苯腎上腺素對大鼠心肌纖維化的調節(jié)及其與轉化生長因子-β1、果蠅母性DPP同源蛋白3及結締組織生長因子信號通路的關系

曹慧,龐曉,王碩,唐燕

基礎與實驗研究

苯腎上腺素對大鼠心肌纖維化的調節(jié)及其與轉化生長因子-β1、果蠅母性DPP同源蛋白3及結締組織生長因子信號通路的關系

曹慧,龐曉,王碩,唐燕

目的：觀察苯腎上腺素對壓力超負荷介導的大鼠心肌纖維化（MF）的調節(jié)及其與轉化生長因子-β1（TGF-β1）、果蠅母性DPP同源蛋白3（Smad3）及結締組織生長因子（CTGF）信號通路的關系。

苯腎上腺素；心肌纖維化；轉化生長因子-β1

(Chinese Circulation Journal, 2016,31:1205.)

心肌纖維化（MF）是指在正常的心肌組織結構中膠原纖維過量積聚、膠原濃度顯著升高或膠原成分發(fā)生改變。這種病理變化存在于多種心血管疾病，與心律失常、心功能障礙甚至心原性猝死密切相關，而交感神經系統(tǒng)（SNS）的活性變化在MF的發(fā)生發(fā)展中有著重要作用[1-3]，但大多數(shù)研究都聚焦在β-腎上腺素能受體（β-AR），有關α1-腎上腺素能受體（α1-AR）的報道較少。近年來已有基礎實驗發(fā)現(xiàn)，α1-AR可激活心臟適應性肥厚、抑制心肌細胞凋亡、增強心肌收縮力而產生心臟保護功能[4-6]，但具體機制尚不十分清楚，對MF是否有調節(jié)作用亦少見報道。

1 材料與方法

1.1動物與主要試劑

雄性健康SD大鼠28只，5～7周齡，體重220～260 g，由新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院實驗動物中心提供[動物合格證號：SCXK（新）2011-0003] 。苯腎上腺素（07140501，上海禾豐），哌唑嗪（56140401，上海信宜），水合氯醛（XK13-011-00017，天津巴斯夫）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量分析試劑盒（賽默飛世爾科技）；α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）,兔抗鼠多克隆抗體（bs-0189R，北京博奧森），轉化生長因子-β1（TGF-β1）兔抗鼠多克隆抗體（bs-0086R，北京博奧森），果蠅母性DPP同源蛋白3（Smad3）兔抗鼠單克隆抗體（BA4559，武漢博士德），結締組織生長因子（CTGF）兔抗鼠多克隆抗體（bs-0743R，北京博奧森），甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體（TA-08，北京中杉）。

1.2動物模型的建立與分組

SD大鼠28只隨機分為4組，對照組、腹主動脈縮窄（AAC）組、AAC+苯腎上腺素組和AAC+哌唑嗪組，每組7只。AAC組大鼠10%水合氯醛溶液3 ml/kg腹腔注射麻醉后，在左腎動脈分支上方分離大鼠腹主動脈，用7號注射針頭緊貼腹主動脈結扎，抽出注射器針頭，逐層縫合手術切口。對照組僅分離腹主動脈而不結扎。術后8周，AAC+苯腎上腺素組給予苯腎上腺素 0.65 mg/（kg·d） 腹腔注射，AAC+哌唑嗪組給予哌唑嗪 5 mg/（kg·d）灌胃，AAC組和對照組給予等量生理鹽水灌胃持續(xù)4周。

1.3心肌膠原形態(tài)學觀察及定量分析

處死大鼠取心臟，剪取部分左心室游離壁心肌組織，固定于4%多聚甲醛液中，石蠟包埋心肌組織，4 μm厚切片，用苦味酸酸性復紅法膠原纖維染色法（VG染色），光鏡下可見：心肌細胞呈黃色，膠原呈紅色。然后用Image-Pro5.1圖像分析軟件行圖像處理，測量左心室心肌的膠原容積分數(shù)（CVF），CVF =左心室膠原面積/所測視野面積。隨機取6個視野，以均值作為該心臟的CVF。剩余心肌組織部分凍存于液氮中，待用。

