烏司他丁對小鼠肺泡巨噬細胞TREM蛋白表達的影響研究

王耀煒 王惠芳

(西安醫學院第二附屬醫院呼吸科，陜西 西安 710038)

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烏司他丁對小鼠肺泡巨噬細胞TREM蛋白表達的影響研究

王耀煒 王惠芳

(西安醫學院第二附屬醫院呼吸科，陜西 西安 710038)

目的 研究烏司他丁對脂多糖(lipopoly saccharide,LPS)刺激后的小鼠肺泡巨噬細胞(AM)表面TREM蛋白表達的影響，并探討烏司他丁在AM介導的炎癥反應中的作用及機制。方法 培養肺泡巨噬細胞，分為對照組、LPS干預組、LPS+烏司他丁(LU)組。對照組不予處理，LPS干預組給予100 ng/mL LPS，LU組給予100 ng/mL LPS+10 000 U/mL烏司他丁，之后分別在3 h、12 h、24 h用流式細胞儀(FACS)檢測AM表面TREM1、TREM2蛋白的表達水平。ELISA檢測AM培養上清液中TNF-α表達水平。結果 對照組TREM1、TREM2各時間點的表達差異無統計學意義(P>0.05)。LPS干預組TREM1的表達在3 h上升到最高，24 h時接近正常；TREM2在3 h下降到最低，之后上升。LU組TREM1的表達均明顯下降，24 h下降至最低，與LPS組對比差異有統計學意義(P<0.05)；TREM2的表達均明顯升高，在24 h升至最高，與LPS組對比差異有統計學意義(P<0.05)。TNF-α的表達對照組各時間點差異無統計學意義(P>0.05)；LPS組在3 h達到最高，之后下降，24 h時接近正常；LU組均明顯下降，與LPS組對比差異有統計學意義(P<0.05)。結論 烏司他丁可能通過調節TREM蛋白在LPS致AM介導的炎癥反應中起重要作用。

烏司他丁； 髓系細胞觸發受體； 肺泡巨噬細胞； 脂多糖

肺泡巨噬細胞(alveolar macrophage,AM)是肺內接觸抗原最早的常駐細胞,參與肺內早期炎癥的啟動與維持。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革蘭氏陰性菌外膜的主要組成部分，其可活化多種炎性細胞如巨噬細胞、中性粒細胞等,通過參與TLR4介導的信號通路促使大量炎癥因子釋放失控并產生放大效應,進而打破炎癥自限機制,產生自身破壞性的過度炎癥反應。

TREM家族受體是新近發現的一組免疫球蛋白超家族受體，多表達于巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞等，迄今發現至少包括TREM1、TREM2兩個受體。AM表面正常情況下即表達TREM1、TREM2受體，在受到LPS刺激后受體表達產生相應的變化分別擴大、抑制炎癥。烏司他丁是一種廣譜蛋白酶抑制劑，具有抗氧化、清除氧自由基、抑制炎癥介質釋放的作用，既往多項研究[1]證實其在急性肺損傷，急性呼吸窘迫綜合征、膿毒癥等中有抗炎及肺保護作用。烏司他丁抗炎作用是否與AM表達的TREM受體有關尚未見報道。本實驗設計觀察烏司他丁干預LPS刺激后的AM并觀察其表面TREM受體的表達規律，旨在進一步探討烏司他丁在AM介導的炎癥反應中的作用及機制。報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 近交系C57BL/6小鼠，8～12周齡(北京中國醫學科學院實驗動物研究所)，抗小鼠TREM1抗體(R&D公司)，抗小鼠TREM2抗體(R&D公司)，FITC標記的山羊抗大鼠抗體(北京中衫金橋生物技術有限公司)，LPS(德國sigma公司)，ELISA試劑盒(RB公司)，烏司他丁注射液(廣東天普生化醫藥股份有限公司)。

1.2 實驗方法 (1)小鼠肺泡巨噬細胞(AM)的分離、培養和純化：頸椎脫臼法處死小鼠，用95%的酒精浸泡3～5 min，剪開頸部皮膚，并逐層分離致氣管。用去尖端七號針頭穿入氣管內，絲線固定牢固。取1 mL注射器抽取磷酸鹽緩沖液(PBS)0.8 mL，并緩慢推入氣管，停留1 min后回抽，共6～8次。抽取的肺泡灌洗液(BALF)注入離心管內離心(1 500 r/min)6 min后棄去上清液。底部的細胞沉淀用6 mL RPMI1640混勻制成單細胞懸液，等份接種在3個25 mL的細胞培養瓶中過夜進行AM的貼壁純化。次日棄去瓶中培養液，用0.02 %的胰蛋白酶消化貼壁的AM,用RPMI1640將消化下來的AM混勻制成單細胞懸液，高倍鏡下計數并調整細胞濃度為1.5×106/mL,將其等份接種在3個12孔細胞培養板上，分為三組，對照組、LPS干預組、LU組，每組每個時間點各設三個復孔。(2)藥物干預：對照組不做處理，LPS干預組取100 ng/mL LPS分別加入各孔，LU組取100 ng/mL LPS+10 000 U/mL烏司他丁注射液分別加入各孔。(3)流式細胞儀(FACS)檢測AM表面TREM的表達：分別在3 h、12 h、24 h各時間點收集以上培養的三組肺泡巨噬細胞進行流式細胞儀檢測，CellQuest軟件分析。(4)TNF-α的檢測：收集各組各孔AM培養上清液,按照ELISA試劑盒說明檢測TNF-α含量。

