針刺對東莨菪堿誘導的兔干眼模型的作用及機制探討

陳星如，高衛萍

·論著：實驗研究·

針刺對東莨菪堿誘導的兔干眼模型的作用及機制探討

陳星如，高衛萍

目的探討針刺對皮下注射氫溴酸東莨菪堿誘導的水液缺乏性兔干眼模型的作用機制。方法將健康新西蘭白兔18只隨機分為空白組、模型組、針刺組共3組，每組6只；空白組不作任何處理；模型組皮下注射氫溴酸東莨菪堿，每日4次，每次2 mg/kg；針刺組在皮下注射東莨菪堿的基礎上從實驗第15 d開始針刺，每日針1次，共針14 d。分別于實驗前1 d及實驗第7、14、17、21、28 d觀察各組的SchirmerI試驗（SIT）、淚膜破裂時間（BUT）、角膜熒光素鈉染色（CFS），及淚腺形態學變化。結果針刺組與模型組比較，在實驗第17、21、28 d即針刺第3、7、14 d時，SIT、BUT、CFS均差異顯著，P＜0.05。而針刺組在實驗第28 d即針刺第14 d時與實驗前1 d相比，SIT和CFS已無明顯差異（P＞0.05）。針刺后針刺組光鏡顯示淚腺形態變化明顯，胞漿豐富，細胞活動良好。結論針刺能有效促進兔干眼模型的淚腺代謝，增加淚液分泌及淚膜穩定，改善角膜狀況。

干眼；東莨菪堿；動物模型；針刺

干眼（dry eye）指任何原因引起的淚液質或量的異常，或動力學異常導致的淚膜穩定性下降，并伴有眼部不適，和（或）眼表組織損害為特征的多種疾病的總稱。淚腺受膽堿能神經支配，當神經反射通路出現問題，淚液分泌減少，則形成水液缺乏性干眼〔1〕。目前已有采用膽堿能受體阻滯劑東莨菪堿成功建立水液缺乏性干眼動物模型的相關報道。現如今干眼的治療仍是一大難題，臨床采用的措施主要有藥物治療、手術治療、中醫藥療法等，其中針刺治療干眼的臨床療效得到廣泛肯定，但對其作用機制的探討仍舊不夠深入。因此，本文在氫溴酸東莨菪堿誘導兔干眼模型的基礎上，進行針刺干預，以期深入探討針刺對此類干眼模型的作用機制，為臨床針刺治療干眼提供強有力的實驗依據。

1 材料與方法

1.1實驗試劑

氫溴酸東莨菪堿注射劑（江蘇省中醫院眼科配制），0.25%熒光素鈉溶液（江蘇省中醫院眼科配制），Schirmer試紙（天津晶明新技術開發有限公司生產）；華佗牌一次性使用無菌針灸針（Φ0.30 mm× 25 mm，蘇州醫療器械廠，批號：140314），WQ1002韓氏電針治療儀。

1.2動物分組及模型建立

選擇健康新西蘭白兔18只（南京青龍山動物養殖場），雌雄各半，月齡3～4個月，體重1.5～2.0 kg，裂隙燈、檢眼鏡檢查眼前節及眼底無異常，Schirmer I試驗（SIT）≥10 mm/5 min。隨機分為空白組、模型組和針刺組，每組各6只。空白組不作任何處理，模型組和針刺組皮下注射東莨菪堿注射劑，每日4次（8點、11點、14點及17點），每次2 mg/kg，直至實驗結束共28 d。

1.3針刺方法

從實驗第15 d開始針刺。選取穴位：雙睛明、攢竹、絲竹空、瞳子髎、太陽，共5組10個穴位〔2〕，睛明穴進針時推開眼球，針尖向內下方斜刺入皮下3 mm，攢竹向下平刺3 mm，瞳子髎向外平刺3 mm，太陽穴直刺3 mm，均不行針，留針15 min。絲竹空透太陽，每側電針正極接攢竹，無關電極接絲竹空，用電針治療儀，采用疏密波，頻率2 Hz/15 Hz，脈沖寬度0.5 ms，強度1 mA（強度以針刺部位肌肉出現輕微抽動為度），留針15 min，均雙側針刺，每日1次，連續治療14 d。