1.4免疫組化法檢測α-SMA、TGF-β1、Smad3和CTGF表達

石蠟切片，常規(guī)脫蠟，3 ml/L過氧化氫滅活過氧化物酶，熱修復抗原后，滴加α-SMA、TGF-β1、Smad3、CTGF一抗，4℃過夜；滴加生物素標記的二抗，37℃孵育30 min；滴加辣根酶標記的鏈霉卵白素工作液；雙花扁豆凝集素（DBA）顯色，封片。應用Image-Pro5.1圖像分析軟件對α-SMA、TGF-β1、Smad3、CTGF表達進行圖像分析（細胞之中棕褐色顆粒為陽性），每張切片取5個連續(xù)陽性表達視野，測定積分光密度（IOD），IOD值越高，則蛋白表達量越多，進行半定量分析。

1.5蛋白免疫印跡（Western blot） 法檢測α-SMA表達

提取心肌組織蛋白，二喹啉甲酸試劑盒檢測蛋白濃度[7,8]，聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠電泳后轉聚偏二氟乙烯膜，脫脂牛奶室溫封膜，加入α-SMA抗體，4℃過夜。0.5% TBST洗膜，加入二抗孵育1 h，洗膜后化學發(fā)光法按時曝光拍照，用Image J圖像分析軟件對結果進項定量分析，目的蛋白表達量以其與內參照條帶的灰度比值表示。

1.6統(tǒng)計學方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，組間比較在方差齊時用單因素方差分析，組間兩兩比較應用LSD。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1心肌膠原形態(tài)學觀察及定量分析結果（圖1）

光學顯微鏡下發(fā)現(xiàn)對照組心肌僅有血管周圍存在少量膠原纖維，膠原纖維呈紅色，心肌組織被染成黃色，分布均勻，排列呈條索狀。與對照組比較，AAC組、AAC+苯腎上腺素組及AAC+哌唑嗪組心肌組織中均有膠原沉積，分布不規(guī)則，心肌細胞排列紊亂，其CVF均明顯升高[P＜0.01，CVF對照組（3.38±0.33）%，AAC組（12.81±0.37）%，AAC+苯腎上腺素組（7.86±0.19）%，AAC+哌唑嗪組（12.31±0.60）%]。與AAC組比，AAC+苯腎上腺素組CVF顯著降低（P＜0.01），AAC+哌唑嗪組CVF差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.2免疫組化法檢測α-SMA、TGF-β1、Smad3和CTGF表達結果（表1，圖2）

與對照組比，AAC組心肌組織中可見α-SMA、TGF-β1、Smad3及CTGF表達均明顯增加，著色深，其IOD值均顯著升高（P＜0.01）。與AAC組比，AAC+苯腎上腺素組可見α-SMA、TGF-β1、Smad3及 CTGF表達均明顯減少，著色變淺，其IOD值均顯著降低（P均＜0.01）。AAC+哌唑嗪組與AAC組比，α-SMA、TGF-β1、Smad3及CTGF表達差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。

2.3Western blot法檢測α-SMA表達結果

與對照組（0.88±0.06）比，AAC組（2.21±0.24）、AAC+苯腎上腺素組（1.22±0.15）和AAC+哌唑嗪組（1.94±0.09）的α-SMA表達均上調（P均＜0.05）；與AAC組比，AAC+苯腎上腺素組的α-SMA表達降低（P＜0.01）；而AAC+哌唑嗪組與AAC組比，α-SMA的表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖1 各組大鼠苦味酸酸性復紅法膠原纖維染色膠原形態(tài)學觀察（×100，n=7）

