鼻息肉組織核因子-κB和白細胞介素4的表達及意義

萬貝貝，胡樂農，徐紅偉

（浙江省麗水市中心醫院，浙江麗水323000）

鼻息肉組織核因子-κB和白細胞介素4的表達及意義

萬貝貝，胡樂農，徐紅偉

（浙江省麗水市中心醫院，浙江麗水323000）

目的探討核因子-κB（NF-κB）和白細胞介素4（IL-4）mRNA在鼻息肉組織中的表達及意義。方法選取90例術后病檢確診為鼻息肉患者鼻腔新生物（不分側別）作實驗組，同期取80例因單純鼻中隔偏曲而行下鼻甲部分切除的患者的下鼻甲組織（不分側別）作為對照組。采用逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）結合半定量分析方法檢測，比較兩組NF-κB、IL-4的表達水平。結果NF-κB和IL-4在實驗組表達水平高于對照組（P<0.05）。結論NF-κB和IL-4 mRNA表達水平與炎癥相關，可能與鼻息肉的發病機制相關。

核因子-κB；白細胞介素4；鼻息肉

鼻息肉作為耳鼻喉科的常見病、多發病，會嚴重影響患者的鼻腔通氣功能，致使患者生活質量嚴重下降。然而時至今日，國內外對于鼻息肉的確切發病機制仍不明確，多數觀點認為其是多因素、多種基因、多信號途徑參與的共同結果。鼻息肉組織的病理切片中以炎癥改變為主，表現為上皮增生、細胞間質的高度水腫以及毛細血管增生等形態特征。核因子-κB（nuclear factor-κb，NF-κB）是一個近年來新發現的炎癥信號誘導的核轉錄調控因子，國外最新研究發現鼻息肉上皮細胞中NF-κB的活性表達明顯升高，而同時國內多位學者采用免疫組織化學方法研究也證實鼻息肉中NF-κB在鼻息肉組織的炎癥細胞、上皮細胞、部分腺體及血管內皮細胞的細胞核及細胞漿內均表現為高表達，表明NF-κB在鼻息肉組織中過度活化，細胞因子轉錄增強，可能導致大量細胞因子的生成[1]，在鼻息肉的發生、發展中發揮著重要作用。白細胞介素4（lnterleukin 4，IL-4）作為Th2的自分泌細胞因子，是免疫系統中作用最強、范圍最廣的細胞因子，既能調節細胞免疫，又能調節體液免疫。它對Th2細胞的生長發育分化起著關鍵性作用，可使Th0直接轉變為Th2，增強細胞免疫作用，在免疫細胞之間發揮多重免疫調節作用。有國內學者用免疫組織化學方法發現鼻息肉中IL-4的表達明顯增高，同時亦有研究發現鼻息肉中IL-4的表達不穩定，在鼻息肉組織和正常鼻腔黏膜組織中表達差異無統計學意義[2]。而SOYKA[3]研究發現，IL-4會導致正常鼻腔黏膜上皮屏障的缺陷，可能與鼻息肉的發病有關聯。本次研究希望通過逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）技術進一步探討NF-κB和IL-4 mRNA在鼻息肉組織中的表達及其對于未來鼻息肉臨床治療中可能發揮的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

1.1.1 實驗標本選取2015年9月-2016年1月在麗水市中心醫院行鼻息肉摘除術的90例鼻息肉患者的鼻息肉組織（術后病檢為鼻息肉）作研究對象（實驗組）。其中，男性51例，女性39例；年齡30～50歲。同期取80例患者因單純鼻中隔偏曲需切除鼻甲組織作為對照組。其中，男性42例，女性38例；年齡33～54歲。所有患者術前至少停止使用抗生素類或激素類藥物治療4周以上。

1.1.2 主要試劑及設備PCR反應儀（德國Biometra公司），Trizol RNA試劑（美國Invitrogen公司），凝膠成像分析儀（美國Beckman公司），逆轉錄試劑盒（美國Invitrogen公司）。引物合成交由上海捷瑞生物工程有限公司完成。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取總RNA法標本采集后裝入無菌凍存管內，標記后將其放入-80℃冰箱冷凍保存。標本統一稱量，每100mg鼻息肉組織加入1ml RNA分離液提取標本RNA，利用紫外分光光度計檢測提取的RNA純度。RNA的純度可以通過計算測定260 nm/ 280 nm的紫外吸收值來評定。RNA純度測定值需在1.9～2.0，這樣的RNA可以用來進行后續實驗。

