氧化應激相關酶及信號通路蛋白表達對動靜脈內瘺患者血栓形成的影響

姚律，郝麗，郭長策，丁士新

（1.安徽醫科大學第二附屬醫院腎內科，安徽合肥230601；2.海軍安慶醫院腎內科，安徽安慶246003）

氧化應激相關酶及信號通路蛋白表達對動靜脈內瘺患者血栓形成的影響

姚律1，郝麗1，郭長策2，丁士新2

（1.安徽醫科大學第二附屬醫院腎內科，安徽合肥230601；2.海軍安慶醫院腎內科，安徽安慶246003）

目的探討氧化應激相關酶及信號通路蛋白表達對動靜脈內瘺（AVF）患者血栓形成的影響。方法該院血液中心于2014年1月-2016年1月收治120例行AVF手術或AVF修補術的腎臟疾病患者依據AVF術后是否有血栓形成分為兩組：A組71例（AVF術后有血栓形成），B組49例（AVF術后無血栓形成），比較兩組患者氧化應激酶及信號通路蛋白水平。結果A組血漿甲狀旁腺激素、半胱氨酸水平高于B組（P=0.000和0.000），血紅蛋白、C反應蛋白水平低于B組，差異有統計學意義（P=0.000和0.000）；A組患者血管組織中超氧化物歧化酶-1（SOD-1）、超氧化物歧化酶-2（SOD-2）、血紅素氧化酶-1（HO-1）、Ras相關C3肉毒素酶解-2（Rac-2）和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NOX-4）水平高于B組，差異有統計學意義（P=0.000、0.000、0.000、0.000和0.000）；A組患者血管組織中NADPH氧化酶亞單位P-22、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）、叉頭框蛋白01（P-Fox01）和叉頭框蛋白03a（P-Fox03a）水平高于B組，差異有統計學意義（P=0.000、0.000、0.000和0.000）；內瘺患者血栓形成與血管組織中SOD-1、SOD-2、HO-1、Rac-2、NOX-4、P-22、P13K、P-Fox01和P-Fox03a水平呈正相關（P=0.040、0.010、0.041、0.022、0.030、0.021、0.031、0.020和0.021）。結論氧化應激反應通過P13K/Fox0信號通路傳導表達相關酶及蛋白，引發血管內皮損傷，導致動靜脈內瘺吻合處狹窄及血栓形成，臨床可通過干預動靜脈內瘺患者體內應激反應及相關信號通路蛋白表達預防或治療動靜脈內瘺血栓的形成。

氧化應激；信號通路蛋白；動靜脈內瘺；血栓

自體動靜脈內瘺（arteriovenous fistula，AVF）具有創傷小、使用時間長、對心功能影響小、感染率低、安全性好等優點，已成為慢性腎衰竭患者維持性血液透析建立血管通路的主要方式[1]。然而，受多種因素影響，內瘺使用期間常發生阻塞，阻塞率高達30%~ 40%[2]，對患者生命產生嚴重威脅。研究表明，血栓是導致AVF障礙的主要原因之一[3]。盡管AVF血栓發生率較高，但其使用壽命長、費用低，因而在臨床中仍廣泛使用。因此，研究AVF血栓形成并進行防治具有重要意義。據報道[4]，氧化應激與血管內膜損傷及血管炎癥相關，在介導動脈粥樣硬化和血栓形成起始和進展中具有積極作用，而AVF患者長期處于高氧化應激水平，但這種長期的持續高氧化應激水平是否對AVF患者血栓形成產生影響，目前文獻報道較少。本研究比較AVF有和無血栓生成患者氧化應激相關酶及信號通路蛋白表達水平，分析AVF血栓生成與氧化應激的相關性，旨在探討氧化應激在AVF患者血栓形成中的作用及機制，為臨床預防和治療AVF患者血栓形成提供指導。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年1月-2016年1月于安徽醫科大學第二附屬醫院血液中心收治的120例行AVF手術或AVF修補術的腎臟疾病患者。男性76例，女性44例；年齡30～75歲；病程3個月～60個月；透析時間0.12～192個月；內瘺使用時間0.23～187個月。依據患者AVF術后是否形成血栓將患者分為兩組：A組71例，內瘺成形術后有血栓形成；B組49例，內瘺成形術后無血栓形成。兩組患者基線資料（見表1）差異無統計學意義，具有可比性（P>0.05）。患者及其家屬簽署知情同意書，并獲得本院倫理委員會批準。

