RNA干擾技術在哮喘治療的研究進展

楊宏寬 潘俊杰 張佳穎 王佳君 王芳 陳芳?

·綜述·

RNA干擾技術在哮喘治療的研究進展

楊宏寬 潘俊杰 張佳穎 王佳君 王芳 陳芳?

哮喘是一種常見的、慢性的多因素呼吸系統疾病，常以慢性氣道炎癥為特征。世界衛生組織預計全世界現有3億哮喘患者，如此高的患病率造成社會經濟和衛生保健系統面臨嚴重負擔［1］。盡管吸入型糖皮質激素在輕中度哮喘治療中能有效改善癥狀及減少急性發作的次數，其在重度及難治性哮喘治療中的效果難以令人滿意。因此，在哮喘治療中需要尋找新的治療干預手段。

1 RNA干擾概述

RNA干擾（RNAi）是20世紀90年代在矮牽牛屬植物及線蟲中發現的由雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）介導的轉錄后基因沉默現象。dsRNA進入細胞后，Dicer酶將其特異性識別并裂解成 21 ～23個核苷酸小干擾RNA（samll interfering RNA，siRNA）。雙鏈siRNA與Dicer酶的雙鏈RNA結合形成RNA誘導沉默復合物（RNA induced silencing complex，RISC）。RISC被激活后將siRNA中的雙鏈分開，并催化siRNA的反義鏈去尋找互補的靶基因 mRNA 鏈并與之相互結合，隨后目的基因mRNA在特異的位點被切割從而導致目的基因降解［2］。目前RNA干擾技術主要包括直接化學合成siRNA及構建短發夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）的表達載體兩種途徑。直接化學合成siRNA具有合成方便，但轉染效率不確定，且基因沉默持續時間較短。短發夾RNA由兩個短反向重復序列及中間一莖環（loop）序列鏈接組成發夾結構。將siRNA序列設計作為shRNA克隆進載體中，當其轉染入細胞內時，該發夾序列被表達出來，形成shRNA，隨即被Dicer酶分解莖環產生siRNA，進而由上述RNAi通道產生靶基因的沉默。短發夾RNA表達載體具有基因沉默持續時間長，可構建穩定表達siRNA的細胞株等優點，但費用較高［3］。

2 RNA干擾技術在哮喘治療中的應用

自RNA干擾技術產生以來，因其對靶基因的良好沉默效果使其迅速成為各個領域的研究熱點，其中在哮喘的治療研究中展現出令人興奮的進展。目前相關研究主要包括以下五大靶點。

2.1 細胞因子 輕中度過敏性哮喘常以氣道慢性炎癥的急性加重為特征，表現為2型輔助性CD4+T淋巴細胞（Type 2 T helper cells，Th2）的激活及嗜酸性粒細胞的滲出，并且與IgE的產生，黏液分泌細胞的增生和化生，氣管壁的重塑及氣道的高反應性相關。Th2細胞分泌的一系列細胞因子如白細胞介素（Interleukin，IL）-5，9，13分別在嗜酸性細胞增多癥，肥大細胞增多癥，氣道黏液過度分泌中起著調控作用。肥大細胞、嗜酸性粒細胞、桿狀細胞通過滲出、激活并分泌各自產生的介質，促進氣道慢性過敏性炎癥的發生［4］。因此較多研究將各種Th2細胞因子為研究靶點，嘗試通過RNA干擾技術抑制其表達從而達到治療哮喘的目標。Lee等［5］通過氣道滴入以慢病毒為載體的IL-4特異性shRNA及IL-13特異性shRNA，發現抑制哮喘模型小鼠的氣道嗜酸性粒細胞性炎癥，減輕氣道高反應性及減少IL-4，5，13等Th2細胞因子的釋放。Huang等［6］通過氣管注射表達IL-5 siRNA的慢病毒后，顯著改善哮喘小鼠的氣道高反應性和嗜酸粒細胞浸潤，從而使哮喘得到控制。Li 等［7］通過對哮喘模型小鼠氣道吸入表達IL-23的shRNA，顯著減弱IL-23的表達，同時減弱肺部嗜酸性細胞及中性粒細胞的滲出，同時減少血清中IgE，IL-4，IL-17等的表達，起到抗炎作用。

2.2 趨化因子 在哮喘等慢性氣道炎癥疾病中，招募白細胞進入氣道的趨化因子是產生炎癥的重要環節。其中，嗜酸性細胞選擇性趨化因子如CCL11、CCL24、CCL26等通過結合CCR3受體在招募嗜酸性細胞的聚集與滲出起著重要作用。Errahali 等［8］通過CCL26-siRNA轉染至人類II型肺泡上皮細胞，發現顯著抑制CCL-5，8，13，15，26等一系列趨化因子的表達，并顯著抑制嗜酸性細胞的遷徙與激活，為進一步在人體哮喘治療提供了新思路。

