芪術膠囊對糖尿病腎病大鼠的影響研究

陳 曦 趙怡蕊

（山西中醫學院，山西 太原 030006）

芪術膠囊對糖尿病腎病大鼠的影響研究

陳 曦 趙怡蕊△

（山西中醫學院，山西 太原 030006）

目的通過研究芪術膠囊干預后糖尿病腎病大鼠的體液和腎組織的改變，觀察其對核因子κB（NF-κB）表達的影響。方法 選取60只成年健康雄性大鼠，設正常組大鼠10只，50只大鼠剔除死亡1只和造模未成功大鼠19只，將造模成功后大鼠30只隨機分為3組：模型組、芪術膠囊組、科素亞組。自成模第9周起，正常組、模型組給予蒸餾水、芪術膠囊組給予芪術膠囊（1 g/kg），科素亞組給予科素亞 （1.67 mg/kg），每日1次，連續灌胃8周。檢測各組大鼠NF-κB表達水平及果糖胺，腎功能尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）、血清胱抑素（Cys-c），超敏C反應蛋白（CRP），糖化血紅蛋白（HbA1c）。結果 芪術膠囊組可顯著降低DN大鼠的HbA1C、24 h尿蛋白、腎功能指標和NF-κB水平，并且優于科素亞組（P＜0.05或P＜0.01）；能有效延緩DN腎組織的纖維化進展。結論 芪術膠囊對糖尿病腎病大鼠的NF-кB表達具有一定積極的影響。

糖尿病腎病 芪術膠囊 核因子κB糖尿病腎病（DN）導致終末期腎病（ESRD）和糖尿病患者死亡的主要原因［1］。根據國際糖尿病聯盟（IDF）統計，現我國糖尿病患者大約1.7億［2］，給國家和社會帶來了諸多負擔，因此探討DN的發病機制，并尋求有效的防治措施具有重要意義。芪術膠囊是本課題組經過多年研究篩選治療DN的經驗方，在臨床上取得了良好的療效。目前研究表明，核因子кB（NF-κB）在免疫、炎癥、缺血、硬化等相關疾病中發揮重要的作用［3］，該因子引領DN發病機制的研究進入了一個嶄新的階段。正常狀態下，NF-κB存在于腎小球細胞的胞漿中，當受到外來信號刺激時被活化，參與調控免疫反應、炎癥反應等，導致腎臟功能及組織學異常［4］。本研究旨在進一步探討芪術膠囊對DN的NF-κB表達的影響，采用對照方法進行實驗，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 試藥與儀器 芪術膠囊：規格：0.5 g/粒，主要成分：黃芪、蒼術、地龍等，晉制劑批號：20100711。科素亞：杭州默沙東有限公司，規格：50 mg/片，批號110024。鏈脲佐菌素（STZ，批號：20101013，美國Sigma公司）。肌酐試劑盒、甘油三酯試劑盒、總膽固醇試劑盒：北京北化康泰臨床試劑有限公司提供；352型酶標儀、AC8洗板機：芬蘭；微量高速離心機：YG16W；隔水式恒溫培養箱：GNP-9080；免疫組化試劑盒（APAAP法）；RIPA蛋白裂解液：碧云天公司；ELISA檢測試劑盒；鑷子、眼科剪、70%乙醇（三蒸水配制），1.5 mL離心管、液氮；研磨機、鑷子、冰盒、離心機、RIPA；高精度加樣器及槍頭：0.5～10、2～0、20～200、200～1000 μL；

1.2 實驗動物 SD大鼠60只，雄性，體質量120 g；許可證號：SCXK（京）2014-0004，由山西省中醫藥研究院實驗動物室提供。

1.3 模型制備 大鼠適應性喂養1周后，按50 mg/kg腹腔注射枸櫞酸鈉緩沖液（pH4.4）配制的STZ。72 h后鼠尾靜脈取血測定血糖，血糖＞16.7 mmol/L，為糖尿病模型成功。6周后測尿微量白蛋白（Alb）、血糖（FBG），高于正常值者為DN造模成功［5］。

1.4 分組與給藥 剔除1只死亡老鼠和19只未成模老鼠，將30只成模大鼠隨機分成3組：模型組、芪術膠囊組、科素亞組，每組各10只，另設正常對照組10只，共4組。自成模第9周起，正常組、模型組給予蒸餾水，芪術膠囊組給予芪術膠囊（1 g/kg），科素亞組給予科素亞（1.67 mg/kg），每日1次，連續灌胃8周。所有大鼠均自由飲水和進食普通飼料。

