Notch1信號通路與心肌梗死小鼠心肌間質纖維化的關系研究

張東偉，余文軍，李 娜，康艷霞，范延紅

·論著·

Notch1信號通路與心肌梗死小鼠心肌間質纖維化的關系研究

張東偉，余文軍，李 娜，康艷霞，范延紅

目的 探討Notch1信號通路與心肌梗死(MI)小鼠心肌間質纖維化的關系。方法 2015年2—11月于西京醫院心內科小動物實驗室進行實驗。選取雄性C57BL/6小鼠48只，根據隨機化原則及模型建立時間分為對照組8只、A組10只(模型建立3 d)、B組15只(模型建立2周)、C組15只(模型建立4周)。比較各組小鼠左心室射血分數(LVEF)、心肌間質纖維化程度、心肌Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白水平、Notch1受體和轉錄因子Hey1 mRNA及蛋白表達情況。結果 B、C組小鼠LVEF低于對照組(P<0.05)。B、C組小鼠心肌間質纖維化程度高于A組(P<0.05)。B、C組小鼠心肌Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白水平高于對照組(P<0.05)。A組小鼠Notch1受體、轉錄因子Hey1 mRNA相對表達量高于對照組，B、C組小鼠Notch1受體、轉錄因子Hey1 mRNA相對表達量低于對照組(P<0.05)。A組小鼠Notch1受體、轉錄因子Hey1蛋白相對表達量高于對照組，B、C組小鼠Notch1受體、轉錄因子Hey1蛋白相對表達量低于對照組(P<0.05)。結論 Notch1信號通路參與了MI小鼠心肌間質纖維化過程，Notch1信號通路受抑會增加MI小鼠心肌間質纖維化發生風險。

心肌梗死；小鼠；Notch1信號通路；模型，動物

張東偉，余文軍，李娜，等.Notch1信號通路與心肌梗死小鼠心肌間質纖維化的關系研究[J].實用心腦肺血管病雜志，2016，24(11)：53-56.[www.syxnf.net]

ZHANG D W，YU W J，LI N，et al.Role of Notch1 pathway in myocardial interstitial fibrosis of myocardial infarction mice[J].Practical Journal of Cardiac Cerebral Pneumal and Vascular Disease，2016，24(11)：53-56.

隨著經皮冠狀動脈介入治療(PCI)及冠狀動脈旁路移植術(CABG)的發展，冠狀動脈再灌注治療成功率升高，明顯降低了心肌梗死(MI)患者病死率。目前，MI后心力衰竭是臨床醫生面臨的主要挑戰，心力衰竭的病理表現心肌間質纖維化會導致心臟舒張及收縮功能減弱[1-2]。心肌間質纖維化是多種心臟疾病發展到一定階段出現的共同病理改變[3]，主要由心肌組織中膠原纖維過量沉積，膠原濃度和膠原容積分數增加，各型膠原蛋白(Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白)比例失調及排列紊亂導致。

1917年，有學者在果蠅體內首次發現Notch基因[4]。近年研究發現，Notch基因參與心肌細胞分化[5]。Notch受體有4個亞型(Notch1～4)，其中Notch1受體是心血管系統的重要調控因子[6]，可促進心肌細胞增殖[7]，調控心肌細胞損傷后纖維修復能力[8]，并在骨髓間充質干細胞介導MI的增殖分化中起重要作用[9]，其可抑制成纖維細胞轉化，促進干細胞向心肌細胞分化[10]。但目前Notch1信號通路在MI后心肌間質纖維化中的作用尚不明確。本研究旨在探討Notch1信號通路與MI小鼠心肌間質纖維化的關系，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 選取雄性C57BL/6小鼠48只，周齡約8周，體質量20～25 g，購自第四軍醫大學實驗動物中心；飼養于西京醫院心內科實驗室動物房，飼養條件：實驗動物房保持通風、恒溫、恒濕的環境，予以充足鼠糧與水，光照/黑暗各12 h，模擬正常的生活環境。

1.1.2 實驗試劑 Ⅰ型膠原蛋白及Ⅲ型膠原蛋白酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(Sigma，美國)，反轉錄試劑盒(Takara，日本)，兔來源單克隆抗β-肌動蛋白(β-Actin)抗體(Cell Signaling Technology，美國)、兔來源單克隆抗跨膜受體蛋白Notch1抗體(Cell Signaling Technology，美國)、兔來源單克隆抗轉錄因子Hey1抗體(Cell Signaling Technology，美國)。

