附子中6種生物堿質譜裂解機制及醇解產物研究*

張 翅潘德林朱雅寧郝 莉

［1.華潤三九（雅安）藥業有限公司，四川 雅安 625000；2.成都中醫藥大學，中藥資源系統研究與開發利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 611137］

·實驗報告·

附子中6種生物堿質譜裂解機制及醇解產物研究*

張 翅1，2△潘德林1，2朱雅寧1，2郝 莉1

［1.華潤三九（雅安）藥業有限公司，四川 雅安 625000；2.成都中醫藥大學，中藥資源系統研究與開發利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 611137］

目的探討附子中6種生物堿裂解規律，研究雙酯型生物堿乙醇解產物。方法 采用HPLC-ESI-MS技術，在正離子模式下，掃描分析雙酯型生物堿在乙醇的轉化產物，并闡述其規律。結果通過對已知6種生物堿的多級質譜分析及文獻調研，總結了6種酯型生物堿的裂解規律，并確定了雙酯型生物堿的乙醇產物。結論3種雙酯型生物堿在乙醇中，發生乙醇解反應，分別生成8-乙氧基新烏頭堿、8-乙氧基烏頭堿和8-乙氧基次烏頭堿；由于反應在加熱條件下進行，還有焦烏頭堿的產生。

附子 烏頭堿 雙酯型生物堿 裂解規律 醇解產物

附子為毛茛科植物烏頭 （Aconitum carmichaeli Debx.）子根的加工品，是臨床常用的中藥材，具有回陽救逆、補火助陽、散寒止痛等功效［1］，被譽為“回陽救逆第一品”。其主要化學成分烏頭堿類生物堿，既是發揮藥效的主要有效成分，又是烏頭、附子中的主要有毒成分［2-3］。該類成分中的雙酯型生物堿毒性最大，對熱不穩定，容易發生水解和乙醇解反應。液質聯用技術在中藥成分研究中已經廣泛應用［4-5］，該技術與電噴霧電離技術聯合（HPLC-ESI-MS）用于樣品的快速分析及鑒定，具有靈敏度高、特異性強、快速、操作簡單等優勢。已經有文獻利用該技術對附子中生物堿的水解反應開展研究，分析了烏頭堿水解產物及其裂解產物、裂解規律［6-8］。本文對其醇解反應開展研究，通過HPLC-ESI-MS獲得質譜數據并進行分析，推斷出6種生物堿的質譜裂解行為，闡述了雙酯型生物堿醇解轉化規律，為含附子藥品的質量分析及安全性評價提供依據，有利于附子相關藥品的安全合理應用。

1 材料與方法

1.1 儀器 AE-240電子天平（METTLER），Agilent1260高效液相色譜儀，Thermo LCQ-FLEET質譜儀，UPT-1-40L優普超純水器，AS20500超聲儀（SCIENCE）。

1.2 試藥 新烏頭原堿（批號：110799-201307，中國食品藥品檢定研究院）；烏頭原堿 （批號：110720-200410，中國食品藥品檢定研究院）；次烏頭堿（批號：110798-201307，中國食品藥品檢定研究院）；苯甲酰新烏頭堿（批號：111795-201102，中國食品藥品檢定研究院）；苯甲酰烏頭堿（批號：111794-201303，中國食品藥品檢定研究院）；苯甲酰次烏頭堿 （批號：111796-201303，中國食品藥品檢定研究院）；乙腈（色譜純，Merck）；水為超純水；其他試劑均為分析純。

1.3 色譜條件 Agilent ZORBAX Extend-C18色譜柱（4.6 mm×250mm，5 μm），流動相40 mmol/L乙酸銨緩沖液（用氨水調pH=9.9，A）；乙腈（B），梯度洗脫0~10 min，72%A；10~15 min，72%~67%A；15~45 min，67%~50% A；45~60 min，50%A；流速1 mL/min，柱溫25℃；檢測波長235 nm。

1.4 質譜條件 電噴霧離子源，正離子模式檢測；霧化器壓強340 kPa；質量掃描范圍：m/z 100~1500；干燥氣體溫度320℃，干燥氣體（N2）流量5 L/min，碰撞氣體為Ar。

1.5 供試品溶液的制備 分別精密稱取對照品苯甲酰新烏頭堿2.24 mg，苯甲酰次烏頭堿2.51 mg，苯甲酰烏頭原堿2.68 mg，新烏頭堿1.31 mg，次烏頭堿1.73 mg，烏頭堿1.46 mg，用無水乙醇定容至100 mL（校正體積為99.4809 mL）容量瓶，得到對照品質量濃度分別為：苯甲酰新烏頭堿22.5169 μg/mL，苯甲酰次烏頭堿25.2310 μg/mL，苯甲酰烏頭原堿26.9398 μg/mL，新烏頭堿13.1684 μg/mL，次烏頭堿17.3903 μg/mL，烏頭堿14.6762 μg/mL的混合對照品。量取供試品溶液50 mL至圓底燒瓶中，加熱回流60 min，冷卻后，即得。檢測方法按照1.3和1.4條件進行檢測。