表1 兩組患者基線資料比較

納入標準：①納入符合《慢性腎臟病及透析的臨床實踐指南》（美國NKF-K/DOQI工作組2002年制定）[5]中慢性腎臟病診斷標準患者。②納入符合內瘺血栓形成診斷標準[6]患者，具體診斷標準如下：內瘺雜音降低，透析血流量<180ml/min；內瘺雜音完全消失；B超或超聲波檢查確診有內瘺血栓生成；患者局部疼痛，瘺口有血栓狀硬物或觸壓疼痛；血管造影時血管明顯狹窄，或無造影劑通過。③納入符合中華人民共和國衛生部于2010年發布的《血液凈化標準操作規程》[7]中自體AVF適應證患者。④納入自愿參與并研究患者。排除標準：①合并神經性疾病、神志不清或語言失常患者。②合并肝、腦、肺部疾病患者。③符合《血液凈化標準操作規程》中自體AVF禁忌證患者。④合并急性心臟衰竭、腦卒中、嚴重心律失常患者。⑤合并急性感染、腫瘤、肝硬化失代償期患者。⑥哺乳期或妊娠期婦女。⑦使用人工合成移植血管通路患者。

1.2 研究方案

所有患者入院后記錄臨床資料，主要包括性別、年齡、原發病型、血漿白蛋白（ALB）、膽固醇（CHO）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白（HDL-c）、磷（P）、鈣（Ca）、胱抑素C水平。入院后次日取空腹肘靜脈血，離心測定血漿生化指標水平。

所有患者入院后行AVF成形術或AVF修補術，所有手術由同一位手術者完成，手術具體操作如下：內瘺吻合方式為頭靜脈-橈動脈端側吻合，穿刺方式為繩梯式，內瘺首次使用為術后6～8周，透析血流量>200ml/min。透析液為碳酸氫鹽，透析速率500ml/min，頻率2～3次/周，每次4 h。透析結束后彈力腕帶壓迫止血。所有患者在AVF手術及AVF修補術時取靜脈段標本，用于血管組織氧化應激相關酶及信號通路蛋白測定。

1.3 血漿生化指標及氧化應激相關酶、信號通路蛋白測定方法

血漿生化指標水平測定采用日立7600-010型全自動生化分析儀（日本Toshiba公司），主要包括血紅蛋白（Hb）、甲狀旁腺激素（iPTH）、C反應蛋白（CRP）和半胱氨酸水平。

氧化應激相關酶、信號通路蛋白測定采用蛋白免疫印跡法（Western blot）[8]，主要檢測超氧化物歧化酶-1（superoxide dismutas-1，SOD-1）、超氧化物歧化酶-2（superoxide dismutas-2，SOD-2）、血紅素氧化酶-1（hemeoxygenase，HO-1）、Ras相關C3肉毒素酶解-2（ras-Related C3 botulinum toxin substrate，Rac-2）和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NADPH oxidase-4，NOX-4）等酶蛋白和相關信號通路蛋白氧化酶亞單位p-22、磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）、叉頭框蛋白01（forkhead box protein 01，P-Fox01）和叉頭框蛋白03a（forkhead box protein 03a，P-Fox03a）表達水平。Western blot具體操作如下：取患者在AVF手術及AVF修補術時留下的靜脈段標本，與Tris-HCl蛋白質緩沖液一起勻漿，4℃、1 500 r/min離心10min，取上清液測定總蛋白濃度，方法為比色法。取20mg上述上清液進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，90 V電壓下轉移至硝酸纖維素膜2 h，在脫脂牛奶中加入第一抗體孵育15 h，緩沖液沖洗3次，加入過氧化物酶標記的驢抗兔IgG抗體，孵育1 h，緩沖液沖洗3次。增強發光并曝光，采用緩沖液沖洗3次，掃描蛋白條帶的吸光度，并采用Quantity one軟件分析蛋白吸光度，計算目的蛋白相對含量（為目的蛋白條帶吸光度和β-actin條帶吸光度百分比）。將B組相對蛋白含量計為100%，A組含量為A、B兩組相對蛋白含量百分比。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析，計數資料用χ2檢驗，t檢驗比較計量資料，AVF血栓形成與氧化應激相關酶及信號通路蛋白表達的相關性分析采用Kendall等級相關檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者血液生化指標比較

A組血漿iPTH、半胱氨酸水平高于B組（P= 0.000和0.000），Hb、CRP水平低于B組，差異有統計學意義（P=0.000和0.000）。見表2。

2.2 兩組患者氧化應激相關酶水平比較

A、B兩組患者氧化應激相關酶Western blot結果見圖1，其定量分析結果見表3。A組患者血管組織中SOD-1、SOD-2、HO-1、Rac-2和NOX-4水平高于B組，差異有統計學意義（P=0.000、0.000、0.000、0.000和0.000）。

