：MEV商品化滅活疫苗（購自齊魯動物保健品有限公司，生產批號：1312071）。試驗動物：空白免疫背景的海蘭褐115日齡蛋雞20只。主要儀器和試劑：30%聚丙烯酰胺溶液、β巰基乙醇、考馬斯亮藍、1%豬紅細胞、血凝板、UV-9200紫外分光光度計、電泳儀等。

1.2 方法

1.2.1 蛋雞免疫 將20只120日齡待產空白免疫背景的海蘭褐蛋雞分為MEV疫苗免疫組、陰性對照組2組，每組10只，在封閉環境中飼養至開產。采用多點肌肉（胸肌、股內側?。┳⑸涞姆椒ǚ謩e接種MEV商品滅活疫苗和生理鹽水，1 mL/次，一免后進行樣本采集，見表1。

表1 海蘭褐蛋雞免疫方案Table1 The immunization program of Hyline Brown hens

1.2.2 雞蛋采集與處理 樣品采集時間點分別為免疫0、7、14、21、30、60、90、120、150和180 d，做好標記，置于4℃備用。

1.2.3 卵黃抗體的提取 水溶法提取卵黃抗體具體步驟如下。

1.2.3.1 水溶法溶解IgY 用酒精棉球將蛋殼表面擦拭干凈并用75%酒精噴灑消毒。在無菌條件下，打開蛋殼小心剝離蛋黃，用量筒測定蛋黃體積。按照蛋黃體積:生理鹽水=1:9的比例進行稀釋，在4℃條件下攪拌過夜。次日用1M鹽酸調節pH至5.5～5.7，并加入少量氯仿，攪拌至乳濁狀態。隨后將乳濁液轉入離心管，在5 000 r/min條件下離心10 min，吸取上清棄沉淀。

1.2.3.2 硫酸銨兩部沉淀法粗提IgY 上清緩慢加入飽和硫酸銨至50%飽和度，攪拌均勻后4℃靜置2 h。在6 000 r/min條件下離心15 min，收集沉淀棄上清。用生理鹽水重懸沉淀至原蛋黃體積，加入飽和硫酸銨至33%飽和度，4℃靜置2 h， 5 000 r/min條件下離心10 min，收集沉淀。

1.2.3.3 IgY除鹽除菌 加入適量生理鹽水至完全溶解沉淀，置于透析袋中透析除鹽，用萘氏試劑檢測直至銨根離子（NH4+）完全除盡。將透析過的卵黃液用0.22 μm濾膜過濾除菌，4℃儲存備用。

1.2.4 卵黃抗體濃度檢測

1.2.4.1 紫外分光光度法測定IgY含量 因制備的IgY濃度過高，故將其稀釋100倍，分別測定OD260、OD280吸光度值，帶入下列公式：

當OD280/OD260＜1.5時，用Lowry-Kalokar公式：樣本蛋白質含量（mg/mL）＝1.45OD280-0.74OD260

當OD280/OD260＞1.5時，用Lamber-Beer定律計算：樣本蛋白質含量（mg/mL）=OD280/K×L=（OD280/ 6.3×1）×10 g/L

其中，K：克分子消光系數；E1%cm：百分比吸光度的吸光系數；牛血清白蛋白E1%cm=6.3（100 mL/（cm.g））。計算出提純IgY濃度。繪制抗體濃度變化曲線。

1.2.4.2 考馬斯亮藍結合法測定IgY濃度 將IgY樣品稀釋100倍，放入50 mL離心管，加入5 mL考馬斯亮藍G-250溶液，充分混合，放置2 min后在595 nm下比色，測定吸光度，并通過標準曲線查得蛋白質含量。按照如下公式計算：

蛋白質含量（mg/g）=（C·VT）/(1000 VS·WF)

其中，C：查的標準曲線值（μg）；VT：提取液總體積（mL）；WF：樣品鮮重（g）；VS：測定時加樣量（mL）。計算出提純IgY濃度。

1.2.5 卵黃抗體效價測定 HA/HI試驗：采用血凝（HA）方法測出該MEV病毒血凝效價為1:256；依據血凝效價配制4血凝單位（即1:56）的MEV病毒液，采用固定病毒稀釋血清的方法，將IgY在血凝板上依次做2倍倍比稀釋，測定血凝抑制（HI）效價。

2 結果和分析

2.1SDS--PPAAGGEE檢測提取純化的IIggYY SDS-PAGE檢測結果表明，水溶法提取IgY效果良好。在變性條件下，IgY解鏈形成重鏈（67 kD）和輕鏈（35 kD）。Quality One凝膠定量軟件分析得目的蛋白條帶占泳道總蛋白在60%～80%之間。見圖1。

圖1 IgY SDS-PAGE電泳圖提取純化Fig.1 Extraction and purification of IgY by SDS-PAGE

2.2提取IIggYY濃度測定結果表明，紫外分光光度法和考馬斯亮藍法測得三組IgY濃度基本一致，前者比后者測量值稍高。一免后IgY濃度迅速上升，21～30 d時濃度達到頂峰，并維持高濃度至100 d，隨后開始逐漸下降。至150 d時抗體濃度趨于穩定，約為峰值濃度的50%，到180 d時濃度變化不大。陰性對照組IgY水平始終保持在極低水平。見圖2和圖3。

