健脾補土法組方對腦缺血/再灌注損傷大鼠腦組織t-PA、PAI-1、ColⅣ的影響*

鐘銀玲李 花，3△劉旺華彭智遠，2

（1.湖南中醫藥大學中醫學院，湖南 長沙，410208；2.湖南中醫藥大學中醫診斷學重點學科，湖南 長沙 410208；3.湖南中醫藥大學中醫診斷學湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208；4.湖南中醫藥大學數字中醫藥協同創新中心，湖南 長沙 410208）

·研究報告·

健脾補土法組方對腦缺血/再灌注損傷大鼠腦組織t-PA、PAI-1、ColⅣ的影響*

鐘銀玲1李 花1，3△劉旺華2，3，4彭智遠1，2

（1.湖南中醫藥大學中醫學院，湖南 長沙，410208；2.湖南中醫藥大學中醫診斷學重點學科，湖南 長沙 410208；3.湖南中醫藥大學中醫診斷學湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208；4.湖南中醫藥大學數字中醫藥協同創新中心，湖南 長沙 410208）

目的觀察健脾補土法組方對腦缺血/再灌注損傷大鼠t-PA、PAI-1、ColⅣ的影響，探討其保護神經細胞可能作用機制。方法 將72只雄性SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、依達拉奉組、健脾補土方小劑量組、健脾補土方中劑量組、健脾補土方大劑量組，每組12只。采用線栓法制備MCAO模型，治療7 d后處死，并在大鼠處死前進行神經功能缺損評分，應用酶聯免疫吸附（ELISA）法測定中組織型纖溶酶原激活物（t-PA）及組織型纖溶酶原激活物抑制物-1（PAI-1）的變化，運用免疫組化法測定膠原蛋白Ⅳ（ColⅣ）的含量變化。結果與模型組相比，健脾補土小、中、大劑量組神經功能缺損癥狀評分減少（P<0.05）；健脾補土方小、中、大劑量組t-PA表達明顯降低（P<0.05或P<0.01）；健脾補土方小、中、大劑量組PAI-1表達明顯升高（P<0.05或P<0.01）；健脾補土方小、中劑量組Col IV表達明顯升高（P<0.05）。結論健脾補土法組方能改善腦缺血/再灌注損傷大鼠神經缺損，可能與其下調t-PA及上調PAI-1的表達，從而減少細胞外基質（ECM）的降解，上調ColⅣ的表達有關。

腦缺血/再灌注 健脾補土法 組織型纖溶酶原激活物 組織型纖溶酶原激活物抑制物-1 膠原蛋白Ⅳ

腦卒中是一類臨床常見病，具有高發病率、高病死率、高致殘率、高復發率的“四高”特點［1］。腦卒中可分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中，其中缺血性腦卒中發生率達85%，其中，進展性腦卒中占20%~40%［2］，常致患者遺留嚴重的功能殘疾。缺血性腦卒中易發生再灌注損傷。凝血系統和纖溶系統的平衡失調在腦梗死發病機理中所起到的作用日益受到關注。t-PA、PAI是反應體內纖溶活性的重要指標，纖溶狀態取決于t-PA和PAI的平衡情況。ColⅣ是細胞外基質的重要成分之一，具有支撐、保護細胞外基質的作用。而健脾補土法組方對腦缺血疾病有保護作用，在臨床上也應用于腦卒中的恢復期治療［3］。本研究采用改良Longa EZ等［4］線栓法建立大腦中動脈閉塞局灶性腦缺血模型（MCAO模型），探討健脾補土法組方對t-PA、PAI-1、ColⅣ含量的影響及神經功能缺損評分的影響，從而探討健脾補土法組方改善腦缺血/再灌注損傷大鼠神經缺損與細胞外基質、纖溶系統關系。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物分組 雄性SPF級SD大鼠72只，體質量230~270 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號：SCSK（湘）2013-0004。動物合格證號：NO43004700006140。SPF級實驗室喂養，室溫20~25℃，相對濕度35%~65%。將72只SD雄性大鼠在造模前進行初分組，按隨機數表法分為假手術組12只、模型制備組60只。將造模后的60只大鼠隨機分成模型組、依達拉奉組、健脾補土方小劑量組、健脾補土方中劑量組、健脾補土方大劑量組5組。每組12只。