1.2 實驗分組與模型建立 2015年2—11月于西京醫院心內科小動物實驗室進行實驗。將所有小鼠隨機分為對照組8只與MI組40只，MI組小鼠按模型建立時間分為A組(模型建立3 d)10只、B組(模型建立2周)15只、C組(模型建立4周)15只。MI組小鼠采用異氟烷吸入法進行麻醉，之后從小鼠左側第4肋間隙依次穿透胸膜、左側縱隔，暴露心臟，用6-0絲線在小鼠冠狀動脈左前降支距主動脈根部2～3 mm處打活結，后擠壓左側胸廓以減輕氣胸，并迅速縫合切口建立小鼠MI模型；對照組模型建立過程與MI組基本相同，但6-0絲線在小鼠冠狀動脈左前降支穿線后不打結。

1.3 觀察指標 觀察4組小鼠心功能〔左心室射血分數(LVEF)〕、心肌間質纖維化程度、心肌Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白水平、Notch1受體和轉錄因子Hey1 mRNA及蛋白表達情況。

1.3.1 心功能指標 小鼠經異氟烷吸入法麻醉后采用加拿大生產的Visual Sonics Vevo770高分辨率小動物超聲系統進行M型超聲檢測LVEF，連續檢測6個心動周期取平均值。

1.3.2 心肌間質纖維化程度 采用1.8%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠后迅速取出心臟，置于10%氯化鉀溶液中使心臟在舒張期停搏，采用4%多聚甲醛固定后送至第四軍醫大學病理實驗室進行石蠟包埋、切片及馬松(Masson)三色染色，后采用NanoZoomer高分辨率數字切片掃描裝置進行切片掃描，采用Image Pro-Plus 6.0軟件分析心肌間質纖維化程度。

1.3.3 心肌Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白水平 采用1.8%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠后迅速取出心臟，準確稱取心肌組織重量，按一定比例加入磷酸鹽緩沖液(PBS)，冰水浴中手動勻漿，離心后取上清液，按ELISA試劑盒說明書進行檢測，每次讀取3個數值，重復3次后取平均值。

1.3.4 Notch1受體和轉錄因子Hey1 mRNA及蛋白表達 (1)采用實時熒光定量反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測Notch1受體及轉錄因子Hey1 mRNA的表達情況：取小鼠心肌組織mRNA并進行定量，通過反轉錄試劑盒制成cDNA，按RT-PCR試劑盒步驟制備聚合酶鏈式反應(PCR)體系，采用ABI 7500 PCI儀檢測Notch1受體及轉錄因子Hey1 mRNA相對表達量。(2)采用蛋白免疫印跡雜交法(Western blot)檢測Notch1受體及轉錄因子Hey1蛋白表達情況：取小鼠心肌組織蛋白，采用二喹啉甲酸(BCA)法進行蛋白定量，后將蛋白樣品上樣、電泳、轉膜、化學發光，條帶掃描后通過Image J軟件半定量分析蛋白條帶的灰度值，蛋白相對表達量以各蛋白條帶與對應β-Actin條帶灰度比值計算，檢測Notch1受體及轉錄因子Hey1蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 心功能 對照組小鼠LVEF為(67.7±1.5)%，A組小鼠LVEF為(60.7±1.8)%，B組小鼠LVEF為(44.3±1.8)%，C組小鼠LVEF為(35.0±1.7)%。4組小鼠LVEF比較，差異有統計學意義(F=78.62，P<0.05)；B、C組小鼠LVEF低于對照組，差異有統計學意義(q值分別為13.86、19.41，P<0.05)。

2.2 心肌間質纖維化程度A組小鼠心肌間質纖維化程度為(12.0±1.2)%，B組小鼠心肌間質纖維化程度為(40.0±1.2)%，C組小鼠心肌間質纖維化程度為(47.3±1.8)%。A、B、C組小鼠心肌纖維化程度比較，差異有統計學意義(F=180.50，P<0.05)；B、C組小鼠心肌間質纖維化程度高于A組，差異有統計學意義(q值分別為20.18、25.46，P<0.05)。MI小鼠梗死區及梗死周圍組織出現心肌間質纖維化，且隨著梗死時間延長心肌間質纖維化程度加重，見圖1。