2 結 果

2.1 混標對照品乙醇解前后色譜圖比較 見圖1和圖2。6種生物堿基本可以達到分離，并且在ESI正離子模式下均可產生［M+H］+。根據對照品的保留時間和分子量，確定圖2中1、2、3、4、5和6號峰分別為苯甲酰新烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿。通過醇解前后液相色譜圖比較可以發現，經過醇解后新增加了圖2中的7、8、9、10和11共5個色譜峰。其混標溶液總離子流圖見圖3。

圖1 混合對品乙醇解前HPLC色譜圖

2.2 已知生物堿裂解規律分析 6種酯型生物堿結構圖見圖4，在ESI正離子模式下，烏頭類生物堿最常見的丟失碎片離子是CH3COOH、CH3OH、H2O等，通過研究各個對照品的多級質譜可以發現有如下特征離子：［M+H-32］+，［M+H-50］+，［M+H-60］+，［M+H-60-32-28］+，推斷規律如下：

圖2 混合對品乙醇解后HPLC色譜圖

圖3 混標溶液總離子流圖

圖4 6種酯型生物堿結構圖

離子［M+H-32］+：在烏頭類生物堿中，碎片32主要來源于甲氧基結構，這6種已知的生物堿結構存在4個甲氧基，根據文獻采用量子化學計算結構認為丟失的順序為C-16位、C-11位、然后是C-6位［9］。

離子［M+H-60］+：通過對比雙酯型生物堿和單酯型生物堿中MS2，發現雙酯型生物堿烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿存在［M+H-60］+，而單酯型生物堿并沒有發現此碎片離子峰，推測離子［M+H-60］+來源于雙酯型生物堿8位上的側鏈CH3COO和15位上的H組成，即為脫去一分子CH3COOH產物［10］，見圖6。

圖5 6種生物堿的質譜圖

離子［M+H-60-32-28］+：對比雙酯型生物堿和單酯型生物堿的碎片離子峰可以發現，雙酯型生物堿的質譜圖中均有碎片離子［M+H-60-32-28］+出現，碎片28一般是由CH2=CH2或者CO裂解產生，而只有烏頭堿上有乙基取代，所以碎片28只可能來源于CO［11］，見圖6。

圖6 雙酯型生物堿裂解碎片離子結構

離子［M+H-50］+：從對照品二級質譜數據發現離子［M+H-50］+存在于苯甲酰新烏頭堿和苯甲酰烏頭原堿中，而苯甲酰次烏頭堿不存在此離子峰，見圖5。根據結構可以初步判斷，碎片50的產生主要是脫去一分子水和一分子甲醇產生的。對比三種單酯型生物堿的結構，C-15和C-8上均有羥基，而C-3位上只有苯甲酰次烏頭堿沒有羥基，可以初步判斷離子［M+H-50］+中一分子水主要來自C-3位脫去一分子水［12］，見圖7和圖8。

圖7苯甲酰新烏頭堿和苯甲酰烏頭堿裂解碎片離子結構

在這6種已知的生物堿質譜中，沒有出現丟失苯甲酸的離子，即［M+H-122］+；因為如果丟失苯甲酸離子，會在9位和14位之間形成雙鍵，而雙鍵所連接的4個原子不在同一平面，這導致雙鍵的扭曲張力太強而無法形成。所以在二級或三級質譜中沒有苯甲酸離子信號。

圖8 苯甲酰次烏頭堿裂解碎片離子結構

2.3 醇解產物定性 8號峰MS圖顯示相對分子量為618（見圖9），與新烏頭堿相對分子量相比減少了14；MS2圖顯示，存在［M+H-50］+，不存在［M+H-60］+和［M+H-60-28］+離子，說明不存在乙酰基，因此7號峰不是去甲基產物，判斷為8位沒有乙酰氧基存在；MS3圖顯示，碎片離子顯示有［M+H-50-46］+出現，應為C8位脫去1分子乙醇的產物。根據已知新烏頭堿和苯甲酰新烏頭堿裂解規律以及文獻查閱［13］，鑒定7號峰應為8-乙氧基新烏頭堿。

圖9 8號峰、9號峰和11號峰的質譜圖

9號峰的分子量為632，11號峰的分子量為602，同樣的推理方法得出9號峰和11號峰分別為8-乙氧基烏頭堿和8-乙氧基次烏頭堿（見圖10、圖11）；乙醇解反應式見圖12。

