附子及其炮制品對大鼠心臟毒性的影響*

唐 恬趙 婷趙 暉陳振振△

（1.首都醫科大學中醫藥學院，北京 100069；2.中醫絡病研究北京市重點實驗室，北京100069）

·實驗報告·

附子及其炮制品對大鼠心臟毒性的影響*

唐 恬1，2趙 婷1，2趙 暉1，2陳振振1，2△

（1.首都醫科大學中醫藥學院，北京 100069；2.中醫絡病研究北京市重點實驗室，北京100069）

目的基于心電圖變化和血清生化指標的改變，探討附子及炮制品對大鼠心臟毒性的影響。方法 根據附子不同炮制品和給藥劑量對雄性SD大鼠分組大鼠，按體質量隨機分為10組，即空白組，生附子低、中、高3個劑量組，白附片低、中、高3個劑量組，黑順片低、中、高3個劑量組，每組各10只。十二指腸注射給藥，對比給藥前后大鼠Ⅱ導聯心電圖（ECG）的變化，并檢測大鼠血清中肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）和B-型腦鈉肽（BNP）水平。結果附子及其炮制品給藥后，可短時間內顯著增加心率HR、抬高S-T段、延長P-R間期（P＜0.05或P＜0.01），對QRS波群、Q-T間期的影響無統計學意義（P＞0.05）。生附子中劑量組和白附片中劑量組可顯著提高CK和LDH水平（P＜0.05），附子及炮制品對BNP影響無統計學差異（P＞0.05）。結論生附子可引起ECG異常變化，導致不同程度的心肌損傷，并呈現一定的“量-毒”關系，炮制品黑順片、白附片導致的心電異常較生附子減弱，有助于闡明炮制減毒的科學內涵。

附子 心電圖 心臟毒性 “量-毒”關系

附子被譽為“回陽救逆第一品”，功能回陽救逆，助陽補火，散寒止痛，具有強心、擴張血管、抗心律失常、抗心肌缺血等作用［1］。歷代醫家將其作為亡陽虛脫證的首選藥物，與此同時，應用附子后的臨床不良反應報道也與日俱增，主要表現在對心臟和神經的損害，且發病急，病情重，對心臟的直接損害作用顯著，引起心律失常，更有嚴重者發展為室顫危及生命［2］。附子不同組分及其炮制品在藥效劑量范圍內即可引起動物心電圖、心肌酶譜的改變［3-5］，此外附子大劑量臨床應用頻率較大，中醫“火神派”更是重用附子，動輒上百克［6］，臨床應用與《中國藥典》規定劑量相差甚遠，但業者認為烏頭類中藥用量過大，可能導致臨床不良反應發生。為此，本研究基于大劑量和常規劑量，重點考察附子及其炮制品對大鼠心臟毒性的影響，擬為闡釋中藥炮制減毒存效的科學內涵提供依據，也為指導臨床合理用藥提供參考。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗藥材 生附子（批號：20160418）購于安國彤濟中藥材有限公司，黑順片（批號：20160412）、白附片（批號：20160406）購于北京廣惠康平價大藥房，經首都醫科大學中醫藥學院李佳副教授鑒定為毛莨科植物烏頭Aconitum carmichaelii Debx.的子根加工品，按2015年版《中國藥典》附子項下檢查，符合各項規定。

1.2 實驗動物及分組 健康雄性SD大鼠，體質量（250±20）g，共100只，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2012-0001。取雄性SD大鼠，按體質量隨機分為10組，即空白組，生附子低、中、高3個劑量組，白附片低、中、高3個劑量組，黑順片低、中、高3個劑量組，每組各10只。

1.3 儀器和試劑 AR1140型電子分析天平 ［奧豪斯國際貿易（上海）有限公司］，SP2006心電圖解析系統（北京軟隆科技有限責任公司），UV-6100S型紫外可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司），2-16PK型高速冷凍離心機（德國SIGMA），單功能光吸收酶標儀［VersaMax美谷分子儀器（上海）有限公司］。BNP試劑盒 （批號：20160504），CK試劑盒 （批號：20160505），LDH試劑盒（批號：20160506），均購自南京建成生物工程研究所。