注：a為對照組，b為A組，c為B組，d為C組

圖1 4組小鼠心肌間質纖維化程度(馬松三色染色)

Figure1Degreeofmyocardialinterstitialfibrosisofthefourgroups

2.3 心肌Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白水平 4組小鼠心肌Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)；B、C組小鼠心肌Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白水平高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05，見表1)。

2.4Notch1受體mRNA、轉錄因子Hey1mRNA表達情況 4組小鼠Notch1受體、轉錄因子Hey1mRNA相對表達量比較，差異有統計學意義(P<0.05)；A組小鼠Notch1受體、轉錄因子Hey1mRNA相對表達量高于對照組，B、C組小鼠Notch1受體、轉錄因子Hey1mRNA相對表達量低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05，見表2)。

Table 1 Comparison cardiac collagen-Ⅰ and Ⅲ among the four groups

組別只數Ⅰ型膠原蛋白Ⅲ型膠原蛋白對照組8237±045236±024A組10279±026300±036B組15583±037a528±042aC組15754±032a668±031aF值40483502P值<00001<00001

注：與對照組比較，aP<0.05

Table 2 Comparison of relative expression quantity of Notch1 receptor mRNA and transcription factors Hey1 mRNA among the four groups

組別只數Notch1受體mRNA轉錄因子Hey1mRNA對照組810±0010±00A組1013±01a14±01aB組1507±01a05±01aC組1505±01a04±01aF值49008633P值<00001<00001

注：與對照組比較，aP<0.05

2.5 Notch1受體、轉錄因子Hey1蛋白表達情況 4組小鼠Notch1受體、轉錄因子Hey1蛋白相對表達量比較，差異有統計學意義(P<0.05)；A組小鼠Notch1受體、轉錄因子Hey1蛋白相對表達量高于對照組，B、C組小鼠Notch1受體、轉錄因子Hey1蛋白相對表達量低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05，見表3、圖2)。

Table3ComparisonofrelativeexpressionquantityofNotch1receptorproteinandtranscriptionfactorHey1proteinamongthefourgroups

組別只數Notch1受體轉錄因子Hey1對照組8046±005024±003A組10069±004a042±003aB組15032±003a015±002aC組15031±003a014±002aF值55335800P值<00001<00001

注：與對照組比較，aP<0.05

圖2 4組小鼠Notch1受體、轉錄因子Hey1蛋白的電泳結果

Figure 2 Electrophoretic results of Notch1 receptor protein and transcription factor Hey1 protein of the four groups

3 討論

MI是指冠狀動脈急性、持續性缺血缺氧引起的心肌壞死。心力衰竭是MI的常見并發癥，其主要病理表現為心肌間質纖維化。近年來，隨著人口老齡化進程加劇，心血管疾病的發病率呈逐年上升趨勢，MI的發病率升高，心肌間質纖維化發生率隨之升高。

Notch信號通路是一個進化保守的內源性信號通路，可調控細胞的生長、分化及組織再生，在心肌重構過程中發揮著重要作用[11]。Notch1信號通路對心臟發育具有重要作用，但其在生理狀態下是失活的[12]，而一些病理因素(如MI、壓力超負荷)刺激會激活Notch1信號[13-14]。Notch1信號通路是心肌內源性保護通路，但隨著損傷程度加重及梗死時間延長其被代償抵消，進而導致心肌間質纖維化程度加重。Notch受體與配體結合并激活后會降解蛋白，導致Notch活性形式釋放，通過與核轉位和轉錄因子結合而調控靶基因的轉錄；Hey家族基因是Notch信號通路主要調控的轉錄因子，而其在心血管發育中發揮著重要作用[15-16]。

