復方七芍降壓片保護自發性高血壓大鼠血管內皮損傷的作用研究*

藺曉源劉 丹曾 勇

（1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007；2.湖南省中藥粉體與創新藥物省部共建國家重點實驗室培育基地，湖南 長沙 410208）

·研究報告·

復方七芍降壓片保護自發性高血壓大鼠血管內皮損傷的作用研究*

藺曉源1，2劉 丹1曾 勇1

（1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007；2.湖南省中藥粉體與創新藥物省部共建國家重點實驗室培育基地，湖南 長沙 410208）

目的探討復方七芍降壓片保護自發性高血壓大鼠（SHR）血管內皮損傷的作用機制。方法 將30只SHR大鼠根據體質量按隨機數字表法分為模型組、復方七芍降壓片組和厄貝沙坦片組，每組各10只。另取10只Wistar-kyoto（WKY）大鼠為正常組；給藥6周后，采用ELISA檢測血清中生長素（Ghrelin）、一氧化氮合酶（NOS）和內皮素-1（ET-1）的含量變化，RT-PCR測定胸主動脈Ghrelin受體（GHSR）、內皮型一氧化氮合酶（eNOS）的mRNA表達。結果模型組血清Grelin、NOS含量和胸主動脈GHSR、eNOS mRNA表達降低，血清ET-1含量升高，與正常組比較差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。復方七芍降壓片組和厄貝沙坦組上述指標均較模型組有不同程度的改善 （P＜0.05或P＜0.01），且復方七芍降壓片組對血清Ghrelin、NOS、ET-1含量和胸主動脈eNOS mRNA表達的影響優于厄貝沙坦組（P＜0.05）。結論復方七芍降壓片可能通過調節Ghrelin、NO、ET-1含量及GHSR、NOS的基因表達而起保護SHR大鼠血管內皮損傷的作用。

復方七芍降壓片 自發性高血壓大鼠 生長素 血管內皮活性物質

近年來隨著生物醫學的發展和深化，人們認識到原發性高血壓（EH）患者存在內皮依賴性血管舒張功能失調。因而逆轉血管內皮功能已成為EH治療的新靶點，尋找具有內皮細胞保護作用的藥物則成為治療的關鍵。生長素（Ghrelin）是內源性生長激素促分泌素受體（GHSR）的內源性配體，對心血管系統具有直接作用，能明顯降低血壓水平［1］。目前Ghrelin與EH發生發展的相互關系已成為國內外研究的熱點之一，而對于Ghrelin在EH血管內皮功能中的具體作用如何，尚存在爭議。針對EH“虛、瘀、風”的中醫病機，采用養陰柔肝、化瘀息風的復方七芍降壓片干預，能安全有效地降低患者血壓、改善臨床癥狀［2］。因此，為了進一步探討復方七芍降壓片治療EH的作用機制，我們觀察了其對自發性高血壓大鼠（SHR）大鼠Ghrelin及血管內皮活性物質一氧化氮合酶（NOS）和內皮素（ET-1）的影響。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物 8周齡SPF級SHR大鼠30只、Wistarkyoto（WKY）大鼠10只，雄性，體質量240~280 g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司 ［SCXK（滬）2012-0002］提供。

1.2 藥物 復方七芍降壓片（湖南中醫藥大學第一附屬醫院制劑科生產，規格：0.4 g/片），以蒸餾水配置成濃度為43.2 mg/mL的混懸液；厄貝沙坦片（安來，浙江華海藥業股份有限公司，國藥準字H20030016，規格：75 mg/片），用蒸餾水配置成濃度為1.52 mg/mL的混懸液。

1.3 試劑與儀器 大鼠Grelin、NOS、ET-1 ELISA試劑盒 （美國RD公司），YBR Green PCR試劑盒（KAPA Biosystems），逆轉錄試劑盒（TAKARA）。Enspire多功能酶標儀 （美國Perkinelmer），Universal HoodⅡ凝膠成像系統 （美國Bio-rad），Realplex2熒光定量PCR儀（德國Eppendorf），Lynx6000落地式高速離心機（美國Thermo Fisher），Pureloab Classic UVF超純水儀 （法國ELGA Labwater）。