1.3 統計學方法 采用SPSS 19.0軟件對數據進行統計分析。計數資料以(x±s)表示,采用隨機區組設計的單因素方差分析,各時點組間多重比較采用最小顯著差法,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 AM表面TREM1、TREM2的表達 對照組TREM1、TREM2各時間點的表達差異無統計學意義(P>0.05)。LPS干預組TREM1的表達在3 h達到最高，之后逐漸下降，24 h接近正常，3 h、12 h組與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。LU干預后TREM1的表達顯著下降，24 h下降至最低值，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)，與LPS組比較各組均差異有統計學意義(P<0.05)；LPS干預組TREM2的表達在3 h降至最低，之后逐漸上升，24 h接近正常，3 h、12 h組與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。LU干預后TREM2的表達顯著上升，T24 h上升至最高值，與對照組比較T24 h差異有統計學意義(P<0.05)；與LPS組比較各組差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

指標組別3h12h24hTREM1對照組56.34±4.56*58.26±6.25*59.68±7.36LPS組136.58±7.48 110.37±9.6465.35±3.36LU組68.25±5.68*46.42±6.38*30.24±9.68*TREM2對照組 162.42±2.91△ 170.58±3.92△180.42±4.91 LPS組106.72±3.56 134.54±3.58166.27±6.37 LU組138.2±9.67△163.35±6.38△203.35±6.38△

注：TREM1各組、各時間點與LPS組比較，*P<0.05；TREM2各組、各時間點與LPS組比較,△P<0.05。

2.2 TNF-α的表達 對照組各時間點差異無統計學意義(P>0.05)。LPS組在3 h達到最高，之后逐漸下降，24 h時接近正常。LU干預后TNF-α的表達顯著下降，24 h下降至最低值，與對照組比較24 h差異有統計學意義(P<0.05);與LPS組比較各組差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

指標組別3h12h24hTNF-α對照組7.59±0.28*8.06±1.36*9.15±1.57LPS組36.58±3.67 25.32±5.1412.79±2.16LU組10.68±1.64*7.67±2.17*4.38±1.84*

注：TNF-α各組，各時間點與LPS組比較,*P<0.05。

3 討 論

肺泡巨噬細胞(alveolar macrophage，AM)是肺內主要的居留性吞噬細胞，構成呼吸系統防御病原微生物和其他肺損傷因素的第一道防線，既能促進炎性反應，又能抑制炎癥的發展[2]，它是呼吸道的免疫核心細胞，也是內毒素(LPS)的主要效應細胞。AM可表達多種膜受體和膜分子，如Toll樣受體(toll-like receptor，TLR)、甘露糖受體等。此外，它還可分泌多種細胞因子、小分子炎性介質、補體成分等，參與炎性反應和免疫調節作用。TREM家族是一種新型的免疫球蛋白超家族炎癥激發受體，可以調節LPS介導的炎癥反應。該家族主要有TREM1、TREM2兩個成員，近年來多項研究表明TREM1受體具有擴大炎癥的作用，而TREM2受體與之相反有強大的抗炎作用[3]。AM表面在正常情況下即表達TREM受體，在受到LPS刺激后TREM受體的表達產生相應變化來應對所產生的炎癥反應，從而達到調控炎癥反應的目的。

烏司他丁(UTI)是一種廣譜的蛋白酶抑制劑，可以抑制蛋白酶活性，也具有調控細胞因子的作用，能抑制全身炎癥反應綜合征，從而阻止多臟器功能障礙的發生、發展。另外UTI分子中還具有與細胞膜受體識別和結合的位點。Nakatani等[4]在體外實驗中還發現，UTI呈劑量依賴性地抑制細胞外中性粒細胞彈性蛋白酶活性的同時，還抑制其在細胞內的活性和分泌，從而抑制中性粒細胞介導的內皮細胞損傷。大劑量UTI可進一步下調炎癥因子水平，從而對膿毒癥性肺損傷起保護作用[5]。Li等[6]的研究表明UTI可以通過AMPK/NF-κB通路抑制LPS誘導小鼠急性肺損傷中的炎癥介質起到肺保護作用。

