植物乳桿菌B002高密度發酵條件的研究

曹珂珂，李 妍，王 娣

蚌埠學院生物與食品工程系，安徽蚌埠，233030

植物乳桿菌B002高密度發酵條件的研究

曹珂珂，李 妍，王 娣

蚌埠學院生物與食品工程系，安徽蚌埠，233030

研究了培養基成分(生長因子、碳源、氮源)和培養條件(培養時間、培養溫度、接種量、初始pH)對植物乳桿菌B002高密度培養的影響，結果表明，菌體最適培養基條件為：在MRS基礎培養基中添加5%番茄汁、3%葡萄糖和2.5%胰蛋白胨；最適的培養條件為：5%接種量、初始pH6.5、37℃培養20 h。培養結束后，菌體密度達到4.71×109cfu/mL。

植物乳桿菌；高密度培養；培養基優化

乳酸菌是對能利用碳水化合物發酵產乳酸等有機酸的革蘭氏陽性菌的統稱[1]，它能促進腸道蠕動，促進消化[2]，被廣泛應用于乳制品行業以及泡菜生產、發酵香腸等。植物乳桿菌是乳酸菌的一種，兼性厭氧或者厭氧，屬于同型發酵乳酸菌，具有促進維生素D的吸收，提高鈣、磷的利用率，促進脂類的消化吸收，提高蛋白質的可消化性，緩解乳糖不耐受等作用，可用于發酵飲料、泡菜和肉制品。乳酸菌發酵蔬菜制品，既能賦予蔬菜清新香味，又能保持蔬菜原料脆、嫩、鮮、香的自然風味[3-4]。

高密度發酵是新近發展起來的一種發酵技術,它是生產高質量的濃縮型菌體和代謝產物、實現菌種規模化生產的關鍵因素[5-6]。本研究以MRS液體培養基為基礎，通過單因素試驗研究植物乳桿菌B002菌株的培養條件和培養基。在培養基條件單因素試驗的基礎上，正交優化了植物乳桿菌B002菌株培養基條件，以期提高植物乳桿菌的生長能力和活菌數[7-9]，為制備植物乳桿菌蔬菜發酵專用發酵劑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)B002，從酸黃瓜中選育，保存于蚌埠學院生物與食品工程系微生物實驗室。

1.1.2 主要培養基

10%脫脂乳培養基，MRS肉湯培養基，MRS固體培養基。

1.1.3 主要儀器

BHC-1300ⅡA/B2生物潔凈安全柜(蘇州凈化設備有限公司)，BSD-YX2200立式智能精密搖床(上海恒訊實業有限公司醫療設備廠)，ZDX-35BI型座式自動電熱壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫療器械廠)，752型紫外可見分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)。

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(責任編輯：汪材印)

1.2 方法1.2.1 種子液的制備

將已活化的植物乳桿菌B002取出搖勻，用微量移液器按1%的量將其移接到MRS液體培養基中，37℃培養12 h。

1.2.2 活菌數測定

采用平板活菌計數法，即用無菌水逐級稀釋，選取3個合適的稀釋度涂平板，每個稀釋度做3次重復，37℃培養24 h，計數。

1.2.3 植物乳桿菌B002高密度發酵的單因素試驗

將生長因子、碳源、氮源分別以一定的量添加到MRS基礎培養基中，調節不同的培養時間、起始pH、溫度、接種量，檢測不同的培養條件和培養基對菌體密度的影響。

1.2.4 植物乳桿菌B002高密度發酵的正交試驗

由于植物乳桿菌生長要求較復雜，根據單因素試驗選擇的培養基成分，采用三因素三水平進行正交試驗，以確定培養基的最佳方案。

2 結果與分析

2.1 植物乳桿菌B002高密度發酵培養條件的選擇

2.1.1 生長曲線

為了解植物乳桿菌B002在MRS基礎培養基中的生長情況，將菌株在37℃下培養48 h，每隔4 h取出采用稀釋涂布法計活菌數。由圖1可知，植物乳桿菌B002在經過短暫的4 h的延滯期后，迅速進入對數生長期。在此時期，菌體快速生長繁殖，16 h后，基本進入穩定期生長階段，在20 h左右，細胞密度達到2.28×109cfu/mL。

圖1 植物乳桿菌生長曲線

2.1.2 接種量對菌株生長的影響

將種子液按1%、3%、5%、7%、9% 的接種量接種于MRS基礎培養基上，37℃培養20 h，測定活菌數，結果如圖2所示。接種量對植物乳桿菌B002高密度發酵有一定的影響，隨著接種量的增加，植物乳桿菌B002活菌數呈上升趨勢；接種量為5%時，植物乳桿菌B002活菌數達到最高，隨后逐漸下降。接種量較少，菌體密度較小；接種量增加，菌體密度相應增加，但營養物質消耗過快，培養后期隨著營養物質的消耗，部分菌體會逐漸死亡，所以該菌株的最適接種量為5%。

