欖香烯-羧甲基殼聚糖緩釋藥膜制備及體外釋放研究

陳勝，黃秀榕，祁明信，王曉穎，胡俊，馮春燕，柯發杰，胡艷紅

欖香烯-羧甲基殼聚糖緩釋藥膜制備及體外釋放研究

陳勝1，黃秀榕2，祁明信1，王曉穎3，胡俊1，馮春燕1，柯發杰1，胡艷紅1

目的探討欖香烯-羧甲基殼聚糖緩釋藥膜制備及體外釋放，以期為有效防治后發性白內障提供新的給藥途徑。方法將欖香烯乳液和羧甲基殼聚糖完全溶漲，混合均勻后涂布在玻璃板上，烘干備用，采用高效液相色譜法檢測藥膜的濃度；并通過體外釋放實驗摸索藥膜的體外釋放特性。結果顯微鏡觀察結果顯示制備的藥膜呈乳白色半透明柔軟薄膜，成膜性能良好；體外釋放實驗結果顯示隨著時間的延長釋藥速率逐漸減慢，4小時累計釋藥率為72.59%。結論欖香烯-羧甲基殼聚糖藥膜成膜性能良好，與欖香烯原藥相比，欖香烯-羧甲基殼聚糖藥膜具有一定的緩釋性能，為臨床后發性白內障的防治途徑及中藥給藥途徑的更新提供了基本參考。

欖香烯；緩釋系統；羧甲基殼聚糖；體外釋放

欖香烯（Elemene，Ele）是天然藥物溫郁金的主要成分，已有報道Ele能抑制腫瘤細胞生長、誘導腫瘤細胞凋亡〔1-2〕。我們前期的研究發現：Ele能抑制體外培養的牛晶狀體上皮細胞（1ensepithelialcell，LEC）增殖并誘導其凋亡；Ele可抑制人晶狀體上皮（human lensepithelial，HLE-B3）細胞增殖及細胞內膠原蛋白的合成，并探討了其信號轉導及蛋白質組學機制〔3-5〕。從前期研究結果看，Ele可望成為防治后發性白內障的有效藥物。但Ele是一種揮發油，難溶于水，如何在白內障手術中或手術后安全有效的給藥是本研究的出發點。

殼聚糖是甲殼素部分或全部脫乙酰基的產物，作為一種新型的天然高分子材料藥物載體，具有無毒、無刺激性、良好的生物相容性和生物可降解性，可提高藥物的穩定性和生物利用度，降低藥物的毒副作用等特點〔6〕。羧甲基殼聚糖為殼聚糖的羧甲基化產物，保留了殼聚糖的優良性能，又極大地改善了水溶性，應用更加廣泛，尤其在醫藥領域中其優勢正逐漸被學者所認知〔7〕。為提高Ele的水溶性，進而改善其藥物釋放特性，且便于手術中使用，本研究以生物可降解的羧甲基殼聚糖為載體材料，制備了Ele-羧甲基殼聚糖藥膜擬固定在人工晶狀體襻上作為眼內植入劑，在白內障手術的同時隨人工晶狀體一起植入眼內，并對Ele-羧甲基殼聚糖藥膜的制備工藝進行了研究，同時考察了載藥藥膜的體外釋放行為，現報道如下。

1 材料與方法

1.1試劑和儀器

欖香烯乳液（大連金港制藥有限公司）；β－欖香烯標準品（中國食品藥品檢定研究院）；羧甲基殼聚糖（青島弘海生物技術有限公司）；乙腈（國藥集團有限公司）。高效液相色譜儀（LC-20AT，日本島津公司）；冷凍干燥機（ALPHA1-2LDplus，德國Christ公司）；數顯小型恒溫真空干燥箱（DZF-150，鄭州長城科工貿有限公司）；小型高速離心機（Centrifuge5418，德國eppendorf公司）；十萬分之一電子天平[MS105DU，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；電熱恒溫振蕩水槽（DKZ-2，上海一恒科技有限公司）；電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9240，上海精宏實驗設備有限公司）。