本研究結果顯示，B、C組小鼠LVEF低于對照組，心肌間質纖維化程度及心肌Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白水平高于對照組，提示隨著梗死時間延長MI小鼠心肌間質纖維化程度加重。本研究結果顯示，A組小鼠Notch1受體、轉錄因子Hey1 mRNA相對表達量高于對照組，B、C組小鼠Notch1受體、轉錄因子Hey1 mRNA相對表達量低于對照組；A組小鼠Notch1受體、轉錄因子Hey1蛋白相對表達量高于對照組，B、C組小鼠Notch1受體、轉錄因子Hey1蛋白相對表達量低于對照組。提示Notch1信號通路具有一定的心肌保護作用。研究表明，抑制Notch1信號通路會加重血管緊張素Ⅱ誘導的心肌病小鼠的心肌重構和心肌肥厚，前降支結扎小鼠心肌內注射Notch1過表達的腺病毒載體可減少心肌損傷及心肌重構的發生[12-15]。研究表明，Notch1信號通路參與MI后心肌重構，可上調Hey1 mRNA水平[11,15]。

綜上所述，Notch1信號通路參與MI小鼠心肌間質纖維化過程，Notch1信號通路受抑制會增加MI小鼠心肌間質纖維化發生風險，但目前Notch1信號通路的具體作用機制尚不明確，有待進一步研究探討。

作者貢獻：張東偉、余文軍進行實驗設計、資料收集整理、撰寫論文；李娜、康艷霞進行實驗實施、評估、資料收集；范延紅進行質量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：李潔晨)

Role of Notch1 Pathway in Myocardial Interstitial Fibrosis of Myocardial Infarction Mice

ZHANG Dong-wei，YU Wen-jun，LI Na，KANG Yan-xia，FAN Yan-hong.

Department of Cardiovascular Medicine，Xijing Hospital of the Fourth Military Medical University，Xi′an 710032，China

FANYan-hong，DepartmentofCardiovascularMedicine，XijingHospitaloftheFourthMilitaryMedicalUniversity，Xi′an710032，China；E-mail：517382104@qq.com

Objective To investigate the role of Notch1 pathway in myocardial interstitial fibrosis of myocardial infarction mice.Methods From February to November in 2015，we carried out this experiment in the Small Animal Laboratory，Department of Cardiovascular Medicine，Xijing Hospital of the Fourth Military Medical University.A total of 48 male C57BL/6 mice were selected，and they were divided into control group(n=8)，A group(n=10，modeling for 3 days)，B group(n=15，modeling for 2 weeks)and C group(n=15，modeling for 4 weeks)according to principle of randomization and modeling time.LVEF，degree of myocardial interstitial fibrosis，cardiac collagen-Ⅰ and Ⅲ，mRNA and protein expressions of Notch1 receptor and transcription factor Hey1 were compared among the four groups.Results LVEF of B group and C group was statistically significantly lower than that of control group，respectively(P<0.05).Degree of myocardial interstitial fibrosis of B group and C group was statistically significantly higher than that of A group(P<0.05).Cardiac collagen-Ⅰ and Ⅲ of B group and C group were statistically significantly higher than those of control group(P<0.05).Relative expression quantity of Notch1 receptor mRNA and transcription factor Hey1 mRNA of A group was statistically significantly higher than that of control group，respectively； relative expression quantity of Notch1 receptor mRNA and transcription factor Hey1 mRNA of B group and C group was statistically significantly lower than that of control group，respectively(P<0.05).Relative expression quantity of Notch1 receptor protein and transcription factor Hey1 protein of A group was statistically significantly higher than that of control group，respectively； relative expression quantity of Notch1 receptor protein and transcription factor Hey1 protein of B group and C group was statistically significantly lower than that of control group，respectively(P<0.05).Conclusion Notch1 pathway plays an important role in the myocardial interstitial fibrosis of myocardial infarction mice，inhibition of Notch1 pathway may increase the risk of myocardial interstitial fibrosis.

Myocardial infarction；Mice；Notch1 signal pathway；Models，animal

國家自然科學基金資助項目(81370194)；北京力生心血管健康基金會領航基金優秀課題(LHJJ20140771)

張東偉，康艷霞

710032陜西省西安市，第四軍醫大學西京醫院心臟內科(張東偉，范延紅)；中國人民解放軍第517醫院內科(余文軍)；山西省運城市中心醫院(李娜)；第四軍醫大學唐都醫院腫瘤科(康艷霞)

范延紅，710032陜西省西安市，第四軍醫大學西京醫院心臟內科；E-mail：517382104@qq.com

R 542.22

A

10.3969/j.issn.1008-5971.2016.11.014

2016-08-04；

2016-10-31)