2.3 兩組患者氧化應激信號通路蛋白水平比較

A、B兩組患者氧化應激信號通路Western blot結果見圖2，其定量分析結果見表4。A組患者血管組織中P-22、P13K、P-Fox01和P-Fox03a水平高于B組，差異有統計學意義（P=0.000、0.000、0.000和0.000）。

表2 兩組患者血液生化指標比較（±s）

表2 兩組患者血液生化指標比較（±s）

半胱氨酸/（m m o l / L）A組（n= 7 1）7 3 . 1 ± 7 . 1 3 1 4 . 3 ± 2 0 . 1 9 . 4 ± 4 . 1 2 4 . 6 ± 6 . 5 B組（n= 4 9）1 1 0 . 4 ± 8 . 2 1 8 6 . 4 ± 1 3 . 2 3 6 . 3 ± 1 0 . 7 1 2 . 1 ± 5 . 1t值2 6 . 5 4 2 4 2 . 0 6 2 1 6 . 7 6 9 1 1 . 2 7 3P值0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0組別H b /（m m o l / L）i P T H /（p g / m l）C R P /（m g / m l）

圖1 兩組患者氧化應激相關酶Western blot實驗結果

表3 兩組患者氧化應激相關酶水平比較（%±s）

表3 兩組患者氧化應激相關酶水平比較（%±s）

組別SOD-1 SOD-2 HO-1 Rac-2 NOX-4 A組（n=71）328.1±70.8 635.3±70.9 237.5±61.2 426.3±46.1 312.5±59.3 B組（n=49）100.0±11.1 100.0±17.2 100.0±9.8 100.0±8.5 100.0±19.7t值26.676 61.067 18.589 58.224 28.036P值0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

圖2 兩組患者氧化應激相關信號通路Western blot實驗結果

表4 兩組患者氧化應激信號通路蛋白水平比較（%±s）

表4 兩組患者氧化應激信號通路蛋白水平比較（%±s）

組別P-22 P13K P-Fox01 P-Fox03a A組（n=71）728.1±73.8 335.3±72.1 517.5±41.7 376.3±76.3 B組（n=49）100.0±8.2 100.0±7.0 100.0±7.8 100.0±8.9t值71.081 27.313 82.302 30.217P值0.000 0.000 0.000 0.000

2.4 內瘺患者血栓形成與氧化應激相關酶及信號通路蛋白表達相關性分析

內瘺患者血栓形成與血管組織中SOD-1、SOD-2、HO-1、Rac-2、NOX-4、P-22、P13K、P-Fox01和PFox03a水平呈正相關（P=0.040、0.010、0.041、0.022、0.030、0.021、0.031、0.020和0.021）。見表5。

表5 內瘺患者血栓形成與氧化應激相關酶及信號通路蛋白表達相關性分析

3 討論

內瘺血栓是AVF患者最常見的難題，也是導致患者2次住院的首要原因。對于腎臟疾病醫生來說，預防并治療內瘺血栓生成是血液透析患者治療過程中最艱巨的課題之一[9]。據報道[10]，內瘺血栓形成是導致AVF狹窄甚至閉塞的重要原因。目前，大量研究人員對內瘺血栓形成原因進行深入研究，李彩鳳等[11]認為糖尿病、CRP是內瘺血栓形成的危險因素，鐘武華等[12]認為腎衰竭患者透析時血壓過低、不適當穿刺及過度超濾導致內瘺血栓形成。其中，氧化應激與內瘺血栓形成的相關性已成為研究熱點[13]。AVF患者長期處于高氧化應激水平，本文主要探討氧化應激對內瘺血栓形成的影響，為內瘺血栓的預防和治療提供依據。

AVF患者長期處于高氧化應激水平，而氧化應激是導致患者發生心血管并發癥的重要原因[14]。本研究發現，AVF血栓形成患者體內氧化應激相關酶及信號通路蛋白表達高于無血栓形成患者，且內瘺患者血栓形成與血管組織中SOD-1、SOD-2、HO-1、Rac-2、NOX-4、P-22、P13K、P-Fox01和P-Fox03a水平呈正相關，說明內瘺患者高氧化應激水平是導致內瘺血栓形成的重要原因，臨床可通過下調內瘺患者氧化應激水平來預防或治療血栓的形成。