1.2緩釋藥膜的制備測定及體外釋放

1.2.1欖香烯-羧甲基殼聚糖緩釋藥膜的制備：取羧甲基殼聚糖（CMCS，10萬分子量），加2ml超純水，0.25g甘油，5ml欖香烯注射液（相當于欖香烯25mg），使CMCS完全溶漲，混合均勻，涂布在玻璃板上，面積大小8cm× 8cm。然后置于40℃烘箱中烘干（約2h），即得。

1.2.2欖香烯-羧甲基殼聚糖緩釋藥膜中β-欖香烯含量測定高效液相色譜法（highperformanceliquidchro鄄matography，HPLC）檢測欖香烯-羧甲基殼聚糖緩釋藥膜中β-欖香烯含量。色譜條件：迪馬C18柱（4.6mm× 150mm，5μm），乙腈∶水（85∶15），柱溫30℃，流速1ml/min；檢測波長：210nm，進樣量20μl。標準曲線的測定：取β-欖香烯對照品適量，配制系列濃度β-欖香烯對照品溶液，如上述所用HPLC條件進行檢測。

1.2.3欖香烯-羧甲基殼聚糖緩釋藥膜體外釋放：用打孔器取直徑為7mm圓片狀藥膜，分別置于透析袋（截留分子量為14 000）中，加1ml釋放介質（pH7.4磷酸緩沖鹽）后迅速將透析袋用夾子封好，立即置于200ml 37℃的釋放介質（pH7.4磷酸緩沖鹽）中振蕩，按設定時間取出透析袋，倒出透析袋內藥膜及介質，用蒸餾水洗透析袋內部，清洗液與倒出的藥膜及介質置于玻璃小瓶中冷凍，8h后，用冷凍干燥機干燥12h。干燥后的殘渣用一定量甲醇復溶，渦旋3min，13000rpm離心，除去不溶鹽類，取上清液，HPLC檢測。

2 結果

2.1欖香烯-羧甲基殼聚糖緩釋藥膜表觀形貌

實驗所制得的欖香烯-羧甲基殼聚糖藥膜為乳白色半透明柔軟薄膜，成膜性良好，藥膜表面未見明顯藥物顆粒（圖1），并且可以很好的固定在人工晶狀體襻上，不改變人工晶狀體襻的大致形狀，從而不會影響手術中人工晶狀體的安裝。

圖1 欖香烯-羧甲基殼聚糖緩釋藥膜表觀形貌

2.2β-欖香烯標準曲線及藥膜中β-欖香烯含量測定

如上述所用HPLC條件進行檢測，標準曲線如圖2和圖3所示，以峰面積（Y）對濃度（X）進行線性回歸，得回歸方程：Y=21650X-19837，R2=0.9999，線性關系良好。通過標準曲線計算出直徑為7mm圓片狀藥膜平均每片含β-欖香烯16.16μg。

2.3欖香烯-羧甲基殼聚糖緩釋藥膜體外釋放速率

欖香烯-羧甲基殼聚糖藥膜釋放速率，30min時累計釋藥率為50%左右，4h時累計釋藥率達72.59%，與原藥相比，具有一定的緩釋效果（P＜0.01）。且藥膜在30 min前釋藥速率較快，此后隨著時間的延長釋藥速率逐漸減慢（圖4）。