2.3IgY效價測定透析后IgY溶液進行HI效價測定，結果表明，免疫后IgY HI效價迅速升高，至30 d時達到峰值，為1:256～1:512。而后開始逐步下降，120 d時，HI效價下降為1:64～1:128此時IgY HI效價仍可保持在有效保護水平（HI≥1:64）。在150 d時，HI效價迅速下降為1:4～1:16之間。180 d時與對照組已無差別。見圖4。

綜上，成功運用水溶法提取制備了較高濃度雞蛋的卵黃抗體，得率在60%～80%，同時得到免疫后IgY濃度和效價的消長規律和曲線。免疫后抗體濃度和效價迅速上升，30 d到達峰值。后迅速下降，在120 d內二者消長規律基本一致。至150～180 d時抗體濃度下降為峰值的50%，而此時其HI效價已與陰性組相差不大。

圖2 紫外分光光度法測定IgY濃度Fig.2 Determination of IgY concentration by UV Spectrophotometry

圖3 考馬斯亮藍結合法測定IgY濃度Fig.3 Determination of IgY concentration by Kaumas blue method

圖4 IgY抗體血凝抑制（HI）效價Fig.4 The HI tilter of IgY

3 討論和結論

卵黃抗體技術最初起源于1898年Klemperer的經典免疫學試驗，在1995年由Staak C.首次作為專業術語提出，在20世紀末這一技術得到迅速發展，并逐步應用于動物IgG制品的替代和抗生素的輔助治療[5]。

目前臨床大規模生產IgY產品多采用水溶法（W.D.），成本低廉而且回收率在50%左右。參照Ko K.Y.等報道的用硫酸銨沉淀法提取IgY的方法[6]，本試驗中對水溶法提取IgY做了適當改進，增加了除脂時調節pH至5.4～5.7，并加入少量氯仿，4℃靜置等步驟，在中速5 000 r/min離心10 min即可分離出澄清上清。pH對于IgY提取效果影響明顯，只有當pH調至為5.4～5.7時，脂蛋白聚集成白色絮狀物懸浮在液體上層，中低速離心后即可分離除去。而在其他pH，離心5 000～8 000 r/min時，仍呈現為乳濁狀態，4℃靜置過夜后亦不能分層。這可能與脂蛋白的等電點（pI 5.0～5.2）有關，這可作為除脂重要條件之一。

正常雞的IgY分子量約為180 kD，由兩條輕鏈和兩條重鏈組成，SDS變性條件下分子量分別為重鏈60～70 kD和輕鏈 20～30 kD[4]。本試驗中，SDS-PAGE結果與上述結論一致。

在IgY濃度上，紫外分光光度法和考馬斯亮藍結合法測得濃度結果基本一致。Larsson A等測得一免后雞蛋中約有100 mg IgY，可作為被開發的高效生物制品試劑應用于疾病的診斷和治療中。Patterson認為，雞抗體動力學與哺乳動物相似[5]。通常認為IgY半衰期較IgG短，濃度變化也較快。然而也有研究表明IgY能夠維持高濃度達數周之久[6]。在本試驗中，IgY濃度迅速升高至波峰后，維持在較高水平達數周之久，與后者結果一致。

在IgY效價上，滅活的MEV疫苗免疫后IgY HI效價迅速上升，30 d到達峰值。后迅速下降，在120 d內HI效價與濃度二者消長規律基本一致。至150～180 d時抗體濃度下降為峰值的50%，而此時其HI效價已與陰性組相差不大。

目前，國內已經出現了治療鴨病毒性肝炎，犬細小，水貂病毒性腸炎等疾病的IgY產品和專利[7-9]，且取得了良好的臨床效果，具有廣闊的市場前景和應用價值。通過對海蘭褐蛋雞接種MEV商品化滅活疫苗后IgY濃度和效價消長規律的探究，為日后毛皮動物IgY制品的研發和生產提供初步的理論依據。

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[4]吳博，王爽，樊興東，等，不同方法提取卵黃抗體效果的比較[J]，中國獸藥雜志，2012，46（6）:42-45.

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The study of IgY variation rules after immunization with MEV inactivated vaccine

Wang Xiaozhu
(The Liaoning Institute of safety supervision for animal products,Liaoning Shenyang 110003)

In order to study the variation rules of IgY concentration and titer after immunization and to provide theoretical basis of prevention of mink enteritis,adult Hyline Brown hens were immunized with mink enteritis parvovirus(MEV)commercial inactivated vaccines respectively. Egg samples were collected after the first immunization and IgY antibody was extracted by water dilution method.After ammonium sulfate precipitation in two steps,dialysis and filtration,we obtained sterile purified yolk antibody.The results showed that the purity of IgY reached 60%～80%and the yield ratio reached 60%.After immunization,the titer and concentration of IgY rose rapidly and reached the peak on 30th day.Later,the concentration and tilter of IgY decreased. During 150～180 days,the concentration decreased to half the peak,while the titer had little differences with negative control.So above all,150 days after the first immunization,the tilter of IgY could have a good protective effect.

Mink enteritis parvovirus;IgY;Concentration;Tilter;Variation rules

TQ464 < class="emphasis_bold"> 文獻標識碼：B

B

1672-9692(2016)06-0014-05

2016-05-05

王小柱（1980-），男，本科，中級畜牧師，主要研究方向：動物飼養及疾病防控，畜產品安全監督。