1.4 給藥劑量設計 參照2015版《中國藥典》［7］附子常用劑量3～15 g，按體表面積法折算大鼠對應等效給藥劑量為0.27、1.35、5.4 g/kg（相當于臨床成人用等效劑量3、15、60 g/d），按0.3 mL/100 g十二指腸注射給藥，藥液濃度分別為0.09 g/mL、0.45 g/mL、1.8 g/mL，標記為低、中、高劑量組。

1.5 藥物制備 稱取取生附子藥材30 g，加入10倍量水，浸泡30 min，回流提取1 h濾過；再加入10倍量水，回流提取1 h濾過；合并2次濾液，經2100 r/min離心10 min，取上清液濃縮到13.9 mL，即得1.8 g/mL（高劑量組）；取0.5 mL高劑量組加水稀釋到10 mL，即得0.09 g/mL（低劑量組）；取2.5 mL高劑量組加水稀釋到10 ml，即得0.45 g/mL（中劑量組）。白附片、黑順片同上述方法制備。

1.6 實驗方法 參照文獻［8］制定實驗驗方法。取各組大鼠稱重標記，按0.35 mL/100 g劑量腹腔注射10%水合氯醛麻醉，并仰臥固定于實驗臺上，通過四肢電極連接到SP2006心電圖解析系統，監測Ⅱ導聯心電圖10 min，舍棄心電圖異常動物，按0.3 mL/100 g十二指腸注射給藥，空白組給予等量0.9%氯化鈉注射液，監測給藥后大鼠心電圖120 min。停止采集，腹主動脈取血，靜置30 min，3000 r/min離心20 min，分離得到血清，于-80℃貯藏備用。按照試劑盒說明書操作方法，測定大鼠血清中肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）和B型腦鈉肽（BNP）的活力和含量。

1.7 統計學處理 應用SPSS Statistics 20.0軟件分析。數據以（s）表示，進行組間比較。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 附子及其炮制品對HR的影響 見表1。與自身給藥前比較，各組在給藥后5~10 min內，除白附片高劑量組外，其余各組均出現心率加快（P<0.05）；白附片、黑順片高劑量組與生附子高劑量組相比心率顯著降低（P<0.05或P<0.01）；給藥30 min后，除白附片低劑量和中劑量組，其余各組均恢復心率接近給藥前正常心率，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 附子及其炮制品 對HR的影響（次/min，s）

表1 附子及其炮制品 對HR的影響（次/min，s）

與自身給藥前比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與生附子同時間同劑量組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組別 劑量n給藥前給藥后0~5 min 5~10 min 10~30 min 30~60 min 60~90 min 90~120 min生附子 低 8 363.78±35.62 412.98±43.84*416.23±43.51**415.83±42.11*385.40±48.99 368.82±40.87 353.42±40.67中 8 367.69±15.66 408.75±37.82*416.91±37.95*389.41±31.29 373.28±33.55 372.16±35.74 358.17±26.30高 9 357.83±34.28 416.03±32.82**426.41±27.47**400.91±41.77*379.05±40.18 363.76±27.43 353.00±32.54白附片 低 10 376.23±30.32 412.24±27.66 423.58±31.79*419.74±24.15*425.74±26.27*△392.29±42.3 401.79±38.81△△中 9 343.70±35.22 410.29±45.80**430.76±28.50**394.77±62.92*395.55±52.92*408.53±24.95**△396.02±32.59**△高 10 362.38±16.94 385.63±48.48 380.24±43.38△401.18±36.76 399.97±30.93 367.53±44.78 385.30±29.81△黑順片 低 10 372.89±44.58 410.40±49.94 426.08±41.43**422.92±34.23*404.08±42.89 366.71±39.70 370.55±24.75中 10 352.68±29.49 406.15±61.47**416.29±65.16**409.79±59.44**385.37±49.31 396.31±52.02*392.49±49.84*△高 10 360.67±24.12 398.19±35.71*412.04±36.37**△△401.03±27.26*384.64±17.41 375.07±31.17 357.16±36.55