2.3 酪氨酸激酶 在哮喘的發病機制中，Th2細胞的激活與其分泌的一系列細胞因子起著重要作用。目前已有一系列旨在阻斷Th2細胞過度分化，糾正Th1/Th2失衡的研究，其中包括抑制酪氨酸激酶，如淋巴細胞特異性酪氨酸激酶（lymphocyte specific tyrosine kinase，LCK）和脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase，Syk）。Lck是T細胞分化中起調控作用的酶。抗原遞呈細胞（如樹突狀細胞）將抗原攝取、加工后，由主要組織相容性復合物II（MHC II）攜帶抗原肽至細胞膜上，并被初始T細胞上的T細胞受體（TCR）識別，后者在Lck的作用下啟動一系列信號傳導，使Th0細胞向Th2細胞方向分化，并釋放一系列Th2細胞因子，導致哮喘的急性變態反應［9］。Zhang 等［10］通過向哮喘模型小鼠尾靜脈注射lck特異性siRNA，減少肺組織嗜酸性粒細胞的滲出及減少肺部和血清中IgE，IL-4的表達，從而減輕肺部炎癥。Syk是樹突狀細胞（DC）的抗原遞呈過程和FceR介導肥大細胞激活所必需的激酶，在Th2細胞和B細胞活化，以及細胞因子受體所介導的信號傳導通路中起重要作用。Huang 等［11］將Syk特異性siRNA經鼻部滴入哮喘模型小鼠中，發現顯著減少肺部炎癥細胞的浸潤。

2.4 表面分子 CD40屬于TNF受體超家族的一員，在抗原提呈細胞（APC）的成熟中起重要作用。APC上的CD40與T細胞上的CD154相互作用進而激活T細胞，增加Th2細胞因子的表達及促進T細胞的增殖。Suziki 等［12］構建的以CD40為靶向的siRNA減少哮喘模型小鼠的鼻部癥狀及嗜酸性粒細胞血癥。共刺激分子CD80/ CD86是樹突狀細胞的表面抗原，通過CD80 /CD86- CD28通路在啟動Th活化，促使Th0細胞向Th2細胞方向分化的過程中起重要作用。Li 等［13］通過將CD80和 CD86特異性 siRNA共同轉染至哮喘模型小鼠骨髓來源的成熟樹突狀細胞中，發現降低IL-4等Th2細胞因子及提高INF-γ等Th1細胞因子的表達，抑制Th細胞向Th2細胞的分化，糾正Th1/Th2失衡。Asai-Tajiri 等［14］通過氣道滴入CD86特異性siRNA，改善哮喘模型小鼠的嗜酸性粒細胞增多及氣道高反應性，降低IL-5，IL-13等Th2細胞因子的釋放。

2.5 轉錄因子 在抑制T細胞向Th2細胞過度分化這一治療策略的研究中，除上述靶向針對激酶，細胞表面分子等外，靶向抑制轉錄因子也是一大研究熱門。包括信號轉導與轉錄激活因子（signal transducers and activators of transcription，STAT）STAT1、STAT5、STAT6、 GATA結合蛋白和NF -κB等。STAT1 是連接多種細胞膜受體與選擇性效應器間信號轉導的主要蛋白質，在細胞因子調節網絡中起著重要作用。劉春鳳等［15］通過siRNA沉默STAT1的表達抑制嗜酸性細胞的增殖及減少Th1/Th2細胞比例失衡，減輕氣道炎癥。JAK-STAT5信號通路是T細胞增殖過程中極為重要的信號傳導途徑。當STAT5受到TCR相關信號刺激時活化，能引起下游靶基因如cyclin D1、c-myc和bcl-2等抑凋亡基因過表達，從而抑制T細胞凋亡。邱晨等［16］通過構建siRNA抑制哮喘模型小鼠的脾臟T細胞STAT5的表達，抑制T細胞的增殖及促進T細胞的凋亡，從而減輕肺部炎癥。GATA3是T細胞中表達多向性的轉錄因子，其通過正反饋機制維持Th2分化狀態，是Th2功能分化及Thl/Th2平衡的關鍵轉錄因子。Lee 等［17］通過局部應用以慢病毒為載體的GATA3特異性shRNA，減輕哮喘模型小鼠的氣道炎癥及氣道高反應性。