1.4觀察指標及檢測方法

SchirmerI試驗（SIT）：淚液檢測濾紙條一端折疊放入下瞼內1/3結膜囊內，5 min后取出濾紙，從折疊處測量其濕潤長度。淚膜破裂時間（BUT）：在不使用局部麻醉藥的條件下，將0.25%熒光素鈉溶液1滴滴于兔雙眼下瞼結膜囊內，使其瞬目幾次至熒光素在角膜均勻分布，記錄從最后一次瞬目到淚膜出現第1個黑色干燥斑的時間。角膜熒光素鈉染色（CFS）：0.25%熒光素鈉染色后，在裂隙燈顯微鏡鈷藍光下觀察角膜上皮的著色情況。根據角膜熒光素染色評分法：將角膜分為4個象限，規定無染色為0分；每個象限，點狀染色＜5點記為1分；每個象限，點狀染色≥5點記為2分；每個象限點狀染色≥5點且有絲狀或塊狀染色記為3分；四個象限共計0～12分。

3組均在實驗前1 d及實驗第7、14、17、21、28 d檢查SIT、BUT和CFS。保留Schirmer試紙，檢測時間與上一次針刺時間間隔12 h以上，3組均在同一時段檢測。各組分別于第21、28 d各處死3只，采用兔頸動脈法處死后立即取一側部分淚腺在10%甲醛溶液中固定24 h，石蠟包埋切片，HE染色，光學顯微鏡觀察。所有實驗動物給藥、針刺、淚液學檢查及處死取材均由同一人在同一環境下完成。

1.5統計學分析

采用SPSS 18.0軟件進行統計學分析，采用重復測量方差分析法，設定P＜0.05為差異有統計學意義。

表1 干眼模型兔三組不同時間Schirmer I試驗比較mm/5min）

表1 干眼模型兔三組不同時間Schirmer I試驗比較mm/5min）

注：球形檢驗P=0.182，采用單因素方差分析。a同一時段針刺組與模型組比較，P＜0.05；b針刺后與針刺前1 d相比較，P＜0.05；c同組與實驗前1 d比較，P＜0.05

組別樣本量實驗前1 d實驗第7 d實驗第14 d實驗第17 d實驗第21 d實驗第28 d空白組模型組針刺組F值P值666 16.50±0.71 15.75±0.82 16.58±0.74 2.209 0.144 15.00±0.54 9.67±1.08c9.83±1.63c40.040＜0.001 15.33±0.93 6.17±0.26c6.83±2.38c71.237＜0.001 16.33±1.72 5.33±0.82c7.33±1.40ac110.357＜0.001 15.08±0.86 4.67±0.88c9.50±0.89abc211.895＜0.001 15.92±1.53 2.25±0.61c15.33±1.94ab165.790＜0.001

2 結果

2.1Schirmer I試驗

三組各時段Schirmer I試驗比較（表1），實驗第7 d時模型組和針刺組明顯減少，均值＜10 mm，針刺后兩組SIT顯示出差異。模型組：實驗第7、14、17、21、28 d淚流量與實驗前1 d相比差異均有統計學意義（P＜0.05），且呈持續遞減狀態，說明皮下注射東莨菪堿誘導兔干眼模型穩定有效。針刺組：實驗第17、21、28 d，針刺組與同時段模型組相比，SIT差異有統計學意義，P＜0.05；實驗第21、28 d，與第14 d即針刺前1 d相比差異顯著，P＜0.05，說明針刺可有效促進干眼模型兔的淚液分泌。實驗第7、14、17、21d，與實驗前1 d相比有統計學差異，而第28 d與實驗前1 d相比，已無明顯差異（P＞0.05），說明針刺可使兔干眼模型的淚液分泌恢復到正常水平。

2.2淚膜破裂時間

各組各時段淚膜破裂時間比較（表2），模型組：實驗第7、14、17、21、28 d與實驗前1 d相比均有統計學差異（P＜0.05）。針刺組：實驗第17、21、28 d，針刺組與同時段模型組相比，BUT差異顯著，P＜0.05；實驗第17、21、28 d，與第14 d即針刺前1 d相比差異顯著，P＜0.05，說明針刺可增加兔干眼模型的淚膜穩定性。針刺組實驗第7、14、17、21、28 d，與實驗前1 d相比均有統計學差異（P＜0.05）。

2.3角膜熒光素染色

各組各時段角膜熒光素染色比較（表3），模型組：實驗第7、14、17、21、28 d與實驗前1 d相比均有統計學差異（P＜0.05），且呈持續增多狀態。針刺組：實驗第17、21、28 d，針刺組與同時段模型組相比，CFS差異顯著，P＜0.05；實驗第21、28 d，與第14 d即針刺前1 d相比差異顯著，P＜0.05，說明針刺可有效改善兔干眼模型的角膜狀況。針刺組實驗第7、14、17、21 d，與實驗前1 d相比有統計學差異，而第28 d與實驗前1 d相比，已無明顯差異（P＞0.05），說明針刺可使兔干眼模型的角膜染色恢復到正常。