2.2 附子及其炮制品對對S-T段的影響 見表2。結果為與自身給藥前比較，各組均出現大鼠心電圖S-T段升高的趨勢，其中生附子中劑量組在給藥5～120 min較給藥前差異有統計學意義（P<0.05），高劑量組在給藥后5～10 min和90～120 min較給藥前差異有統計學意義（P<0.01）；白附片低、高劑量組在給藥后90～120 min較給藥前差異有統計學意義（P<0.01）；黑順片中劑量組在給藥后30～60 min較給藥前差異有統計學意義（P<0.05）。90～120 min黑順片高劑量組與生附子高劑量組相比S-T段顯著降低（P＜0.05）。

表2 附子及其炮制品對S-T段的影響（1/100 mV，s）

表2 附子及其炮制品對S-T段的影響（1/100 mV，s）

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2.3 附子及其炮制品對QRS波群的影響 見表3。與給藥前自身比較，各組均有延長QRS波群趨勢，但無統計學意義（P＞0.05）。生附子和白附片給藥組呈現一定量效關系。

表3 附子及其炮制品對QRS波群的影響（ms，s）

表3 附子及其炮制品對QRS波群的影響（ms，s）

組別 劑量n給藥前給藥后0~5 min 5~10 min 10~30 min 30~60 min 60~90 min 90~120 min生附子 低 8 17.79±2.39 18.16±2.23 19.26±3.26 19.18±2.26 20.21±2.75 21.15±3.39 22.86±4.21中 8 19.40±3.53 18.72±2.75 19.33±2.73 19.39±2.83 20.70±2.32 22.84±4.57 23.56±4.65高 9 19.90±1.61 20.97±2.02 21.64±1.81 23.00±2.29 23.68±2.15 25.04±3.27 25.75±2.84白附片 低 10 19.37±3.12 20.15±3.98 19.61±2.48 20.20±2.47 20.10±2.52 20.23±2.05 21.24±2.38中 9 20.12±3.00 21.08±3.08 21.15±3.09 21.98±2.95 22.85±2.88 23.07±2.77 22.82±2.40高 10 20.34±2.94 20.97±3.64 20.50±2.87 21.26±1.87 22.12±3.02 24.76±3.93 24.15±4.13黑順片 低 10 18.68±4.30 19.36±3.32 19.56±3.10 20.30±3.45 21.82±4.18 23.85±3.11 23.92±3.31中 10 17.04±1.87 17.97±1.84 19.68±2.96 20.88±3.67 21.48±3.02 20.87±3.35 22.79±3.15高 10 18.16±3.28 17.83±2.89 18.46±3.05 19.32±2.82 20.22±3.23 19.78±3.17 20.30±3.78

2.4 附子及其炮制品對P-R間期的影響 見表4。與給藥前自身比較，各組均有延長P-R間期的趨勢，其中生附子低、中劑量組分別在10～120 min內出現顯著差異（P＜0.05），高劑量組在60~120 min具顯著差異（P＜0.05），并呈現量效關系；白附片中劑量和黑順片低、中、高劑量在在60~120 min具顯著差異 （P＜0.05）。白附片低、高劑量在60~120 min和黑順片高劑量在60～90 min與生附子同時間同劑量組相比P-R間期縮短具顯著差異（P＜0.05）。