3 待解決問題

盡管眾多應用RNA干擾技術針對哮喘發病機制中不同靶點的實驗研究取得富有前景的進展，但要真正將其應用至臨床實踐中，仍有一些問題亟待解決。

3.1 脫靶效應 脫靶效應指siRNA對非靶mRNA的敲除作用。關于脫靶效應的機制尚不十分明確，目前普遍認為siRNA上的種子區域包括miRNA上的引導鏈上的第2至第8個核苷酸，能被miRNA所識別，進而siRNA可通過種子區域的雜交啟動類似miRNA途徑的抑制基因表達的作用。目前一些化學修飾及改變siRNA設計的措施可減少脫靶效應的風險，但會一定程度上降低siRNA的效能，故如何更深入的了解脫靶效應及避免其發生仍需進一步探究［18-19］。

3.2 固有免疫系統的激活 SiRNA中特異的序列如5'-GUCCUUCAA-3'，可被Toll樣受體識別進而誘導機體激活固有免疫系統，產生干擾素及促進一系列炎癥細胞因子的產生［20］。鑒于哮喘是氣道慢性炎癥性疾病，siRNA導致的免疫系統的激活有可能加重炎癥的進展，誘發哮喘的發作，故需要進一步探討解決方案。

3.3 給藥方式 鑒于全身給藥會讓siRNA易被血清中的核酸酶降解并經腎臟排泄，同時也會通過TOLL樣受體（TLR）激活固有免疫，導致炎癥因子的增加，故局部用藥在哮喘治療研究的給藥方式中十分重要。目前動物實驗的主要給藥方式有鼻內滴入或噴灑給藥，經氣管切開插管給藥，經口氣道內噴曬給藥，以及吸入給藥等。鼻內給藥因藥物難以到達下呼吸道以及肺內的分布不均勻，目前較少應用于哮喘研究。氣管切開插管給藥雖然效果好，但由于其有創性，可能難以令患者接受。經口氣道內噴曬給藥在動物實驗中多是自制的簡易裝置，優點是無創、可靠，但應用于人類呼吸道需要開發更舒適、更符合人解剖生理的裝置。吸入給藥分為計量劑量吸入（MDIs）及干粉吸入（DPIs），是肺內給藥的重要方式。但由于目前吸入型的siRNA較少，及需要尋找合適載體在干燥過程中保護核酸免受因側切力和溫度導致的降解，吸入給藥仍需改進和研究［21-22］。

3.4 合適載體 SiRNA的負電荷屬性及化學易降解性要求在基因干擾治療中加入載體以增加其穩定性，以及促進其對靶細胞的轉染。目前有病毒載體及包括脂質、多聚體等非病毒載體。病毒載體包括逆轉錄病毒、腺病毒、慢病毒等，具有轉染成功率高的特點，但其有可能激活免疫系統產生各種并發癥，且一些病毒載體會將其基因隨機插入宿主的染色體中，以上這些限制病毒載體的應用。與之相比，脂質載體及多聚體載體具有低毒性的特點［23］。尋找安全可靠又富有效率的載體仍是一個挑戰。

4 展望

相對于利用小分子，蛋白，單克隆抗體為形式的傳統藥物，RNA干擾治療擁有幾個優勢。與傳統藥物不同的是，基于RNA干擾的治療方法幾乎可以高選擇性、高效抑制各個層次的基因目標的表達，可以根據患者的情況開展個體化的治療，輕易合成，通過主要部位的鑒別與優化等幾個快速的步驟實現引導。如今已有正處于臨床試驗階段的治療哮喘的siRNA藥物，如ExcellairTM（ZaBeCor，Bala Cynwyd，PA，USA），一個吸入型靶向抑制Syk激酶的siRNA藥物，正處于II期臨床試驗中，顯示出良好的耐受性和一定的療效［24］。相比于現有的TNF-α抑制劑、白三烯抑制劑等僅作用于一種炎癥因子的藥物，作用于Syk激酶的siRNA通過作用于炎癥發生的初始步驟（B細胞的激活）從而抑制多種炎癥因子的釋放，因此具有更好的抗炎效果。但哮喘的發病機制涉及諸多通路和分子，仍需進一步研究。RNA干擾技術作為一門新的技術，相信隨著化學修飾技術的進步，對脫靶效應研究的深入，及對分子水平及基因水平上的哮喘發病機制的更深入了解，RNA干擾技術可以成為人類控制哮喘新的手段。

［1］ Global Initiative for Asthma． Global Strategy for Asthma Management and Prevention,2016．

［2］ Mehrotra N,Tripathi RM．Short interfering RNA therapeutics: nanocarriers,prospects and limitations．Iet Nanobiotechnology,2015, 9(6):386-395．

［3］ Donald D Rao, John S Vorhies, Neil Senzer, et al． siRNA vs．shRNA: Similarities and differences． Advanced Drug Delivery Reviews, 2009,61(9):746-759．

［4］ Hansbro PM, Kaiko GE, Foster PS． Cytokine/anti-cytokine therapy-novel treatments for asthma．British Journal of Pharmacology, 2011,163(1):81-95．