1.2.2 逆轉錄RT體系配置及PCR反應逆轉錄（Real-time RT polymerase chain，RT）反應體系20μl由標本總RNA 8μl，隨機引物2μl，5×逆轉錄反應緩沖液4μl，逆轉錄酶1μl，RNA酶抑制劑0.5μl，0.1mol/L二硫蘇糖醇溶液1μl，脫氧核糖核苷三磷酸2μl，無RNA酶的雙蒸水1.5μl混合配置而成。PCR反應體系20μl由正反向引物各1μl，Taq PCR mastermix 10μl，逆轉錄產物cDNA 1.5μl，雙蒸水6.5μl配置而成。本實驗中共有3對引物序列，NF-κB的引物序列正向：5'-CTTTTCGACTAC GCGGTGA-3'，反向：5'-GGCAGCTAGGTGCAAAAC A-3'，擴增片段長度為390 bp。IL-4的引物序列正向：5'-CAGTTCTACAGCCACCATGAGA-3'，反向：5'-CATGATCGTCTTTAGCCTTTCC-3'，擴增片段長度為188 bp。β-actin看家基因的引物序列正向：5'-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3'，反向：5'-TCCCT CTCAGCTGTGGTGGTGAA-3'，擴增片段長度為590 bp。NF-κB的PCR反應程序設定為95℃預變性5min，然后按下列設定程序進行循環：94℃加熱15 s，59℃退火40 s，72℃延伸45 s，34個循環后于72℃再延伸10min。IL-4的PCR反應程序設定為95℃預變性5min，然后按下列設定程序進行循環：先94℃進行加熱15 s，然后設定63℃退火30 s，之后72℃延伸45 s，反復進行35個循環后再于72℃延伸10min后結束反應。

1.2.3 檢測方法采用RT-PCR反應將提取的標本RNA在一定反應條件下逆轉錄為cDNA。RTPCR反應按照說明書進行操作。PCR反應后，取9 μlMarker及9μl產物在瓊脂糖凝膠上持續電泳30min，分離PCR產物，凝膠成像儀上可清晰看見目的基因及看家基因的DNA擴增片段條帶。NF-κB的擴增片段條帶位于390 bp、IL-4的擴增片段條帶位于188 bp、看家基因β-actin的擴增片段條帶位于590 bp。用儀器自帶分析軟件以NF-κB擴增條帶吸收度值（DNF-κB）與內對照β-actin擴增條帶吸收度值（Dact）的比值（DNF-κB/Dact）為NF-κB mRNA的表達水平，同樣以DIL-4/Dact為IL-4的mRNA的表達水平。逐個計算標本的光密度比值后，對NF-κB、IL-4的相對表達水平進行半定量數值統計分析。

1.3 統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組資料間的均數比較用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

RNA瓊脂糖電泳顯示，28 s rRNA和18 s rRNA條帶明亮清晰，且第1條帶（28 s）亮度為第2條（18 s）亮度的大約2倍，顯示提取的標本mRNA質量較好，可以繼續進行后面的實驗（見圖1）。實驗組及對照組NF-κB、IL-4的mRNA均可見表達，且其在實驗組中的表達量高于其在對照組中的表達（P<0.05），見圖2、3和附表。

圖1 總RNA電泳鑒定圖

圖2 NF-κB的RT-PCR電泳圖

圖3 IL-4的RT-PCR電泳圖

附表 實驗組與對照組NF-κB、IL-4的m RNA表達量（±s）

附表 實驗組與對照組NF-κB、IL-4的m RNA表達量（±s）

組別NF-κB IL-4實驗組（n=90）1.093±0.263 0.852±0.238對照組（n=80）0.635±0.149 0.546±0.123t值10.027 7.476P值0.007 0.003

3 討論

本研究采用逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR反應）方法從基因水平來檢測NF-κB和IL-4的表達，更加準確地表明，NF-κB和IL-4在實驗組中的表達均高于對照組，其在鼻息肉的病理生理過程中可能發揮著極其重要的作用。