1.4 分組與給藥 將SHR大鼠根據體質量按隨機數字表法分為模型組、復方七芍降壓片組和厄貝沙坦組，每組10只，另設WKY大鼠為正常組。復方七芍降壓片組動物灌胃復方七芍混懸液，厄貝沙坦組動物灌胃厄貝沙坦混懸液，灌胃劑量均為10 mL/kg，其他兩組灌胃等容量蒸餾水。給藥6周。

1.5 標本采集 各組大鼠末次給藥后10%水合氯醛（4 mL/kg）麻醉，置于冰盒上真空采血管心臟取血，4℃離心（3000 r/min）15 min，取上層血清置-20℃冰箱保存。取血后，迅速剪取小段胸主動脈組織，置于凍存管放入液氮中保存。

1.6 指標檢測 1）ELISA檢測血清中 Grelin、NOS、ET-1的含量變化，嚴格按照試劑盒操作步驟進行。2）RT-PCR測定胸主動脈GHSR、eNOS的mRNA表達，取待測組織，Trizol法進行總RNA提取和純度分析。合成cDNA第一條鏈，將制備好的cDNA進行PCR擴增。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，基因引物GHSR上游5'-CTACGCCACGGTCCTCA-3'、下游5'-CTTCACGCGGCCCTTA-3'，eNOS上游5'-CGGCATCACCAGGAAGAAGA-3'、下游5'-CATGAGCGGCGGAGAT-3'，內參基因 β-Actin引物上游 5'-CGTTGACATCCGTAAAGAC-3'、下游5'-TAGGAGC C AGGGCAGTA-3'。數據采用儀器自帶軟件qbase plus進行分析。

1.7 統計學處理 應用SPSS19.0統計軟件處理。計量資料以（s）表示，多組間的比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠血清Grelin、NOS、ET-1含量比較 見表1。模型組大鼠血清Grelin、NOS含量降低、ET-1含量升高，與正常組比較差異有顯著性統計學意義（P＜0.01）。復方七芍降壓片組和厄貝沙坦組血清Grelin、NOS水平升高，ET-1水平降低，與模型組比較差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01），且復方七芍降壓片組優于厄貝沙坦組（P＜0.05）。

表1 各組大鼠血清Grelin、NOS、ET-1含量變化比較（s）

表1 各組大鼠血清Grelin、NOS、ET-1含量變化比較（s）

與正常組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與厄貝沙坦組比較，＃P＜0.05。下同。

2.2 各組大鼠胸主動脈GHSR、eNOS mRNA表達比較 見表2。模型組胸主動脈GHSR、eNOS mRNA表達均較正常組降低（P＜0.05或P＜0.01）；復方七芍降壓片和厄貝沙坦均能上調GHSR、eNOS的mRNA表達，與模型組比較差異有統計學意義 （P＜0.05或P＜0.01），且復方七芍降壓片對eNOS的表達優于厄貝沙坦組（P＜0.05）。

表2 各組大鼠胸主動脈GHSR、eNOS mRNA表達變化比較（s）

表2 各組大鼠胸主動脈GHSR、eNOS mRNA表達變化比較（s）

3 討 論

2005年美國高血壓學會（ASH）提出了高血壓的新定義，改變了以往對于高血壓僅從單純的數值判斷的標準，而是將概念擴展到了總的心血管危險因素，包括動脈粥樣硬化、內皮細胞功能損害、高脂血癥和心血管事件等［3］。血管內皮功能障礙在EH中普遍存在，一旦內皮細胞受損，通過測定其分泌血管活性物質的水平，可判斷內皮細胞功能變化。Ghrelin是一個含有28個氨基酸的多肽，主要由胃黏膜分泌，受體分布于多種組織中，在小鼠的左心室、心房、主動脈等部位均發現有GHSR的存在［4］。諸多研究表明，Ghrelin在心血管系統中具有廣泛的生理病理作用［1］。外周靜脈注射大劑量Ghrelin可以降低血壓而不升高心率［5］。霍昱吉等研究顯示血漿Ghrelin水平與血壓呈負相關［6］，且其基因多態性研究也證明了這一相關性的存在［7］。Ghrelin除對心血管系統有保護作用外，Ghrelin及其受體在人類微血管內皮細胞中也有表達［8］。Ghrelin治療后血壓下降的機制可能包括通過激活內皮功能導致血管舒張或對血管平滑肌的直接作用［9］。現有研究推測：Ghrelin可以抑制內皮細胞死亡，增加eNOS的表達，直接誘導NO合成（通過NOS間接反映），從而改善內皮功能，擴張外周血管［10-11］；Chrelin是ET-1的內源性拮抗劑，可顯著抑制ET-1誘導的血管內皮損傷及血管收縮效應［12］。何云等研究表明，不同EH中醫證型間內皮活性物質NO、ET-1存在著一定的變化規律，可作為中醫高血壓病辨證分型的客觀化指標［13］。本研究結果顯示，模型組大鼠血清Grelin、NOS含量降低、ET-1含量升高，胸主動脈GHSR、eNOS mRNA表達下降（P＜0.05），說明Ghrelin水平與EH血管內皮功能密切相關。