氧化應激對AVF血栓形成的影響是一個復雜的過程。LIN等[15]研究發現，HO-1基因中有長GT序列重復基因多態性的血液透析患者AVF障礙發生率更高，提示氧化應激影響AVF血管內膜增生，導致內瘺狹窄或失效。血管內膜增生部位的平滑肌細胞、成纖維細胞是患者氧化應激所引起，氧化應激作用通過這些細胞參與血管內膜增生，并引發血管內皮功能紊亂。而血管內皮功能紊亂引起血管內膜損傷啟動血栓形成：血管內皮功能紊亂導致血管張力調節作用減弱，血流速度降低，進而出現血小板附著、炎癥和吞噬細菌侵蝕現象，激活凝血和纖溶系統，從而導致血栓生成[16]。據報道，P13K/Fox0通路[17]是氧化應激參與血管內皮功能的主要通道。P13K/Fox0通路受體及其蛋白主要包括Rac-2、SOD、HO-1和NOX4等。其中，Rac-2是通過血漿調控NADPH氧化酶活性來調節ROS生成的重要酶類之一，本研究發現，Rac-2是在AVF血栓患者中高表達，表明Rac-2可通過激活血管纖維生成和細胞收縮調節血管內皮細胞遷移，導致血管狹窄[18]。SOD和HO-1是血管損傷的保護因子[19]，在血管內皮功能紊亂調節中具有抗氧化、抗炎及抗凋亡等作用。本組中，內瘺血栓生成患者體內SOD和HO-1表達顯著升高，說明在各種刺激下，防御性SOD和HO-1表達水平增加，起到保護血管、抑制血栓生成的作用。NOX4氧化酶在血管損傷中作用目前存在分歧[20]，但其在血管狹窄、高血壓等疾病中高表達，本組中內瘺血栓患者中NOX4高表達，提示NOX4參與內瘺血栓形成，但具體機制有待于進一步研究。

綜上所述，氧化應激酶及信號通路蛋白在維持性血液透析患者AVF血栓形成中扮演重要角色，有血栓形成患者氧化應激水平高于無血栓形成患者。氧化應激反應通過P13K/Fox0信號通路傳導表達相關酶及蛋白，引發血管內皮損傷，促進AVF吻合處狹窄及血栓形成。因此，臨床可通過干預AVF患者體內應激反應及相關信號通路蛋白表達預防或治療AVF血栓的形成，為臨床AVF患者血栓生成的預防和治療提供了一種新的干預方案。

[1]褚志強.前臂頭靜脈轉位與肱動脈吻合建立自體動靜脈內瘺[J].中華普通外科雜志,2013,28(10):808-809.

[2]劉冬梅,王向雷.自體動靜脈內瘺阻塞危險因素分析及護理對策[J].醫學信息,2013,12(24):229-230.

[3]AATIF T,ELFAROUKI M R,MOUAINE N,et al.Catheter-related atrial thrombus in a patient on hemodialysis[J].Therapeutic Apheresis and Dialysis,2013,17(6):638-640.

[4]劉章鎖,王沛.K/DOQI指南關于慢性腎臟病分期的臨床指導意義[J].中國實用內科雜志,2008,28(1):21-24.

[5]胡代軍,劉璠娜,尹良紅,等.血液透析患者動靜脈內瘺再次血栓形成的影響因素分析[J].廣東醫學,2014,35(5):677-680.

[6]郁佩青.2010版血液凈化標準操作規程中關于透析器預沖的認識和解讀[J].中國血液凈化,2013,12(9):520.

[7]CHEN CH,CHEN TH,HSU Y H,et al.The molecular mechanisms for arteriovenous fistula failure and the corresponding therapies[J].Acta nephrologica,2014,28(1):6-12.

[8]YANG J,KWON OK,OH CW,et al.Surgical flow disconnection of cerebral pial dual-channel arteriovenous fistula with a large varix:The role of anti-platelet agent or anti-coagulation therapy[J].Child's Nervous System,2013,29(6):1021-1025.

[9]MATSUO T,WANAKA K,WALENGA JM,et al.Evaluation of circuit and AV fistula clotting and detection of anti-PF4/heparin complex antibodies in hemodialysis patients suspected of having heparin-induced thrombocytopenia[J].Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis,2013,19(1):73-78.

[10]胡普平,楊濤,王玉柱,等.動靜脈內瘺血管內膜增生機制研究進展[J].中國血液凈化,2011,10(10):564-566.

[11]李彩鳳,許樹根,沈淑瓊,等.維持性血液透析患者動靜脈內瘺栓塞影響因素分析[J].中國血液凈化,2013,12(2):78-81.