1.5 標本采集與檢測 1）尿液：采用代謝籠法，各組分別于每4周末收集24 h尿液，保存于-80℃冰箱。進行尿常規、24 h尿蛋白定量檢測。2）血液：造模后第8周，用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉各組大鼠，由腹主動脈采血約6 mL，室溫下靜置2 h，3000 r/min離心10 min，取上游血漿-80℃保存，測定果糖胺，腎功能尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）、血清胱抑素（Cys-c），超敏C反應蛋白（hs-CRP），糖化血紅蛋白（HbA1c）。3）腎組織：大鼠取血后，取出腎臟組織置于液氮中，最后-80℃冰箱保存，進行腎組織病理觀察及NF-κB水平檢測。1.6 統計學處理 應用SPSS17.0統計軟件處理。對于計量資料，符合正態分布的，采用兩獨立樣本t檢驗，不符和正態分布的資料則采用秩和檢驗；計數資料采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組生化指標測定結果 見表1。與正常組比較，模型組大鼠HbA1c含量顯著升高（P＜0.01），芪術膠囊組較模型組有明顯降低（P＜0.05），科素亞組差異無統計學意義，表明芪術膠囊可以顯著降低DN大鼠HbA1c水平。與正常組相比，模型組大鼠血清BUN、Scr、Cys-c和24 h尿蛋白明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，芪術膠囊、科素亞組差異均明顯（P＜0.05或P＜0.01），芪術膠囊組不僅具有降低大鼠血清BUN、Scr、Cys-c和24 h尿蛋白的作用，而且在改善HbA1c和Cys-C方面作用優于科素亞組（P＜0.05）。

表1 各組大鼠血清HbA1c、24 h尿蛋白、腎功能指標和NF-κB水平比較（）

表1 各組大鼠血清HbA1c、24 h尿蛋白、腎功能指標和NF-κB水平比較（）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與芪術膠囊組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與科素亞組比較，△P＜0.05。

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2.2 各組大鼠腎組織病理形態學觀察 見圖1。HE染色光鏡見：正常組腎小球結構完整，間質無明顯炎癥細胞浸潤；模型組腎小球基底膜彌漫性增厚，系膜輕中度增厚，毛細血管瘤樣改變，腎小球有明顯體積增大和細胞增多，腎小管上皮細胞有壞死脫落和水腫，小管腔中有透明管型，腎間質存在炎性細胞和淋巴細胞浸潤；芪術膠囊組與科素亞組也相似腎組織病理改變，但較模型組有一定程度減輕（P＜0.05）。表明芪術膠囊能延緩DN腎組織纖維化的進展。

圖1 各組大鼠腎組織病理形態學觀察（HE染色，400倍）

2.3 各組大鼠NF-κB測定結果比較 與正常組相比，模型組大鼠NF-κB測定結果明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，芪術膠囊、科素亞組差異明顯（P＜0.05或P＜0.01），表明芪術膠囊在改善腎功能方面作用優于科素亞組。

3 討 論

近年來國內有關DN中醫及中西醫結合研究的文獻資料非常豐富［6］，由于中醫的辨證論治常受到醫者主觀性及經驗性的影響，故大多數文獻報道中方藥繁復，缺少從分子生物學的深入研究，因此缺乏療效較好又廣為公認的有效治療藥物。

中醫理論認為脾為后天之本，氣血生化之源。現代醫學認為胰腺屬于中醫脾的范疇，“脾虛濕停”，“郁久化熱”后天之本無以濡養先天之本“腎”，故DN基本病機為脾腎兩虛，濕熱瘀阻多見。芪術膠囊是按照健脾活血、清熱燥濕法［7］應用于臨床十余年有效的基礎上，不斷精減篩選的藥物制劑，適用于早、中期糖尿病患者。方中黃芪配當歸健脾養血活血，蒼術伍黃柏清熱燥濕，水蛭與地龍活血化瘀，大黃利濕清熱泄濁活血。全方配伍合理，為本項目的選題提供了理法方藥的合理性依據。