表1 各組大鼠心肌α-SMA、TGF-β1、Smad3及CTGF的積分光密度值比較（n=7,

表1 各組大鼠心肌α-SMA、TGF-β1、Smad3及CTGF的積分光密度值比較（n=7,

注：α-SMA：平滑肌肌動蛋白；TGF-β1：轉化生長因子-β1；Smad3：果蠅母性DPP同源蛋白3；CTGF：結締組織生長因子；AAC：腹主動脈縮窄。與對照組比*P＜0.01；與AAC組比△P＜0.01

組別 α-SMA TGF-β1 Smad3 CTGF對照組 3.22±0.09 3.08±0.14 4.33±0.32 2.57±0.28 AAC組 16.06±0.88* 18.09±0.58* 19.26±0.57* 18.57±0.55*AAC+苯腎上腺素組 8.75±0.68*△ 10.70±0.39*△ 9.42±0.70*△ 9.56±0.96*△AAC+哌唑嗪組 15.09±0.34* 17.43±0.95* 18.78±0.73* 17.52±0.68*

圖2 免疫組化分析各組大鼠心肌α-SMA、TGF-β1、Smad3及CTGF表達（×200，n=7）

3 討論

α1-AR是一種Gq蛋白耦連受體，約占心臟總AR的10%。既往觀點認為交感神經系統(tǒng)激活釋放的兒茶酚胺通過經典的“Gαq/PLCβ1-IP3/PKC”信號轉導模式調節(jié)心臟病理性重構和纖維化[2]，但近年研究發(fā)現(xiàn)α1-AR尤其是α1A亞型能夠以核受體模式激活生存信號，刺激心肌細胞適應性肥大，抑制心肌細胞凋亡，具有防止病理性重塑的心臟保護作用[9]。MF作為心臟病理性重構的重要特征之一，其發(fā)生發(fā)展能否被α1-AR所調節(jié)尚不清楚。

本研究在腹主動脈縮窄誘導SD大鼠廣泛MF的動物模型上觀察到，AAC術后12周心肌組織發(fā)生纖維化，心肌總膠原增多（VG染色），α-SMA表達增強，這與咸瑛琳等[10]研究結果一致。有學者報道[4,11]主動脈縮窄術后，α1ABKO小鼠模型較野生型小鼠心肌細胞凋亡及纖維化增加，從而導致心臟衰竭，最終50%死亡。心肌梗死的大鼠模型在給予苯腎上腺素后，非梗死區(qū)心肌I、III型CVF降低[12]。Dash等[13]發(fā)現(xiàn)低于升壓劑量的α1-AR特異性興奮劑，可以逆轉阿霉素誘導的心臟細胞凋亡和病理性重構。本研究顯示，用α1-AR興奮劑苯腎上腺素干預模型大鼠4周后，心肌組織α-SMA表達明顯減少，MF程度改善，而AAC+哌唑嗪組未觀察到上述反應提示α1-AR興奮劑苯腎上腺素可改善壓力超負荷導致的心臟重構和纖維化。

MF的發(fā)生與發(fā)展與多種生長因子和細胞因子有關，其中TGF-β1被認為是誘導MF的關鍵因子[14]，它主要通過TGF-β/Smads信號來發(fā)揮生物學作用，如調節(jié)心肌成纖維細胞增殖分化、膠原蛋白和纖維連接蛋白的生成與降解以及誘導細胞外基質過度積聚等[15]。有研究表明，大鼠壓力超負荷模型中，TGF-β均明顯上調，并觀察到膠原蛋白的持續(xù)表達[16]。本研究結果顯示AAC組心肌組織TGF-β1、Smad3蛋白的表達明顯高于對照組，這與多數(shù)研究中在心臟等器官組織纖維化過程中，TGF-β1表達增多且促進下游Smad2、Smad3信號的結論一致[17]。Delella等[18]研究發(fā)現(xiàn)成年大鼠給予α1-AR抑制劑多沙唑嗪后，前列腺組織中TGF-βmRNA表達水平持續(xù)升高。在H9C2心肌母細胞中，TGF-β1持續(xù)能夠促進多沙唑嗪誘導的p38促分裂素原活化蛋白激酶的磷酸化，提示TGF-β相關信號通路參與了多沙唑嗪誘導的細胞凋亡[19]。本研究顯示，給予α1-AR抑制劑哌唑嗪處理4周后，心肌組織的TGF-β1、Smad3蛋白的表達較AAC組比無明顯變化，而α1-AR興奮劑苯腎上腺素干預后，大鼠心肌組織中TGF-β1、 Smad3蛋白的表達明顯減少，提示在心肌組織中抑制α1-AR不能改善纖維化。