1.2 藥物 健脾補土法組方藥物組成：人參15 g，白術12 g，茯苓10 g，黃芪15 g，山藥12 g，薏苡仁12 g，炙甘草6 g（各藥物從湖南中醫藥大學附屬第一醫院購買）。取各藥加水適量，浸泡2 h，水煎煮。第1次用6倍水，煎煮40~50 min；第2次用3倍水，煎煮30 min。2次水煎液混合，濃縮至生藥濃度為1 g/mL，滅菌分裝，4℃冷藏備用。依達拉奉注射液，吉林省博大制藥有限公司生產，批號80-140603，國藥準字H20070051，規格10 mL/15 mg。

1.3 試劑與儀器 MK3酶標儀，美國BIO-TEK；ColⅣ免疫組化試劑盒，批號MK0749，武漢博士德生物工程有限公司提供。大鼠纖溶酶原激活物（t-PA）ELISA試劑盒，批號QY-R2058，武漢博士德生物工程有限公司提供。大鼠纖溶酶原激活物抑制物（PAI-1）ELISA試劑盒，批號SBJ-R0005，武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.4 模型制備 采用改良Longa EZ等的線栓法建立大腦中動脈閉塞局灶性腦缺血模型 （MCAO模型），于缺血2 h后進行再灌注。假手術組除不插線外，其余過程同造模組。模型成功者納為研究對象，意外死亡大鼠由預備大鼠隨時補給。

1.5 給藥劑量與方式 給藥劑量根據70 kg成人每日服用82g生藥劑量按體表面積進行換算，從手術后清醒后開始給藥，每日同一時間點給藥，連續給藥7 d。具體如下：假手術組（灌胃蒸餾水；腹腔注射0.9%氯化鈉注射液）、模型組（灌胃蒸餾水；腹腔注射0.9%氯化鈉注射液）、依達拉奉組（3.2 mg/kg，腹腔注射；灌胃蒸餾水）、健脾補土小劑量組（灌胃劑量3.69 g/kg，相當于1/2臨床等效劑量；腹腔注射0.9%氯化鈉注射液）、健脾補土中劑量組（灌胃劑量7.38 g/kg，相當于臨床等效劑量；腹腔注射0.9%氯化鈉注射液）、健脾補土大劑量組（灌胃劑量14.76g/kg，相當于臨床等效劑量2倍；腹腔注射0.9%氯化鈉注射液）。

1.6 標本采集與檢測 1）給藥7 d后取材，從各組中隨機抽取6只大鼠，將大鼠經10%水合氯醛麻醉后，迅速斷頭取腦放于冰盤上，小心剝離軟腦膜，取缺血區大腦皮層組織，將取的大腦皮層組織用冰PBS洗滌后放入消毒后EP管并標記。80℃保存備用。采用ELISA法檢測t-PA和PAI-1。向預存腦組織中加入PBS冰浴充分勻漿，3500 r/min離心15 min后取上清液，先向待測樣品孔中加入待測樣品，洗滌后加一抗工作液，充分反應；洗滌后加酶標抗體工作液，充分反應；洗滌后加入底物工作液，充分反應后加入終止液，酶標儀450 nm波長下讀取吸光度值（OD值），以標準品之OD值繪制標準曲線，根據標準曲線公式換算含量。2）將每組余下的6只大鼠用10%水合氯醛麻醉后，固定后打開胸腔暴露心臟，經左心室快速灌注生理鹽水200 mL，至流出液變清，再緩慢灌注4%多聚甲醛300 mL，至肝臟變硬白后斷頭取腦，切取左側視交叉后5 mm的冠狀切片，層厚為5 μm，置于4%多聚甲醛固定24 h以上。制成石蠟切片。采用免疫組化法檢測ColⅣ。將切片脫蠟至水，3%H2O2去離子水孵育10 min，PBS充分漂洗2 min×3次，滴加ColⅣ抗體，37℃孵育2 h，PBS充分漂洗2 min×3次，滴加聚合物輔助劑，37℃孵育20 min，PBS充分漂洗2 min×3次，滴加辣根酶標記，抗兔IgG多聚體，37℃孵育20 min，PBS充分漂洗2 min×3次，DAB顯色液室溫下顯色，沖洗，復染、脫水、透明、封片。用PBS代替ColⅣ抗體作陰性對照。在大鼠腦缺血皮質區同倍（400倍）的6個不同視野，用病理圖像分析軟件系統分析。統計每個視野下ColⅣ平均灰度值，取平均值。

1.7 神經功能評分 根據國際公認的大鼠腦卒中后神經功能缺損評分法即mNSS評分［5］進行神經功能評分，采用雙盲法，缺血再灌注后第7日處死前2 h進行評分。評判標準：1~6分為輕型受損；7~12為中型受損；13~18分為重型受損。