芪術復方是經過多年臨床篩選的經驗方，前期進行了膠囊工藝的制備與研究，同時動物模型實驗以及驗室和研究人員帶隊，具有中藥化學實驗室等國家中醫藥管理局中醫藥科研三級實驗室，我院分子生物學實驗室先后開展過多項細胞和動物大量臨床研究證實芪術復方所代表的健脾活血清熱燥濕法具有降低尿蛋白，改善腎功能的作用，治療有效率達87.5%［8-9］。作用于DN大鼠可降低血糖，降低SCr、BUN，減少24h尿蛋白定量，明顯改善腎臟病理變化，具有良好的腎臟保護作用［10］。

有研究表明，NF-κB在腎臟炎癥的進一步加劇等過程中起重要作用［11］，其參與DN發生發展機制雖然尚未明確，但與DN的發生、發展有著密切聯系。本研究說明DN可造成大鼠機體正常生理功能、病理形態的紊亂，并從分子學角度初步分析了各組大鼠腎臟和血清，通過統計分析，找到組間差異，觀察到芪術膠囊對糖尿病腎病的NF-κB的影響同時，分析了科素亞、芪術膠囊對DN大鼠的腎臟、血清NF-κB的調節趨勢和優劣，為DN的的早期診斷、防治提供有力依據，為后續的研究提供了思路。而芪術膠囊、科素亞都能從一定程度上改善這種情況，且某些方面芪術膠囊組更具有優勢。

綜上所述。本課題從分子學角度對芪術膠囊治療糖尿病腎病進行療效評價［12-13］，為DN的防治提供新的思路與方法，有效延緩DN進展，為芪術膠囊的研究開發具有廣闊的市場前景［14-15］。

［1］ 周強，仝小林，劉桂芳，等.糖尿病腎病的中醫臨床治療概況［J］.中醫藥信息，2011，28（1）：95-97．

［2］ 劉燁，張琳，洪天配.2011年糖尿病學領域的研究進展和熱點回顧［J］.中國醫學前沿雜志：電子版，2011，3（6）：27-31．

［3］ 陳紅敏，李競.高糖培養人腎小球系膜細胞對JAK2/STAT1信號蛋白活化的影響［J］.循環學雜志，2011，21（2）：23-26.

［4］ 雷鏡，杜勤．糖尿病腎病發病機制中若干相關生長因子［J］．國外醫學：老年醫學分冊，2009，30（2）：74-78．

［5］ 楊峰，唐麗琴，王鳳玲，等.大鼠糖尿病腎病模型建立影響因素研究［J］.安徽醫藥，2012，16（6）：735-738.

［6］ Afifi A，El SM，El Sharkawy M，et al.Diabetic nephropathy as a cause of end-stage renal disease in Egypt：a six-year study［J］.East Mediterr Health J，2004，10（4-5）：620-626.

［7］ 趙怡蕊，劉光珍，宋躍飛，等.芪術湯治療糖尿病腎病的療效觀察［J］.中國中西醫結合腎病雜志，2006，4（7）：230-231.

［8］ 趙怡蕊.中西醫結合治療糖尿病腎病療效觀察［J］.山西中醫，2011，27（8）：25-26.

［9］ Pennisi E.Systems biology.Tracing life′s circuitry［J］.Science，2003，302（5651）：1646-1649.

［10］Lin CL，Wang JY，Ko JY，et al.Dickkopf-1 promotes hyperglycemia-induced accumulation of mesangeial matrix and renal dysfunction［J］.J Am Soc Nephrol，2010，21（1）：124-135.

［11］Guha M，Xu ZG，Tung D，et al.Specific down-regulation of connective tissue growth factor attenuates progression of nephropathy in mouse models of type 1 and type 2 diabetes［J］. FASEB J，2007，21（7）：3355-3368.

［12］張向峰，丁少芳，高元明，等.多種基質金屬蛋白酶在高氧所致急性肺損傷中的表達［J］.中國危重病急救醫學，2006，18（8）：449-451.

［13］陳竺.系統生物學——21世紀醫學和生物學發展的核心驅動力［J］.世界科學，2005，27（3）：2-6.

［14］Zang C，Wa chter M，Liu H，et al．Ligands f or PPAR gamma and RAR cause induct ion of growth inhibition and apopt osis in human glioblastomas［J］．J Neurooncol，2003，65（2）：107-118．

［15］陳吉剛，龐琦，曾薇，等．甜菜堿對糖尿病腎病小鼠的治療作用及其機制［J］．第三軍醫大學學報，2012，34（11）：1040-1043．

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A

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