CTGF是一種促成纖維細胞分裂、增生和表型轉化，增加膠原沉積的細胞因子是MF的生物標記物之一[20]，其表達主要受TGF-β/Smad信號通路調控[21]。本研究中AAC組心肌組織CTGF蛋白的表達明顯高于對照組，與蔣洪強等[22]報道相似，給予苯腎上腺素干預后CTGF表達明顯減少，而AAC+哌唑嗪組無明顯變化，與心肌組織TGF-β1/Smad3變化趨勢相同，這可能與CTGF啟動子上存在功能性的TGF-β反應原件和Smad結合原件，CTGF受到Smad3的直接調控有關[21,23]，由此推測苯腎上腺素改善MF的作用機制之一可能與抑制TGF-β1/ Smads 信號通路并調節(jié)其下游CTGF表達相關。MF的發(fā)生機制復雜，其中心肌成纖維細胞活化是驅動纖維化應答的重要細胞活動，苯腎上腺素對心肌成纖維細胞活化是否也具有調節(jié)作用以及調節(jié)機制如何尚不清楚，有待進一步研究。

綜上所述，在壓力超負荷誘導的MF大鼠模型中，抑制α1-AR不能逆轉MF的發(fā)生發(fā)展，而α1-AR興奮劑苯腎上腺素可部分抑制促纖維化TGF-β1/Smads信號通路并下調CTGF從而改善MF，進一步深入研究可為逆轉MF，延緩心力衰竭發(fā)展進程提供新思路。

[1] Puhl SL, Kazakov A, Müller A, et al. A1 receptor activation attenuates cardiac hypertrophy and fibrosis in response to α1-adrenergic stimulation in vivo. Br J Pharmacol, 2016, 173： 88-102.

[2] Yin YG, Wang RZ, Ruan ZB, et al. Effect of phentolamine on myocardial extracellular matrix of cardiac remodeling in rats. Asian Pac J Trop Med, 2014, 7： 645-649.

[3] Lu H, Tian A, Wu J, et al. Danshensu inhibits β-adrenergic receptors-mediated cardiac fibrosis by ROS/p38 MAPK axis. Biol Pharm Bull, 2014, 37： 961-967.

[4] O'Connell TD, Swigart PM, Rodrigo MC, et al. Alpha1-adrenergic receptors prevent a maladaptive cardiac response to pressure overload. J Clin Invest, 2006, 116： 1005-1015.

[5] Huang Y, Wright CD, Kobayashi S, et al. GATA4 is a survival factor in adult cardiac myocytes but is not required for {alpha}1A-adrenergic receptor survival signaling. Am J Physiol, 2008, 295： H699-H707.

[6] Cowley PM, Wang G, Chang AN, et al. The α1A-adrenergic receptor subtype mediates increased contraction of failing right ventricular myocardium. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2015, 309： H888-896.

[7] Wiechelman KJ, Braun RD, Fitzpatrick JD. Investigation of the bicinchoninic acid protein assay： identification of the groups responsible for color formation. Anal Biochem, 1988, 175： 231-237.

[8] Adilakshmi T, Laine RO. Ribosomal protein S25 mRNA partners with MTF-1 and La to provide a p53-mediated mechanism for survival or death. J Biol Chem, 2002, 277： 4147-4151.