[12]鐘武華.血液透析患者動靜脈內瘺阻塞原因及護理對策[J].醫學信息,2015,28(4):67.

[13]周園媛,王戰建.晚期糖基化終末產物、氧化應激與糖尿病心血管并發癥[J].中華臨床醫師雜志：電子版,2013,25(12):5488-5491.

[14]王春,秦少博.炎癥與血管內皮損傷研究進展[J].心血管病學進展, 2015,36(1):89-92.

[15]LIN C C,YANG W C,LIN S J.Length polymorphism in heme oxygenase-1 is associated with arteriovenous fistula patency in hemodialysis patients[J].Kidney International,2006,69(72):165-172.

[16]李思.維持性血液透析患者血瘀證與內皮功能相關性的研究[D].北京中醫藥大學,2012.

[17]李松巖,郭敏,王煙,等.過氧化氫誘導血管平滑肌細胞內質網應激及其自噬作用[J].中國藥理學與毒理學雜志,2015,29(6):899-904.

[18]MONTEZANO A C,TOUYZ R M.Reactive oxygen species and endothelial function-role of nitric oxide synthase uncoupling and Nox family nicotinamide adenine dinucleotide phosphateoxidases[J]. Basic&Clinical Pharmacology&Toxicology,2012,110(1): 87-94.

[19]HSEU Y C,CHOU C W,KUMAR K J S,et al.Ellagic acid protects human keratinocyte(HaCaT)cells against UVA-induced oxidative stress and apoptosis through the upregulation of the HO-1 and Nrf-2 antioxidant genes[J].Food and Chemical Toxicology,2012,50(5):1245-1255.

[20]VENDROV A E,VENDROV K C,SMITH A,et al.Nox4 NADPH oxidase-dependent mitochondrial oxidative stress in aging-associated cardiovascular disease[J].Antioxidants&Redox Signaling,2015,23(18):1389-1409.

（張蕾編輯）

Influence of oxidative stress-related enzymes and signal pathway protein expression on thrombosis in patientsw ith arteriovenous fistula

Lv Yao1,Li Hao1,Chang-ce Guo2,Shi-xin Ding2
(1.Department of internalmedicine,the Second Affiliated Hospital of Medical University of Anhui, Hefei,Anhui230601,China;2.Department of internalmedicine,Anqing Navy Hospital, Anqing,Anhui 246003,China)

ObjectiveTo investigate the influence of oxidative stress-related enzymes and signal pathway protein expression on arteriovenous fistula(AVF)in patientswith thrombosis.MethodsFrom January 2014 to January 2016, 120 patients treated with routine arteriovenous fistula(AVF)or AVF repair surgery were divided into two groups according whether AVF thrombosis occurred after surgery:A group of 71 cases(AVF thrombosis after surgery), group B had 49 cases(AVF postoperative thrombosis).Levels of blood biochemicalmarker,oxidative stress-related enzymes(SOD-1,SOD-2,HO-1,Rac-2 and NOX-4)and related signaling pathway proteins(P-22,P13K,PFox01 and P-Fox03a)were compared.ResultsLevels ofplasma parathyroid hormone,homocysteine in group Awere significantly higher than group B(P=0.000,0.000),and hemoglobin,C-reactive protein levels were significantlylower than group B,the differenceswere significant(P=0.000,0.000).Levels of SOD-1,SOD-2,HO-1,Rac-2 and NOX-4 in group A were significantly higher than group B,the differences were statistically significant(P=0.000, 0.000,0.000,0.000,0.000).Levels of P-22,P13K,P-Fox01 and P-Fox03a in vastular tissue of group A were higher than group B,the differences were significant(P=0.000,0.000,0.000,0.000).Fistula thrombosis in patients with vascular tissuewere significantly correlated with SOD-1,SOD-2,HO-1,Rac-2,NOX-4,P-22,P13K,P-Fox01 and P-Fox03a levels(P=0.040,0.010,0.041,0.022,0.030,0.021,0.031,0.020,0.021).ConclusionsThe oxidative stress expresses protein associated enzymes by P13K/Fox0 signal transduction pathway,causes endothelial damage, leads to stenosis of arteriovenous fistula and anastomosis thrombosis.Clinical intervention by the stress response can move fistula patients intravenously and in vivo signaling pathway associated protein expression in the formation of prevention or treatmentof arteriovenous fistula thrombosis.

oxidative stress;signal pathway protein;arteriovenous fistula;thrombus

R 543

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.24.006

1005-8982（2016）24-0028-05

2016-05-17

郝麗，E-mail：haoliqilin@163.com