表2 干眼模型兔三組不同時間淚膜破裂時間比較秒）

表2 干眼模型兔三組不同時間淚膜破裂時間比較秒）

注：球形檢驗P=0.001，采用多變量方差分析，Pillai's Trace；同一時間組間比較采用單因素方差分析。F分組=11.646，P＜0.001；F時間=142.558，P＜0.001；F交互作用=13.203，P＜0.001。a同一時段針刺組與模型組比較，P＜0.05；b針刺后與針刺前1 d相比較，P＜0.05；c同組與實驗前1 d比較，P＜0.05

組別樣本量實驗前1 d實驗第7 d實驗第14 d實驗第17 d實驗第21 d實驗第28 d空白組模型組針刺組F值P值666 9.17±0.52 8.50±0.77 9.08±1.39 0.846 0.449 8.92±0.58 3.25±0.99c4.58±1.46c45.687＜0.001 8.92±0.58 1.83±0.41c2.17±0.41c425.988＜0.001 9.00±1.38 2.25±0.27c2.83±0.41abc117.568＜0.001 8.92±0.49 2.08±0.49c4.50±1.52abc77.650＜0.001 8.33±0.52 1.42±0.20c5.75±2.27abc40.099＜0.001

表3 干眼模型兔三組不同時間角膜熒光素染色比較（x±s，秒）

2.4光鏡下淚腺形態學差異

實驗第28 d空白組（圖1a）中淚腺柱狀上皮細胞大小均勻，胞漿豐富，排列緊密。模型組（圖1b）淚腺上皮細胞萎縮，細胞內物質較少，在某些區域可以見到炎細胞。針刺組（圖1c）柱狀上皮細胞擴張，胞漿豐富，沒有淋巴細胞。

圖1 干眼膜型兔三組淚腺的光鏡結果圖

3 討論

由淚腺、眼表（角膜、結膜）和眼瞼，以及連接它們的感覺與運動神經構成了一個整體功能單位，共同調控淚液分泌和淚膜形成，維護眼表的健康，其中任一環節受損均可導致淚膜完整性和功能的破壞，從而形成干眼。有研究提出，東莨菪堿制備干眼模型主要通過神經調控來實現，淚腺、副淚腺主要受副交感神經支配，東莨菪堿為副交感神經受體阻斷劑，可通過抑制乙酰膽堿（ACh）與膽堿受體結合，產生抗膽堿作用，從而抑制副交感神經，導致淚液分泌減少，形成水液缺乏性干眼〔3〕。仇晶晶等〔4〕認為，氫溴酸東莨菪堿引起的干眼以淚液分泌減少為主，同時伴免疫性炎癥和細胞凋亡等多因素共同參與。

本研究通過給兔皮下注射氫溴酸東莨菪堿誘導水液缺乏性干眼模型，選用淚液分泌試驗，淚膜破裂時間和角膜熒光素染色作為評估指標。實驗顯示，東莨菪堿模型組在實驗第7、14、17、21、28 d，以上3項檢查與實驗前1 d相比，P＜0.05，差異有統計學意義，說明皮下注射東莨菪堿誘導兔干眼模型穩定有效。

同時，本研究在造模第15 d進行針刺干預，旨在深入探討針刺對此類干眼模型的作用機制。目前國內外關于針刺治療干眼的研究多以臨床研究為主，而動物實驗多采取硫酸阿托品滴眼液造模，這與硫酸阿托品滴眼液造模經濟、快速的優點有關，本研究第一次在氫溴酸東莨菪堿制作兔干眼模型的基礎上進行針刺干預研究，使得針刺治療干眼的研究更加豐富、更加深入全面，為臨床針刺治療干眼提供更充實的實驗依據。

實驗發現，在實驗第17、21、28 d，即針刺第3、7、14 d，針刺組的SIT、BUT、CFS與模型組相比，均具有統計學差異。同時，光鏡下淚腺形態學觀察結果顯示，模型組的淚腺上皮細胞萎縮，細胞內物質較少，且在某些區域可以見到炎細胞，說明腺細胞代謝功能低下；而針刺組中淚腺柱狀上皮細胞擴張，胞漿豐富，沒有淋巴細胞，說明淚腺細胞代謝功能良好。說明針刺能有效修復淚腺細胞，促進淚液分泌，增加淚膜的穩定性，改善角膜狀況。