3 討論

殼聚糖為甲殼素脫乙酰化產物，來源廣泛，價格便宜，易被降解為無毒小分子氨基葡萄糖，是至今發現的唯一天然堿性多糖。該化合物具有良好的生物活性、生物相容性和生物可降解性。但由于殼聚糖不溶于水只溶于酸或酸性溶液，而且產品呈微酸性，對人體稍有刺激作用，因此其應用范圍受到很大限制〔6〕。羧甲基殼聚糖為殼聚糖的衍生物，具有優良的水溶性、抗菌性、成膜性、保濕性和吸附性。作為醫用材料可應用在體內和體外，作為藥物載體具有水溶性、膠凝性、促滲透性、生物相容性和可降解性等特點，能夠延長藥物在體內特定部位的滯留時間，提高藥物的生物利用度等〔7〕。羧甲基殼聚糖具有良好的成膜性，形成的膜光滑透明、柔韌且透氣性好〔8〕。羧甲基殼聚糖可單獨或與其他材料復合制成各種膜制劑，用于疾病的治療。如羧甲基殼聚糖與其他材料復合可制成皮膚再生材料，幫助深度燙傷創面的全層修復，治療燙傷〔9〕。羧甲基殼聚糖口腔復合膜可治療智牙冠周炎〔10〕。羧甲基殼聚糖絡合碘復合材料止血等〔11〕。

Ele乳液是從姜科植物溫郁金中提取的抗癌有效成分，其主要生物學活性為降低腫瘤細胞有絲分裂能力，誘發腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞的生長。目前Ele乳液在臨床上主要用于癌性胸、腹水及某些惡性實體瘤的治療，可用于介入、腔內化療及癌性胸腹水的輔助治療。我們前期研究發現Ele能抑制LEC的增殖，有望成為防治后發性白內障的天然藥物。但Ele乳液腹腔注射后，藥物在脂肪組織含量最高。口服吸收差，生物利用度僅為18.8%。靜脈注射后，藥物在腦、心、肺、腎、脾、脂肪和肝中含量較多，但由于血-腦屏障的影響，進入眼內的濃度非常低。如在白內障手術過程中直接采用Ele乳液灌注，有效濃度很難掌握；術中或術后前房內直接給藥會造成短時間內藥物濃度太高引起眼內副作用。本研究將一定濃度的Ele乳液與羧甲基殼聚糖混合后可制備成乳白色半透明柔軟薄膜，成膜性能良好，可以很好的將載藥藥膜固定在人工晶狀體的襻上，以便白內障手術中在安裝人工晶狀體的同時將Ele-羧甲基殼聚糖藥膜安放在眼內。本研究的體外釋放實驗結果顯示隨著時間的延長釋藥速率逐漸減慢，4 h累計釋藥率為72.59%，具有一定的緩釋效果，可以避免藥物濃度瞬間在眼內過高引起眼內副作用。

后發性白內障是白內障術后常見的并發癥，盡管手術技巧不斷進步、手術設備不斷更新、人工晶狀體材料和設計越來越理想，但后發性白內障的發生率仍居高不下，尤其在兒童，幾乎每一例都會出現后發性白內障，目前除了采用摻釹釔鋁石榴石（Neosymiumyttrium Aluminum Garnet，Nd：YAG）激光治療外尚沒有好的治療和預防方法，而YAG激光后黃斑水腫等潛在的風險不容忽視。因此，后發性白內障作為臨床尚未解決的白內障手術并發癥成為眼科學者研究的重點。而后發性白內障發生的主要原因是術后殘留的晶狀體上皮細胞（1ens epithelial cells，LECs）增生并向后囊膜移行，我們前期研究發現Ele能抑制LEC的增殖，本研究將Ele乳液制備成Ele-羧甲基殼聚糖藥膜，固定在人工晶狀體襻上并隨手術植入眼內，既不會影響手術的操作難度，也不會延長手術的時間，且藥膜具有一定的緩釋效應，在體內作用于殘留的晶狀體上皮細胞，從而預防后發性白內障的發生，不失為一種較好的給藥途徑，但Ele-羧甲基殼聚糖藥膜對后發性白內障的防治作用及眼內副作用有待于下一步的在體實驗研究。

圖2 β-欖香烯標準曲線

圖3 7mm圓片狀藥膜載藥量HPLC圖譜

圖4 欖香烯-羧甲基殼聚糖緩釋藥膜與欖香烯原藥體外釋放曲線

[1]Dong Y，Li L，Wang L，et al.Preliminary study of the effects of β-el鄄emene on MCF-7/ADM breast cancer stem cells[J].Genetics and Molecular Research，2015，14（1）：2347-2355.