表4 附子及其炮制品對P-R波群的影響（ms，s）

表4 附子及其炮制品對P-R波群的影響（ms，s）

給藥后0~5 min 5~10 min 10~30 min 30~60 min 60~90 min 90~120 min生附子 低 8 50.28±3.79 50.28±3.79 53.19±7.00 52.84±6.31*57.33±7.14*64.08±9.95**65.84±12.47**中 8 52.40±3.32 52.40±3.32 53.05±3.25 55.89±3.05*59.52±4.23**61.40±10.15**56.46±12.26高 9 54.08±1.71 54.08±1.71 53.76±1.63 58.23±3.41 60.86±5.39 65.82±6.63*67.50±5.40**組別 劑量 n 給藥前白附片 低 10 56.80±3.20 56.80±3.20 56.88±5.25 53.28±3.88 58.49±4.39 60.28±7.64 57.77±7.76△中 9 53.10±3.21 53.10±3.21 53.97±2.81 55.49±5.98*58.44±4.35**59.81±5.07**63.12±5.75**高 10 52.24±5.67 52.24±5.67 53.18±6.13 54.06±3.83△55.78±2.49 62.72±13.23 58.01±5.24△△黑順片 低 10 51.06±3.29 51.06±3.29 53.56±2.97 57.55±3.27*57.04±8.43**63.40±7.52**60.30±2.06**中 10 52.86±3.00 52.86±3.00 53.21±4.88 55.31±3.71**54.71±8.09*55.75±9.32 56.18±8.54*高 10 53.21±2.79 53.21±2.79 51.41±4.57 56.84±5.53 56.65±4.45*58.43±4.59*△61.16±4.90**

2.5 附子及其炮制品對Q-T間期的影響 見表5。與給藥前自身比較，各組均有延 長QT間期的趨勢，但均無統計學差異（P＞0.05）。

2.6 附子及其炮制品對大鼠血清酶學指標的影響見表6。與空白對照組比較，生附子中劑量和黑順片高劑量提高CK活力具有顯著性差異（P＜0.05）。白附片中劑量能顯著增加LDH活性（P＜0.05）。各組對腦鈉肽（BNP）水平影響無統計學差異（P＞0.05）。

3 討 論

SP2006心電解析系統集心電記錄和心電分析于一體，可以采集并自動解析大小鼠、犬、猴等動物的心電圖，也可以從生理記錄機、心電圖機、數據記錄機等多種輸出通道接收心電圖。通過對大鼠心電的監測，我們可以分析藥物的心臟毒性所引起的心電改變，利用該系統對衡量藥物的毒性大小和不同藥物的毒性對比具有很好的實際意義［9］。

本實驗研究顯示，附子及其炮制品可引起大鼠心電圖出現心率HR加快、抬高S-T段、延長P-R間期、QRS波群、Q-T間期等不同程度的改變，尤其以1.35、5.4 g/kg劑量影響顯著，并且以心率HR加快、抬高ST段、延長P-R間期為最主要的改變。S-T段的改變是反映心肌缺血性損傷程度的可靠指標，其升高或壓低在診斷有無心肌缺血、心肌梗死、電解質紊亂中有重要意義。從結果看出，給藥組均有使S-T段抬高的趨勢，相比于生附子，炮制品使S-T段抬高的幅度更小，提示附子對大鼠造成一定心肌缺血損傷，具有一定心臟毒性，生品相比炮制品的影響更顯著。

表5 附子及其炮制品對Q-T間期的影響（ms，s）

表5 附子及其炮制品對Q-T間期的影響（ms，s）

表6 對血清酶的影響（分，s）

表6 對血清酶的影響（分，s）

與空白組比較，*P＜0.05；與空白組比較，**P＜0.01。

組別 劑量 n CK（U/mL）空白組 - 6 3.97±1.66 11461.41±2592.85 76.54±29.87生附子 低 6 2.97±0.75 8952.58±2459.46 40.93±13.16 LDH（U/L） BNP（ng/L）中 6 5.46±0.72*14515.15±1681.43 68.89±14.64高 6 4.99±1.28 8230.35±1674.28 96.74±35.22白附片 低 6 4.61±0.89 13759.02±2026.09 120.83±42.10中 6 4.44±0.99 15763.46±4485.56*97.88±29.46高 6 3.55±1.54 10387.75±3412.86 98.46±46.46黑順片 低 6 4.34±1.09 11222.32±4652.49 89.28±40.23中 6 4.48±1.42 15305.42±5764.40 114.72±52.02高 6 5.81±0.92*10900.43±1615.30**98.12±54.67**