［5］ Lee CC,Huang HY,Chiang BL．Lentiviral-mediated interleukin-4 and interleukin-13 RNA interference decrease airway inflammation and hyperresponsiveness．Human Gene Therapy, 2011, 22(5):577-586．

［6］ Huang HY,Lee CC,Chiang BL．Short hairpin RNAs against eotaxin or interleukin-5 decrease airway eosinophilia and hyperresponsiveness in a murine model of asthma．Journal of Gene Medicine,2009,11(2):112-118．

［7］ Li Y,Sun M,Cheng H,et al．Silencing IL-23 expression by a small hairpin RNA protects against asthma in mice．Experimental & Molecular Medicine,2011,43(4):197-204．

［8］ Errahali Y J,Taka E,Abonyo BO,et al．CCL26-targeted siRNA treatment of alveolar type II cells decreases expression of CCR3-binding chemokines and reduces eosinophil migration:implications in asthma therapy．Journal of Interferon & Cytokine Research the Official Journal of the International Society for Interferon & Cytokine Research,2009,29(4):227-239．

［9］ Rangarajan S,Mariuzza RA．T cell receptor bias for MHC:coevolution or co-receptors．Cellular & Molecular Life Sciences Cmls,2014,71(16):3059-3068．

［10］ Zhang S,Yang R,Zheng Y．The effect of siRNA-mediated lymphocyte-specific protein tyrosine kinase(Lck)inhibition on pulmonary inflammation in a mouse model of asthma．International Journal of Clinical & Experimental Medicine, 2015,8(9):15146-15154．

［11］ Huang ZY, Kim MK, Kim-Han TH, et al． Effect of locally administered Syk siRNA on allergen-induced arthritis and asthma． Molecular Immunology,2013,53(1-2):52-59．

［12］ Suzuki M,Zheng X,Zhang X,et al．Novel vaccination for allergy through gene silencing of CD40 using small interfering RNA．Journal of Immunology,2008,180(12):8461-8469．

［13］ Li JG,Ym DU,Yan ZD,et al．CD80 and CD86 knockdown in dendritic cells regulates Th1/Th2 cytokine production in asthmatic mice．Experimental & Therapeutic Medicine,2016,11(3)．

［14］ Asai-Tajiri Y,Matsumoto K,Fukuyama S,et al．Small interfering RNA against CD86 during allergen challenge blocks experimental allergic asthma．Respiratory Research,2014,15(1):132-132．

［15］ 劉春鳳,任磊,熊瑛．RNAi技術沉默STAT1基因對哮喘小鼠氣道炎癥的影響．瀘州醫學院學報,2015(1):7-10．

［16］ 邱晨,張婷,齊暉,等．STAT5基因沉默對支氣管哮喘小鼠T細胞增殖的影響．中華結核和呼吸雜志,2012,35(1):50-54．

［17］ Lee CC, Huang HY, Chiang BL． Lentiviral-mediated GATA-3 RNAi decreases allergic airway inflammation and hyperresponsiveness． Molecular Therapy,2008,16(1):60-65．

［18］ Olejniczak M,Polak K,Galka-Marciniak P,et al．Recent advances in understanding of the immunological off-target effects of siRNA．Current Gene Therapy,2011,11(6):532-543．

［19］ Chen X, Liu P, Chou HH． Whole-genome thermodynamic analysis reduces siRNA off-target effects． Plos One, 2012, 8(3): e58326-e58326．

［20］ Naito Y,Ui-Tei K．Designing functional siRNA with reduced off-target effects．Methods Mol Biol,2013,942:57-68．

［21］ Zhou Y,Zhang C,Wei L．Development of RNAi technology for targeted therapy - A track of siRNA based agents to RNAi therapeutics．Journal of Controlled Release,2014,193:270-281．

［22］ Fujita Y,Takeshita F,Kuwano K,et al．RNAi Therapeutic Platforms for Lung Diseases．Pharmaceuticals,2013,6(2):223-250．

［23］ Merkel OM, Rubinstein I, Kissel T． siRNA delivery to the lung: what's new．Advanced Drug Delivery Reviews, 2014,75:112-128．［24］ Xie Y,Merkel OM．Pulmonary Delivery of siRNA via Polymeric Vectors as Therapies of Asthma．Archiv Der Pharmazie,2015, 348(10):681-688．

國家自然科學基金青年項目（81302934）；浙江省科技廳錢江人才計劃（2012 R10063）；浙江省博士后科研資助項目（BSH1402070）

310053 浙江中醫藥大學第一臨床醫學院（楊宏寬 潘俊杰 張佳穎 王佳君 王芳）

310006 浙江中醫藥大學附屬第一醫院（陳芳）

*通信作者