1.8 統計學處理 應用SPSS19.0統計軟件分析。計量資料以（s）表示。多組間均數比較用單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊者用LSD法檢驗，方差不齊者用Dunnet’s T3法檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組神經功能缺損評分比較 見表1。各造模組動物在造模清醒后均出現了神經功能缺損癥狀，假手術組在造模清醒后及處死前都沒出現神經功能缺損癥狀。與假手術組相比，模型組的神經功能缺損癥狀評分顯著增加（P<0.01）；與模型組比較，依達拉奉組、健脾補土小劑量、健脾補土中劑量組、健脾補土大劑量組神經功能缺損癥狀評分顯著降低（P<0.05）。

表1 各組大鼠神經功能評分及腦組織ColⅣ表達水平比較（s）

表1 各組大鼠神經功能評分及腦組織ColⅣ表達水平比較（s）

與假手術組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組 別 n ColⅣ（ng/L） 神經功能評分（分）假手術組 6 121.55±46.92 0.00±0.00模型組 6 51.34±13.15*9.17±2.14*依達拉奉組 6 87.42±20.73△4.83±1.17△△健脾補土小劑量組 6 90.29±35.71△6.67±1.37△△健脾補土中劑量組 6 89.16±14.76△5.17±2.14△△健脾補土大劑量組 6 78.18±18.41 5.00±2.00△△

2.2 健脾補土法組方對ColⅣ表達的影響 見表1。與假手術組比較，模型組大鼠缺血側腦組織中ColⅣ表達明顯降低（P<0.01）；與模型組比較，依達拉奉組及健脾補土方小、中劑量組ColⅣ表達明顯升高（P<0.05）。2.3 各組t-PA、PAI-1水平比較 見表2。與假手術組比較，模型組大鼠缺血側腦組織中t-PA、PAI-1表達明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，依達拉奉組及健脾補土方中、大劑量組t-PA表達明顯降低（P<0.05或P<0.01），依達拉奉組及健脾補土方小、中、大劑量組PAI-1表達明顯升高（P<0.05或P<0.01）。

3 討 論

中醫學認為腦結構和功能的物質基礎為“血氣”與“精氣”，腦的正常活動需氣血津液的滋養［6］。脾胃為后天之本，氣血津液生化之源。故有“內傷脾胃，百病由生”之說。本研究健脾補土組方是在中醫辨證論治和整體觀念指導下由多味中藥配伍而成［7］，其中四君子湯為治療脾胃氣虛的基本方［8］，方中人參甘溫益氣；白術健脾燥濕；茯苓健脾滲濕；炙甘草益氣和中，調和諸藥；山藥能補脾益氣，補腎滋陰；黃芪能保護脾胃升發之氣，且能避免苦寒之品傷脾敗胃；脾虛則生濕，故加薏苡仁利水健脾滲濕。諸藥配伍地當，健脾補土之功尤著。

表2 各組大鼠腦組織t-PA、PAI-1表達水平比較（s）

表2 各組大鼠腦組織t-PA、PAI-1表達水平比較（s）

組 別 n t-PA（ng/L） PAI（ng/L）假手術組 6 242.96±72.44 101.31±22.91模型組 6 543.29±112.67**189.86±24.94**依達拉奉組 6 406.62±148.01△319.48±27.66△△健脾補土小劑量組 6 339.13±122.11△△284.94±41.43△健脾補土中劑量組 6 383.00±89.73△299.49±50.33△健脾補土大劑量組 6 342.51±93.53△△338.90±70.93△

神經細胞外基質的破壞和降解在腦缺血再灌注損傷過程中發揮重要作用［9］。ECM是由細胞合成并分泌到胞外、分布在細胞表面或細胞之間的大分子，不僅在支持、連接和維持組織形態方面起重要作用，而且具有調節細胞粘附、生長、分化、促進細胞遷移、增殖、離子交換和信息傳遞的功能。膠原（Col）是細胞外基質的重要成分之一，可與細胞表面上的特異性受體結合，通過受體與細胞骨架結構直接聯系或通過細胞內的一系列信號傳導而引起不同的下游基因的表達［10］。本課題前期研究［3，7，9，11］結果顯示，經健脾補土方藥治療后，腦卒中患者MMSE、ADL、HDS量表得分均有明顯升高，表明健脾補土方藥對改善缺血性腦卒中患者后遺癥有較好療效；健脾補土法對腦缺血/再灌注（I/R）損傷后大鼠神經功能評分有改善，能降低神經元凋亡指數，保護血腦屏障，抑制NF-κB炎癥信號通路，增加某些ECM成分如LN表達和減少基質金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9的表達。