圖10 8-乙氧基新烏頭堿和8-乙氧基烏頭堿裂解碎片離子結構

圖11 8-乙氧基次烏頭堿裂解碎片離子結構

圖12 雙酯型生物堿乙醇解反應

2.4 其他產物定性 7號峰從MS1可知（圖13），分子量為556；從MS2圖上可以看出，不存在碎片離子峰［M+H-60］+，說明不存在8-位乙酰基；存在碎片離子［M+H-32-28］+，說明存在CO基團。經查閱文獻，比對碎片離子峰，確定為焦烏頭堿，是由烏頭堿加熱轉化生成［14］。

3 討 論

烏頭堿類生物堿中烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿等雙酯型生物堿毒性最強，致死量極小。臨床應用時常需先煎久煎以減弱其毒性，其減毒機制是破壞C8位所連接的酯鍵，由烏頭堿等雙酯型生物堿水解生成苯甲酰烏頭堿等單酯型生物堿，達到減毒增效的目的。目前已有較多文獻對附子中烏頭堿質譜裂解行為和雙酯型生物堿的C8位所連接的酯鍵分解反應開展研究。陳玉娟等采用ESI-MS正離子模式掃描分析烏頭堿的多級質譜碎片，分析了烏頭堿的質譜裂解行為［10］；李錚等也采用ESI-MS正離子模式對烏頭堿、中烏頭堿和次烏頭堿的水解產物進行多級質譜檢測［15］；王峰峰等利用液質聯用技術，分別對烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿在水中和乙醇中的高溫分解產物進行定性分析［11］。這些研究闡明了部分烏頭堿的裂解規律，但都是對單一生物堿質譜裂解規律、水解及醇解產物的研究。由于生物堿之間存在相互作用，系統地對附子中6種生物堿質譜裂解規律開展研究，并對破壞雙酯型生物堿C8位酯鍵的方法開展研究，仍然有很重要的意義。

圖13 7號峰質譜圖

本文系統地研究了附子中6種酯型生物堿質譜裂解機制，為附子藥材、含附子的藥品以及含有該類生物堿的生物樣品快速定性、定量鑒別提供了依據，為類似化合物結構的鑒定和預測提供了參考。對于含有此6種生物堿的藥材及制劑，本研究為其質量標準制定提供了參考，有利于其臨床安全合理應用。

附子作為毒性藥材，對其進行減毒增效一直是研究熱點。傳統中藥材多采用水液煎熬，現代制藥工藝中對部分中藥材采用醇液提取，取得較好的效果。本文分析了雙酯型生物堿乙醇解產物，并總結了其裂解規律。新烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿3種雙酯型生物堿在乙醇中發生乙醇解反應，分別生成8-乙氧基新烏頭堿、8-乙氧基烏頭堿和8-乙氧基次烏頭堿。這些研究探索了一種破壞雙酯型生物堿C8位所連接酯鍵的方法，為附子的減毒增效提供了一種新思路，也為后續研究乙醇解物質的毒性和藥效奠定基礎，同時為該類生物堿對照品溶液的配置不能選擇水和乙醇溶劑提供了理論支撐。

本文是對六種生物堿對照品的混合物開展研究，沒有加入其他干擾成分，沒有分析藥材中其他成分對反應的交叉影響。結合藥材成分、生產工藝做進一步的乙醇解反應研究，是作者正在開展的工作。

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Study on the Fragmentation Behavior and Alcoholysates of Aconitum Alkaloids in Aconitum Carmichaeli Debx

ZHANG Chi，PAN Delin，ZHU Yaning，et al.China Resources SanJiu（Ya'an）Pharmaceutical Co.，Ltd.，Sichuan，Ya'an 625000，China.

Objective：To investigate the pyrolysis mechanism of six alkaloids in Aconitum carmichaeli Debx，and identify their alcoholysates.Methods：HPLC-ESI-MS was used in this study.The first and multi-stage mass spectrum of aconitum alkaloids were obtained in positive ion mode.Results：Through the analysis of multi-stage mass spectrometry，the fragmentation patterns of six alkaloids were illuminated，and the alcoholysates of the diester alkaloids were identified.Conclusion：Three diester alkaloids are alcoholyzed in ethanol and generated three new products respectively，8-ethoxy-mesaconitine，8-ethoxy-aconitine and 8-ethoxy-hypaconitine；pyraconitine is generated at the same time because the reaction proceeds under heating.

Aconitum carmichaeli Debx；Aconitine；Diester alkaloids；Fragmentation regularity；Alcoholysate

R285.5

A

1004-745X（2016）12-2278-05

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.12.021

2016-07-21）

國家“重大新藥創制”科技重大專項（2013ZX09201018）

△通信作者（電子郵箱：zhangchi1728@163.com）