[2]Zhao S，Wu J，Zheng F，et al.β-elemene inhibited expression of DNA methyltransferase 1 through activation of ERK1/2 and AMPK signalling pathways in human lung cancer cells：the role of Sp1[J]. Journal of Cellular Molecular Medicine，2015，19（3）：630-641.

[3]胡艷紅，黃秀榕，祁明信，等.欖香烯對人晶狀體上皮細胞增生及細胞周期的影響[J].眼科研究，2009，27（11）：969-972.

[4]胡艷紅，黃秀榕，祁明信，等.欖香烯抑制人晶狀體上皮細胞增殖的蛋白質組研究[J].中華眼科雜志，2010，46（5）：427-431.

[5]Hu Y H，Huang X R，Qi M X，et al.Mechanisms of inhibition of el鄄emene on human lens epithelial cell proliferation in vitro[J].Interna鄄tional Journal of Ophthalmology，2011，4（3）：255-258.

[6]黃道龍，張明杰，崔進.殼聚糖的改性及應用研究進展[J].化學與生物工程，2015，12（4）：6-9.

[7]王美娜，李苑新，蔡興.羧甲基殼聚糖的性能及應用概況[J].中國實驗方劑學雜志，2015，21（1）：228-232.

[8]殷雪，周巋，王春穎，等.殼聚糖改性、抑菌性及成膜性研究[J].武漢工業學院學報，2008，27（3）：22-26.

[9]黃愛賓，郭瑞，徐少駿，等.膠原-磺化羧甲基殼聚糖/硅橡膠皮膚再生材料的制備及其對小型豬燙傷創面全層皮膚缺損的修復研究[J].高分子學報，2009，12（2）：111-117.

[10]劉起群.羧甲基殼聚糖口腔復合膜劑對智牙冠周炎療效的觀察[J].中國醫學創新，2015，12（1）：134-136.

[11]李冬冬，吳岳林，繆震元，等.羧甲基殼聚糖絡合碘復合材料的合成和止血活性評價[J].藥學實踐雜志，2015，12（2）：125-126，178.

Preparation and release kinetics of Elemene-Chitosan delivery system

CHEN Sheng，HUANG Xiurong，QI Mingxin，et al.The Second Affiliated People's Hospital of Fujian College of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou 350003，China

OBJECTIVETo discuss the preparation and release of Elemene-Chitosan delivery system in or鄄der to provide new route of administration for after cataract.METHODSElemene emulsion and carboxymethyl chi鄄tosan were in completely swelling，and then were mixed evenly and coated on the glass plate.After that，it was dried for application.The high performance liquid chromatographic method was used for the determination of membrane concentration phase；and in vitro release experiment was performed to explore itscharacteristicsof in vitro release.RESULTSA certain concentration of elemene emulsion and carboxymethyl chitosan mixture could be prepared into milky white translucent soft film which was of strong plasticity.The in vitro release experiment results showed that with the time extended，its release delivery rate gradually slowed down.Specifically，4 hours cumulative release rate of drug was 72.59%.CONCLUSIONSElemene-chitosan membrane had strong plasticity and was easy to install in operation.In contrast to original drug of elemene，it showed some slow-release property，which provoked basic refer鄄ences for new solution of prevention and treatment on after cataract and new route of administration of traditional Chinese medicine.

elemene；sustained release system；carboxymethyl chitosan；release in vitro

R944.9

A

1002-4379（2016）05-0285-04

10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2016.05.002

福建省衛生廳中青年骨干人才培養項目（2014-ZQN-JC-31）；福建省衛生廳中醫藥重點項目（wzhw201301）

1福建中醫藥大學附屬第二人民醫院，福州350003；2福建中醫藥大學中西醫結合學院，福州350122；3福建中醫藥大學藥學院，福州350122

胡艷紅，E-mail：46665871@qq.com