UTI是否能識別AM細胞表面TREM受體，并參與調節TREM受體的表達，從而調節炎癥反應是我們本次研究的重點。從研究結果來看，正常情況下AM表面即表達一定數量的TREM蛋白，且隨時間的變化無顯著改變。在受到LPS刺激后TREM1蛋白及TNF-α表達均明顯升高，而TREM2表達明顯下降，以上變化在LPS刺激后3 h點最明顯。用UTI干預后TREM1表達顯著下降，到24 h時下降至最低點，而TREM2表達均明顯上升，在24 h點時達到最高。從而我們分析AM在受到LPS刺激后產生一系列炎癥反應，并生成大量炎癥介質，如TNF-α，這些炎癥介質可能反饋調節其表面TREM蛋白的表達，使TREM1升高，TREM2下降從而調控炎癥反應的平衡，至于是否有其他炎癥介質的參與，仍需進一步實驗研究。LPS刺激后促炎因子大量表達并占據優勢，促進TREM1的高表達會更進一步放大炎癥反應從而對機體產生不利影響。UTI干預AM后TREM1、TNF-α的表達均明顯下降，而TREM2的表達逐漸上升，均在24 h時變化最明顯。從而我們初步推測UTI可能通過識別AM表面的TREM受體并通過調節其變化來減輕LPS對AM造成的失控性炎癥損害，具體調控機制可能是通過炎癥因及受體表達雙重調控來完成。

本實驗中LU組隨著UTI作用AM時間的延長，在24 h時TREM1、TREM2蛋白以及TNF-α的變化達到最大，考慮其抗炎效應也隨干預時間的延長逐漸增強，在24 h時達到最大效率。考慮其對TREM蛋白的識別以及炎癥因子的調控需要一定的時間來達到最大化。至于提高UTI干預AM的濃度后是否會對TREM蛋白表達產生更深影響，以及與TREM受體識別后其是通過下游哪條通路、哪些細胞因子之間相互作用來實現信號的傳導從而發揮抗炎作用，仍需要進一步研究。

[1] Linder A,Russell JA.An exciting candidate therapy for sepsis:ulinastatin,aurinary protease inhibitor[J].Intensive Care Med，2014，40(8):1164-1167.

[2] Rubins JB.Alveolar macrophages: wielding the double-edged sword ofinflammation[J].Am J Respir Crit Care Med,2003,167:103-106.

[3] Sharif O，Knapp S.From expression to signaling:roles of TREM-1 and TREM-2 in innate immunity and bacterialinfection [J].Immunobiology,2008，213(9-10)：701-703.

[4] Nakatani K， Takea S， Tsujimoto H， et al． Inhibitory effect of serine protease inhibitors on neutrophil-mediated endothelialcell injury[J].Leukoc Biol，2001，69(2)：241-247.

[5] 陳昊，張麗葳，林兆奮，等．不同劑量烏司他丁對急性肺損傷大鼠MMP-9等炎癥因子調控的研究[J]．中國醫藥導報，2011，8(24)：15-18.

[6] Li W,Qiu X,Jiang H,et al.Ulinastatin inhibits the inflammation of LPS-induced acute Lung injury in mice via regulation of AMPK/NF-ΚB pgthway[J].Int Immunopharmacol,2015,16(15):1567-1569.

Effect of ulinastatin for expression of TREM at alveolar macrophages in mice

WangYaowei，WangHuiFang.

DepartmentofPulmonaryDisease,theSecondAffiliatedHospitalofXianMedicalCollege,Xian710038,Shanxi,China.

ObjectiveTo investigate the effect of ulinastatin for expression of TREM after LPS stimulates the alveolar macrophages (AM) and explore mechanism in AM-mediated inflammatory response.Methods Cultured the alveolar macrophages,which were divided into control group,LPS group,and LU group.LPS group was added LPS at the final concentration of 100 μg/mL,and LU group was added LPS at the final concentration of 100μg/mL and ulinastatin the final concentration of 10 000 U/mL.The expression level of TREM1 and TREM2 at 3 h,12 h,24 h time points was detected by flow cytometry (FACS).And the concentration of TNF-α was detected by ELISA method.Results The expression of TREM1 and TREM2 at Control group there were no statistical significantly differences in other time points(P>0.05).The expression of TREM1,TREM2 and TNF-α that there were statistical significantly differences between LU and LPS group(P<0.05).The expression of TNF-α at Control group there were no statistical significantly differences in other time points(P>0.05).Conclusion Ulinastatin can adjust the TREM protein in LPS to AM-mediated inflammatory response plays an important role.

Ulinastatin； TREM； Alveolar macrophages； LPS

R-332；R364.5

A

1000-744X(2016)12-1249-03

2016-10-25)