P-R間期反映的是房室傳導時間，異常延長時預示著房室傳導阻滯的發生。從實驗結果看出，給藥組出現延長大鼠心電圖P-R間期的變化，并隨著時間的增加作用更顯著，從10 min開始，炮制品各組與生品同等劑量組相比，P-R間期延長的時間均低于生品，房室傳導阻滯較輕，提示我們附子炮制具有減毒作用。

QRS波群是心室除極時產生的心電波，寬度代表整個心室除極所花的時間。寬QRS波群可能是室性異位激動產生的心室除極所導致，而窄QRS波群可能是室上性異位激動產生的心室除極所導致。從結果來看，給藥組均有延長大鼠ECG的QRS波群的變化，可能導致大鼠的心律失常，從心電圖監測中發現，生附子給藥組出現寬大畸形改變，這預示室早發生，但不具有統計學差異。

Q-T間期異常延長可導致室性心律失常的發生。在診斷某些心律失常、判斷心肌梗死患者預后等方面有著重要的臨床意義。結果顯示，各給藥組有延長大鼠心電圖Q-T間期的趨勢，并且隨時間延長逐漸增加，生附子組的影響更加明顯，提示生附子比炮制品更容易導致室性心律失常的發生。

附子及其炮制品在高于藥效劑量15～60 g用藥時，除發揮“回陽救逆”功效外，對大鼠的心臟也產生一定的毒副作用，表現為心率加快，出現房室傳導阻滯，心肌缺血和梗死出現早期S-T段的顯著抬高，提示我們臨床中附子超常規劑量使用時，應注意ECG監測，避免對患者造成傷害。

心肌生化標志物的檢測在診斷、監測、危險評估、預后和引導治療都提供了方便的手段。乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、B-型腦鈉肽（BNP）是幾種缺血性心臟病經典的生化標記物，參與疾病發生、發展并與療效觀察有密切關系，可為臨床評估心臟疾病危險性提供有價值的信息，提高臨床診斷價值，并預示患者預后情況的變化［10-11］。實驗結果顯示，生附子及其炮制品在15、60 g等效劑量下，對大鼠心肌細胞產生一定的毒副作用，表現在CK、LDH活性升高，說明在藥效劑量及以上應用附子時，可能引起心肌損傷的毒副作用，應結合早期血清毒性指標檢測，調整用量，保證安全用藥。附子毒性較大，主要毒性成分為烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿等雙酯型二萜類生物堿［12］。烏頭堿可引起心肌細胞內鈣離子濃度異常，導致鈣離子穩態被破壞，是引起附子心臟毒性的主要機制，也有研究表明附子具有明顯的抗膽堿和阻斷迷走神經特性，從而誘導心律失常，間接通過心外神經介導造成心臟毒性［13-16］，但具體毒性機制有待進一步發現。

綜上所述，生附子對于大鼠具有較強的心臟毒性，炮制品黑順片和白附片對大鼠的心臟毒性較低，但高劑量的使用也會導致一定的毒性反應，包括心電圖波段的血清生化指標的改變，提示我們早期檢測相關指標對于指導附子臨床應用有重要的意義。通過建立附子及其炮制品黑順片和白附片的體外指紋圖譜，結合藥材和主要有效成分的毒性研究，建立附子“譜-毒”學關聯性，將有助于闡明附子的毒副作用機制，是我們今后的研究方向。

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R285.5

A

1004-745X（2016）12-2286-05

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.12.023

2016-07-12）

北京市大學生畢業論文（設計）項目（0700-1160930302）

△通信作者（電子郵箱：chenzhenzhen1@126.com）