圖2 接種量對菌體密度的影響

2.1.3 培養溫度對菌株生長的影響

按5%接種量將種子液接種于MRS基礎培養基中，分別放于20℃、25℃、30℃、37℃、42℃、45℃下培養20 h，測活菌數，結果如圖3所示。微生物在最適生長溫度條件下，菌種密度會達到最大值。植物乳桿菌B002的最適生長溫度是37℃，在此溫度下，生長繁殖最旺盛，所以選擇37℃培養該菌株。

圖3 培養溫度對菌體密度的影響

圖4 初始pH值對菌體密度的影響

2.1.4 初始pH值對菌株生長的影響

用1 mol/L的HCl和1 mol/L的NaOH調節MRS培養基的起始pH值分別為4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8，37℃培養20 h，測定活菌數。pH值是影響微生物生長的主要因素之一，每種微生物都有最適生長的pH值。由圖4可知，培養基的初始pH為6.5時，植物乳桿菌B002生長最為旺盛，活菌數較高。初始pH過低或過高，都不利于其生長，因此，該菌株在培養時，初始pH值可以控制在6～7之間。

2.2 植物乳桿菌B002高密度發酵培養基的選擇2.2.1 不同生長因子對菌株生長的影響

在MRS液體培養基的基礎上，依次添加5%(V/V)的番茄汁、香菇汁、玉米汁、胡蘿卜汁和黃瓜汁作為不同的生長因子，按5%接種量，37℃培養20 h，測活菌數，結果如圖5所示。植物乳桿菌為生長因子異養型微生物，自身不能合成生長因子[10]，在培養基中添加番茄汁、胡蘿卜汁、玉米汁等作為生長因子的供體，可以促進菌種的生長。在幾種生長因子中，番茄汁對植物乳桿菌B002的增殖效果最明顯，可能是番茄汁作為生長因子能提供一些礦物質、維生素，對其生長繁殖有一定的促進作用。

2.2.2 不同碳源對菌株生長的影響

分別選擇葡萄糖、乳糖、果糖和蔗糖4種碳源以2%含量添加到MRS基礎培養基中，初始pH值6.5，5%接種量，37℃培養20 h，測活菌數，結果如圖6所示。作為微生物生長必需的營養物質之一，碳源不僅是微生物生長的能源物質，也是微生物的組成物質。由圖6可以看出，植物乳桿菌B002在以葡萄糖為碳源的培養基中生長較好，菌體密度明顯高于含有其他碳源的培養基，因此該菌株的碳源選擇葡萄糖。

圖5 生長因子對菌體密度的影響

圖6 碳源對菌體密度的影響

2.2.3 不同氮源對菌株生長的影響

可以被微生物利用的氮源很多，本實驗在MRS基礎培養上分別添加2%的胰蛋白胨、牛肉膏、硫酸銨和硝酸銨作為氮源，結果如圖7所示。4種被試氮源中，有機氮源效果好于無機氮源，其中添加胰蛋白胨增菌效果最好，可能是作為有機氮源的胰蛋白胨含有植物乳桿菌B002生長所需要的氨基酸等物質。

圖7 氮源對菌體密度的影響

2.2.4 正交試驗

通過單因素試驗確定正交試驗中每種物質的添加量，采用L9(34)三因素三水平正交試驗優化培養基配方，結果如表1和表2。

表1 正交試驗因素水平表

表2 正交試驗結果

由表2中極差R可以看出，影響植物乳桿菌增殖的各因素中，葡萄糖>胰蛋白胨>番茄汁。根據試驗結果，確定最佳的培養基配方組合是A2B3C3。

2.2.5 驗證性試驗

為了驗證正交優化組合A2B3C3是否能達到植物乳桿菌B002的高密度培養，將A2B3C3組合與正交表中A2B2C3組合進行對比驗證試驗，按照正交優化組合A2B3C3的培養基條件，以5%接種量，初始pH6.5，37℃培養20 h，植物乳桿菌B002的活菌數達到4.71×109cfu/mL，高于正交試驗表中的所有結果，所以該菌株培養基最佳組合為在MRS基礎培養基中添加5%番茄汁、3%葡萄糖和2.5%胰蛋白胨。

3 結束語

以植物乳桿菌B002為出發菌株，優化其高密度培養基和培養條件，最優培養基組合為：在MRS基礎培養基中添加番茄汁5%、葡萄糖3%和2.5%胰蛋白胨，在此條件下，初始pH6.5，5%接種量，37℃培養20 h，培養結束后，植物乳桿菌B002菌體密度達到4.71×109cfu/mL。

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(責任編輯：汪材印)

10.3969/j.issn.1673-2006.2016.03.031

2015-11-25

安徽省高校自然科學研究一般項目“蔬菜發酵專用乳酸菌的選育及其凍干發酵劑的研究”(KJ2013Z194)。

曹珂珂(1980-)，女，安徽界首人，碩士，講師，主要研究方向：微生物發酵。

Q939.97

A

1673-2006(2016)03-0123-04