[9] O'Connell TD, Jensen BC, Baker AJ, et al. Cardiac alpha1-adrenergic receptors： novel aspects of expression, signaling mechanisms, physiologic function, and clinical importance. Pharmacol Rev, 2014, 66： 308-333.

[10] 咸瑛琳, 張晶, 王綠婭, 等. 補體5a受體在阿霉素致急性心力衰竭心肌損傷的早期研究. 心肺血管病雜志, 2012, 31： 209-213.

[11] O’Connell TD, Ishizaka S, Nakamura A, et al. The alpha(1A/C)-and alpha(1B)-adrenergic receptors are required for physiological cardiac hypertrophy in the double-knockout mouse. J Clin Invest, 2003, 111： 1783-1791.

[12] 牟楊, 李剛, 張燦晶, 等. 大鼠非梗死區(qū)心肌C3G蛋白的表達及苯腎上腺素對其的干預. 基礎與實驗, 2010, 25： 391-394.

[13] Dash R, Chung J, Chan T, et al. A molecular MRI probe to detect treatment of cardiac apoptosis in vivo. Magn Reson Med, 2011, 66：1152-1162.

[14] Kamato D, Burch ML, Piva TJ, et al. Transforming growth factor-β signaling： Role and consequences of Smad linker region phosphorylation. Cell Signal, 2013, 25： 2017-2024.

[15] 程顯祿, 黃琦磊, 張建成. 轉化生長因子-β1和阿托伐他汀對人心房成纖維細胞Ⅰ型膠原和Smads蛋白表達的影響. 中國循環(huán)雜志, 2015, 30： 562-566.

[16] Kuwahara F, Kai H, Tokuda K, et al. Transforming growth factor-beta function blocking prevents myocardial fibrosis and diastolic dysfunction in pressure-overloaded rats. Circulation, 2002, 106： 130-135.

[17] Tran CM, Markova D, Smith HE, et al. Regulation of ccn2/ctgf expression in the nucleus pulosus of the intervertebral disc： role of smad and aplsignaling. Arthritis Rheum, 2010, 62： 1983-1992.

[18] Delella FK, Lacorte LM, Almeida FL, et al. Fibrosis-related gene expression in the prostate is modulated by doxazosin treatment. Life Sci, 2012, 91： 1281-1287.

[19] Yang YF, Wu CC, Chen WP, et al. Transforming growth factor-beta type I receptor/ALK5 contributes to doxazosin-induced apoptosis in H9C2 cells. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol, 2009, 380： 561-567.

[20] Koshman YE, Patel N, Chu M, et al. Regulation of connective tissue growth factor gene expression and fibrosis in human heart failure. J Card Fail, 2013, 19： 283-294.

[21] Phanish MK, Wahab NA, Colville-Nash P, et al. The differential role of Smad2 and Smad3 in the regulation of pro-fibrotic TGFbetal responses in human proximal-tubule epithelial cells. Biochem J, 2006, 393： 601-607.

[22] 蔣洪強, 張金國, 譚洪勇, 等. 黃芪甲苷對慢性心力衰竭大鼠MF和結締組織生長因子表達的影響. 中國循環(huán)雜志, 2016, 31： 165-169.

[23] Chung AC, Zhang H, Kong YZ, et al. Advanced glycation end-products induce tubular CTGF via TGF-beta-independent Smad3 signaling. J Am Soc Nephrol, 2010, 21： 249-260.