針刺組在實驗第28 d即針刺第14 d時與實驗前1 d相比，SIT和CFS已無明顯差異（P＞0.05），說明針刺至第14 d時，已能對東莨菪堿制備的干眼產生良好的干預作用，使淚液分泌情況及角膜上皮狀況得到基本恢復。而針刺組的淚膜破裂時間雖較針刺前及同時段模型組有所延長，但與實驗前相比差異仍有統計學意義，原因可能為東莨菪堿持續造模后期，使淚液黏液蛋白膠層破壞，淚膜穩定性下降〔4〕，尚未及時通過針刺得到有效改善。而相關方面也有臨床研究做過報道，吳德佩等〔5〕通過一項臨床病例對照實驗，提出針刺可以增加淚液中黏蛋白的表達進而增強淚膜的穩定性減輕干澀癥狀，并認為可能與針刺可直接刺激結膜杯狀細胞以及角膜和結膜上皮細胞分泌黏蛋白、刺激支配分泌黏蛋白的角膜和結膜上皮的神經間接增加黏蛋白含量、刺激水性淚液分泌減少黏蛋白降解等方面有關。目前尚無相關動物實驗研究，有待進一步深入探討。

從中醫來講，針刺能有效改善眼周血液循環，且持續、穩定。針刺是祖國醫學的重要組成部分，立足于中醫基本理論，結合經絡腧穴，通過調和陰陽、扶正祛邪、疏通經絡來達到治療目的。中醫認為，“五臟六腑之精氣，皆上注于目而為之精”（《靈樞經·大惑論》），眼與五臟六腑之間，通過經絡密切聯系。我們選擇睛明（足太陽膀胱經）、攢竹（足太陽膀胱經）、絲竹空（手少陽三焦經）、瞳子髎（足少陽膽經）、太陽（經外奇穴）五個穴位，均位于眼周，通過針刺疏通眼部經絡，調節五臟六腑氣血津液，調和陰陽，從而濡養潤澤眼部，達到治療干眼的目的。

綜上，本研究探討了皮下注射氫溴酸東莨菪堿誘導兔干眼模型的針刺治療作用機制，對深入研究針刺治療干眼的作用有著重大意義。當然本研究也存在樣本量較小，觀察時間較短等問題，還需進一步深入擴大研究。

[1]趙堪興，楊培增.眼科學[M].北京：人民衛生出版社，2013：92.

[2]李忠仁.實驗針灸學[M].北京：中國中醫藥出版社，2003：319.

[3]劉雪，徐雯，高衛萍.硫酸阿托品滴眼液滴眼和氫溴酸東莨菪堿皮下注射制作水液缺乏型干眼兔模型實驗研究[J].臨床眼科雜志，2015，23（3）：263-266.

[4]仇晶晶，袁進，周世有，等.皮下注射氫溴酸東莨菪堿建立兔干眼模型的實驗研究[J].眼科，2009，18（6）：404-409.

[5]吳德佩，楊軍.針刺對干眼癥患者淚液黏蛋白5AC表達的影響[J].中國中醫眼科雜志，2012，22（4）：267-269.

Effect of acupuncture on dry eye rabbit model induced by scopolamine

CHEN Xingru，GAO Weiping. The First Medical College，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China

OBJECTIVETo explore the mechanism of acupuncture on rabbit in aqueous deficient dry eye model induced by scopolamine hydrobromide subcutaneous injection.METHODSEighteen healthy New Zealand white rabbits were randomly divided into three groups as blank group，model group and acupuncture group which meant 6 rabbits in each group．Blank group did not accept any treatment.Model group and acupuncture group were treated with subcutaneous injections of scopolamine hydrobromide，4 times a day with the dose of 2.0 mg/kg，while the acupuncture group was also treated by acupuncture，once a day for fourteen days.Three groups were examined for Schirmer I test（SIT）results，tear film break-up time（BUT），corneal fluorescein staining（CFS）and morpho鄄logical changes of lacrimal gland at different time point.RESULTSBetween the acupuncture group and model group，theresultsofSIT，BUTandcornealstainingweresignificantlydifferentatday17，day21andday28（P＜0.05）.At the same time in acupuncture group，when compared with indexes before experiment，SIT and CFS had no signifi鄄cant difference（P＞0.05）at day 28.Optical microscope showed obvious morphological changes of lacrimal gland，abundant cytoplasm and active cell activities.CONCLUSIONSAcupuncture could effectively promote lacrimal gland metabolism，secretion and tear film stability as well as improve the status of cornea.

dry eye；scopolamine；animal models；acupuncture

R285.5；R777.3

A

1002-4379（2016）05-0281-04

10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2016.05.001

國家自然科學基金（81373746）

南京中醫藥大學第一臨床醫學院，江蘇南京210023

高衛萍，E-mail：gao-weiping@163.com