NF-κB是近年來發現的一組具有多種生物學效應的炎性轉錄因子，人類最初發現其可以調控B免疫球蛋白的k輕鏈而將其命名為NF-κB。研究發現，NF-κB多以同源或異源二聚體P65和P50的形式與抑制蛋白家族成員形成復合體存在于人體組織細胞中。從近幾年的研究來看，NF-κB在許多領域倍受關注，其在機體的免疫反應、炎癥反應、應激誘導反應、細胞的增殖與凋亡中都發揮著極其重要的作用[4]。NF-κB經典途徑活化后基因主要編碼MCP-1、IL-8等趨化因子，IL-4、IL-5、粒細胞集落刺激因子（GM-CSF）等炎癥細胞因子，其中眾多的炎癥細胞因子如IL-4和TNF-α又可繼續活化NF-κB信號通路，誘發更多的炎癥細胞因子表達水平上調，導致最初炎癥信號進一步放大，形成“瀑布效應”，這是NF-κB的正反饋調節，同時也是NF-κB反應靈敏并迅速增加的重要機制[5]。有最新研究表明，NF-κB mRNA主要表達分布與鼻息肉組織的嗜酸性粒細胞、上皮細胞、部分腺細胞、漿細胞及血管內皮細胞的細胞核和細胞漿中。提示NF-κB與鼻息肉的關系密切，可以通過抑制NF-κB的傳導同路來抑制炎癥細胞的分泌[6-7]。

IL-4是由抗原或絲裂原刺激B細胞、T細胞（Th2）產生的自分泌細胞因子，它可活化肥大細胞及各種粒細胞，與IL-5協同可刺激B細胞增殖并合成IgE及IgG1，國外有研究表明，在鼻息肉組織中的IgE水平與IL-4水平呈正相關。在正常人體中Th1和Th2細胞處于相對平衡趨勢，機體存在多種保持Th1/Th2平衡的調節機制。其中認為IL-4、IFN-γ的相互調節是維持Th1/Th2平衡的關鍵因素[8]。Th1/Th2的平衡失調，Th2細胞因子表達占據主導可能與鼻息肉的發生發展關系密切，而IL-4在Th2細胞因子產生和釋放中發揮極其重大的作用[9-10]。NF-κB是介導細胞內信號傳遞最重要的核轉錄因子，NF-κB與Th細胞分化的關系的研究目前尚處于起步階段。有研究發現，NF-κB參與Th1淋巴細胞免疫反應的調節過程，但也有學者認為NF-κB通過對淋巴細胞中IL-4基因轉錄的調控，使機體免疫反應向Th2淋巴細胞介導的體液免疫發展[11-12]。

本實驗RT-PCR結果表明，NF-κB和IL-4在鼻息肉組織中基因表達水平高于正常鼻甲組織，兩者可能在鼻息肉的發病機制中起著至關重要的作用。當機體受到外界病源微生物的刺激時，NF-κB和IL-4的表達量驟然增加，導致嗜酸性粒細胞的聚集，繼發加劇機體內Th2引發的炎癥反應，由Th2誘發的炎癥反應在機體內不斷加劇，并不斷刺激NF-κB和IL-4的進一步產生和釋放。Th2所誘導的炎癥反應不僅可雙重刺激體內IL-4的產生，與此同時也不斷促使大量其他的炎癥因子如粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）、IL-5、IL-8、IL-17、和TNF-α等，這些不同的炎癥因子與IL-4相互協同，使機體逐步失去了Th1/Th2的平衡。NF-κB和IL-4均參與鼻息肉的發病過程，研究表明，機體局部微環境的破壞可進一步誘發機體Th1/Th2的失衡，上述兩個方面相互作用，對鼻息肉的發病起著非常重要的作用。繼續深入研究NF-κB和IL-4的表達及其與鼻息肉的發病關聯，可以在今后鼻息肉的臨床預防、后期診斷及用藥治療上提供充足的理論依據和參考指標。

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（張蕾編輯）

Expression and significance of NF-κB/IL-4 gene in nasal polyp

Bei-beiWan,Le-nong Hu,Hong-wei Xu
(Lishui Central Hospital,Lishui,Zhejiang 323000,China)

ObjectiveTo investigate the different expression of nuclear factor-κb and lnterleukin 4(IL-4)gene in tissue of the nasal polyp.MethodsA number of 90 cases of nasal polyp were collected as experimental group and 80 cases inferior turbinate tissues as normal group.Real-time quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction(RT-PCR)method was used to detect the different expression of NF-κB and IL-4 gene,and relative analysiswas used to analyzed the results.ResultsCompared with normal group,the expression of NF-κB and IL-4 gene in expermental group was significantly increased(P＜0.05).ConclusionsThe expressions of NF-κB and IL-4 are increased in experimental group,whichmay relatewith the occurrence and developmentof nasal ployp.

NF-κB;IL-4;nasal polyp

R 765

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.24.009

1005-8982（2016）24-0043-04

2016-04-08