Effect of Phenylephrine on Myocardial Fibrosis Regulation With its Relevance to TGF-β/smads/CTGF Signal Pathway in Experimental Rats

CAO Hui, PANG Xiao, WANG Shuo, TANG Yan.
Department of Cardiology, First Afliated Hospital of Shihezi University Medical College, Shihezi (832002), Xinjiang, China Corresponding Author: PANG Xiao, Email: px0993@163.com

Objective: To observe the efect of phenylephrine (PE) on pressure overload induced myocardial fbrosis (MF) with its relevance to transforming growth factor-β1 (TGF-β1), drosophila mothers against decapentaplegic protein 3 (smad3) and connective tissue growth factor (CTGF) signal pathway in experimental rats.Methods: A total of 28 male SD rats were randomly divided into 4 groups: Control group, AAC (abdominal aorta coarctation) group, AAC+PE group and AAC+prazosin group. n=7 in each group. Collagen volume fraction (CVF) of left ventricle was observed by myocardial collagen morphology, left ventricular myocardial tissue protein expressions of α-smooth muscle actin (α-SMA), TGF-β1, smad3 and CTGF were measured by immunohistochemistry, protein expression of α-SMA was also examined by Western blot analysis.Results:① Myocardial collagen morphology presented that compared with Control group, AAC, AAC+PE and AAC+prazosin groups had increased CVF, all P＜0.01; compared with AAC group, AAC+PE group had decreased CVF, P＜0.01.②Immunohistochemistry demonstrated that compared with Control group, AAC, AAC+PE and AAC+prazosin groups had up-regulated protein expressions of α-SMA, TGF-β1, smad3 and CTGF, all P＜0.01; compared with AAC group, AAC+PE group had down-regulated protein expressions of α-SMA, TGF-β1, smad3 and CTGF, all P＜0.01.③ Western blot analysis indicated that compared with Control group, AAC, AAC+PE and AAC+prazosin groups had the higher α-SMA expression, all P＜0.05; compared with AAC group, AAC+PE group had the lower α-SMA expression, P＜0.01.Conclusion: Phenylephrine could improve pressure overload induced MF in experimental rats which might be related to TGF-β1/smads signal pathway inhibition and CTGF down-regulation.

Phenylephrine; Myocardial fbrosis; Transforming growth factor-β1

2016-03-18）

（編輯：王寶茹）

國家重點專科資助

832002 新疆維吾爾自治區(qū)石河子市,石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 心內科

曹慧 碩士研究生 主要從事心血管病的基礎與臨床研究 Email：Tuffycaohui@163.com 通迅作者：龐曉 Email：px0993@163.com

R54

A

1000-3614（2016）12-1205-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2016.12.013

方法：將雄性SD大鼠28只隨機分為對照組、腹主動脈縮窄（AAC）組、AAC+苯腎上腺素組和AAC+哌唑嗪組，每組7只。通過心肌膠原形態(tài)學測定左心室組織膠原容積分數(shù)（CVF）觀察大鼠MF的變化，應用免疫組化法檢測各組大鼠左心室組織α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、TGF-β1、Smad3及CTGF表達，用蛋白免疫印跡（Western blot）法測定左心室組織α-SMA表達。

結果：（1）心肌膠原形態(tài)學顯示：與對照組比，AAC組、AAC+苯腎上腺素組和AAC+哌唑嗪組的CVF均明顯升高（P均＜0.01）；與AAC組比，AAC+苯腎上腺素組的CVF顯著減少（P＜0.01）。（2）免疫組化法顯示：與對照組比，AAC組、AAC+苯腎上腺素組和AAC+哌唑嗪組的α-SMA、TGF-β1、Smad3及CTGF表達均上調（P均＜0.01）；與AAC組比，AAC+苯腎上腺素組的α-SMA、TGF-β1、Smad3及CTGF表達均降低（P均＜0.01）。（3）Western blot法顯示：與對照組比，AAC組、AAC+苯腎上腺素組和AAC+哌唑嗪組的α-SMA表達均上調（P均＜0.05）；與AAC組比，AAC+苯腎上腺素組的α-SMA表達降低（P＜0.01）。

結論：苯腎上腺素可以改善壓力超負荷誘導的大鼠MF，該作用可能與抑制TGF-β1/Smads信號通路及下調CTGF有關。