人體的纖溶系統主要由纖溶酶原、纖溶酶、纖溶酶原激活物和纖溶酶原激活劑抑制劑組成［12］。t-PA及PAI是反應體內纖溶活性的重要指標，纖溶狀態取決于t-PA和PAI的平衡情況，PAI與t-PA形成1∶1復合物，使t-PA失活［13］。t-PA是纖溶系統的主要激活劑，它通過激活纖溶酶原形成纖溶酶而溶解纖維蛋白，生成纖維蛋白降解產物。近年來國內有關t-PA與細胞外基質關系的研究不多。有研究表明［14］，t-PA可能通過產生纖溶酶原以及激活基質金屬蛋白酶而在細胞外基質降解過程中起重要作用。也有研究顯示［15］，腦梗死患者血漿t-PA及PAI-1活性均高于正常組，且t-PA增高幅度較PAI-1大，體內纖溶系統相對亢進。有動物實驗［16］表明，MCAO大鼠在腦缺血再灌注損傷后，神經元及血管內皮細胞t-PA表達增加。

本實驗結果顯示，在腦缺血在灌注后，模型組t-PA及PAI活性均高于正常組，且t-PA增高幅度較PAI大，而檢測的模型組大鼠缺血側腦組織中ColⅣ表達明顯降低，可以推測在腦缺血再灌注后纖溶活性增強，作為纖溶系統主要激活劑的t-PA很有可能激活金屬基質蛋白酶而參與細胞外基質比如ColⅣ降解過程。這種推測與本課題前期研究結果相符合。在連續給藥7 d后，依達拉奉組、健脾補土小劑量、健脾補土中劑量組、健脾補土大劑量組神經功能缺損癥狀評分減少，能不同程度降低t-PA的表達，抑制了纖溶系統活性，且升高ColⅣ表達，減少細胞外基質的降解，保護神經細胞。其保護神經細胞的作用的具體機制仍有待研究，可能與藥物劑量及治療的時間長短等有關。

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The Effect of Spleen-strengthening Therapy on t-PA and PAI and Col IV in Rats with Cerebral Ischemi-a/Reperfusion Injury

Z HONG Yinling，LI Hua，LIU Wanghua，et al. School of Traditional Chinese Medicine of Hunan University of Chinese Medicine，Hunan，Changsha 410208，China.

Objective：To study the effect of Spleen-strengthening therapy on t-PA，PAI-1 and ColⅣand in rats with cerebral ischemia/reperfusion injury and investigate its possible mechanism.Methods：72 male SD rats were randomly divided into sham-operation group，modelling group，edaravone group and low-dosed spleenstrengthening group，middle-dosed spleen-strengthening group，high-dosed spleen-strengthening group，12 in each group.The models of MCAO were induced by middle cerebral artery occlusion and recanalization executed after treatment of 7 days，and nerve function defect score of the rats was evaluated before death.ELISA was used to detect the expression levels of t-PA and PAI-1.Immunohistochemical staining was used to detect the expression levels of ColⅣ.Results：Compared with the modelling group，nerve function defect score was obviously decreased（P<0.05）in low-dosed spleen-strengthening group，middle-dosed spleen-strengthening group and highdosed spleen-strengthening group.Compared with the modelling group，the expression of t-PA was obviously decreased（P<0.05 or P<0.01）and PAI was obviously increased（P<0.05 or P<0.01）in low-dosed spleenstrengthening group，middle-dosed spleen-strengthening group and high-dosed spleen-strengthening group.Compared with the modelling group，the expression of ColⅣwas obviously increased（P<0.05）in low-dosed spleenstrengthening group and middle-dosed spleen-strengthening group.Conclusion：Spleen-strengthening therapy decreases neurological deficit in rats with cerebral ischemia/reperfusion injury.The mechanism may be the inhibi-tion of the expression of t-PA and promotion of the expression of PAI，which promotes the expression of ColⅣand reduces the degradation of ECM.

Cerebral ischemia/reperfusion；Spleen-strengthening therapy；t-PA；PAI-1；ColⅣ

R285.5

A

1004-745X（2016）12-2213-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.12.002

2016-09-19）

國家自然科學基金項目（81202632、81473567）；教育部博士點基金項目（20124323120003）；湖南省自然科學基金項目（13JJ3097）；湖南省教育廳優秀青年基金項目（14B134）；湖南省教育廳高校創新平臺基金項目（15K092）

△通信作者（電子郵箱：flora119@sina.com）