EH屬中醫學“眩暈”“頭痛”等范疇，“陰虛陽亢、瘀血阻絡”是其發病的基本病機，并可用“虛、瘀、風”來概括，治宜治虛、治瘀、治風相結合［14］。我們采用養陰柔肝、化瘀息風立法的醫院制劑復方七芍降壓片治療效果確切。該方由三七、白芍、桑寄生、杜仲、丹參、天麻、蘿芙木、地龍、葛根、炒香附、甘草組成。方中三七活血化瘀通絡，白芍養陰柔肝息風，共為君藥。桑寄生、杜仲補益肝腎，丹參活血祛瘀，天麻平肝息風，均為臣藥。蘿芙木平肝清熱，地龍息風通絡，葛根生津活血，炒香附理氣疏肝，共為佐藥。甘草為使，調和諸藥。以上11味藥合用，使陰虛得補、陽亢得平、脈絡得暢、髓海得濡、清竅得養、眩暈自止。研究表明，復方七芍降壓片能有效降低血壓，其作用機制可能與改善血液高凝狀態和逆轉 SHR血管重塑有關［2，15］。本研究結果顯示，復方七芍降壓片能明顯改善SHR大鼠血清Grelin、NOS、ET-1水平和胸主動脈GHSR、eNOS mRNA表達，表明復方七芍降壓片對SHR大鼠血管內皮的保護作用可能與調節Ghrelin和血管內皮活性物質水平密切相關。而復方七芍降壓片對血清Ghrelin、NOS、ET-1含量和胸主動脈eNOS mRNA表達優于厄貝沙坦組，可能與中藥復方的多靶點效應有關。以上研究不但揭示了復方七芍降壓片治療EH的作用靶點，也為Ghrelin在血管內皮損傷中的作用提供了一定依據。

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Study on the Protective Effect of Fufangqishao Anti-hypertension Tablets on Vascular Endothelial Injury in Spontaneously Hypertensive Rats

LIN Xiaoyuan，LIU Dan，ZENG Yong. First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine，Hunan，Changsha 410007，China.

Objective：To explore the protective effect of Fufangqishao anti-hypertension tablets（FHT）on vascular endothelial injury in spontaneously hypertensive rats.Methods：30 SHR rats were randomly divided into model group，FHT group and irbesartan group.Another 10 Wistar-kyoto（WKY）rats were taken as the normal group.After 6 weeks of treatment，ELISA was used to detect the levels of serum Ghrelin，NOS and ET-1.The mRNA expression of GHSR，eNOS in the thoracic aorta were measured by RT-PCR.Results：Compared with the normal group，the levels of serum Ghrelin，NOS and the mRNA expression of GHSR，eNOS in the thoracic aorta decreased，serum ET-1 content increased in the model group and the difference was statistically significant（P< 0.05 or P<0.01）.The indexes above in FHT group and irbesartan group had different degrees of improvement compared with the model group（P<0.05 or P<0.01）.The effects on serum Ghrelin，NOS，ET-1 content and eNOS mRNA expression in thoracic aorta in FHT group were better than that of irbesartan group（P<0.05）.Conclusion：FHT may regulate Ghrelin，NOS，ET-1 content and GHSR，eNOS gene expression to protect vascular endothelial injury in SHR rats.

Fufangqishao anti-hypertension tablets；Spontaneously hypertensive rats；Ghrelin；Vascular endothelial active substance

R285.5

A

1004-745X（2016）12-2220-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.12.004

2016-08-20）

國家自然科學基金項目（81473616）；中醫內科重大疾病防治研究及轉化教育部重點實驗室開放基金（ZYNK201403）