人臍帶血間充質干細胞移植對腦梗死大鼠外周血Foxp3表達的影響

2017-01-12 07:36:17劉學春汪青松

中風與神經疾病雜志 2016年12期

侯亮，徐芳，劉學春，汪青松

侯亮，徐芳，劉學春，汪青松

目的探討人臍帶血間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSC)移植對腦梗死大鼠外周血Foxp3調節性T細胞改善缺血性腦損害的可能機制。方法選擇SD大鼠40只，隨機分為假手術組、對照組、生理鹽水組、MSC組，每組10只。各組大鼠分別測定1 d、7 d、14 d、28 d外周血單個核細胞中Foxp3 mRNA表達和神經功能缺損評分；TUNEL法檢測神經細胞凋亡數。結果 MSC組14 d、28 d神經功能缺損評分明顯低于對照組及生理鹽水組[(6.1±1.4)分 vs (7.3±1.1)分，(7.3±0.9)分；(5.2±1.0)分 vs (6.2±1.0)分，(6.3±0.5)分；P<0.05]； 28 d凋亡細胞數明顯少于對照組及生理鹽水組(P<0.05)。對照組、生理鹽水組及MSC組1 d、7 d、14 d、28 d外周血Foxp3 mRNA表達明顯高于假手術組，差異有統計學意義(P<0.01)。 MSC組1 d、7 d外周血Foxp3 mRNA表達明顯高于對照組和生理鹽水組，差異有統計學意義(P<0.05)。結論 MSC移植改善大鼠急性腦缺血神經功能恢復的機制之一,可能與上調免疫炎性反應初期Foxp3 mRNA表達有關。

間充質干細胞；腦梗死； Foxp3

腦梗死因其致殘率、病死率高，易復發的特點,是嚴重危害人類健康的常見病、多發病。近年來重組組織型纖溶酶原激活劑的應用在溶栓治療方面取得了很大的進展，然而，由于溶栓治療時間窗較短(僅有6 h)，只有極少部分患者能從中受益，因此尋求一種新的、不受時間限制的方法治療腦卒中尤為重要。目前，以干細胞為基礎的新型治療策略已經成為研究熱點。國內外大量動物實驗和部分臨床試驗已經證實，無論是機體自身干細胞、祖細胞的動員、募集，還是自體或異體干細胞移植，能顯著改善受損的神經功能。經研究證實,人臍帶血間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSC)能分化成為包括少突膠質細胞、星形膠質細胞、神經細胞等多種類型細胞，從而使人臍帶血MSC治療腦卒中成為可能[1]。然而MSC通過何種或哪些途徑改善受損神經功能尚不明了[2]。本實驗通過對人臍帶血MSC移植后腦缺血大鼠靜脈血Foxp3表達的動態監測，探討人臍帶血MSC改善大鼠缺血性腦損傷的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組清潔級成年SD雄性大鼠40只，7～8 w齡，體質量250～300 g，購于安徽醫科大學實驗動物房。自由飲食,室溫控制在(23±3)℃,每日光照12 h、黑暗12 h，術前隨機分為假手術組、對照組、生理鹽水組、MSC組，每組10只。

1.2 人臍帶血MSC的分離和培養及鑒定人臍血MSC的分離和培養：健康足月剖宮產新生嬰兒臍帶血40份，標本由本院婦產中心提供，產婦及家屬均簽署知情同意書。術前行感染免疫九項檢查(乙肝五項、癌胚抗原、甲胎蛋白、梅毒血清特異性抗體測定、結核桿菌抗體試驗)及常規檢查，排除梅毒、艾滋病、肝炎等傳染性疾病的可能，無菌條件下采集臍帶血，由解放軍105醫院細胞生殖中心分離培養人臍帶血MSC以備用。

1.3 大鼠大腦中動脈缺血模型的建立和干預采用改良線栓法制作大鼠右側大腦中動脈缺血模型,造模前12 h大鼠禁食但不禁水，3.6%水合氯醛(1 ml/100 g)腹腔注射麻醉后，置于操作臺上，保溫：60瓦白熾燈37 cm，高度直接照射，可使肛溫保持在37 ℃。電子體溫計監測肛溫,維持在(37±0.5)℃，頸部正中切口長2～3 cm，分離右頸總動脈，動脈夾于頸內動脈根部遠端5 mm處夾閉，動脈夾夾閉頸內動脈根部遠端5 mm處，頸內動脈根部剪一斜形小口，插入經處理過的0.8號漁線，結扎頸內動脈，剪斷漁線殘端,縫合皮膚，栓塞2 h。模型成功的標準：提大鼠尾部，使其懸空， 30 s內出現轉頸超過10°，左前肢(腦缺血對側)屈曲內收，肌張力下降，爬行時呈典型追尾征，若無此典型癥狀予以剔除。大腦中動脈缺血模型制備成功后10 min，收集人臍帶血MSC生理鹽水稀釋液1 ml (1×106細胞)，經尾靜脈注射到MSC組大鼠體內，將等量生理鹽水通過尾靜脈注射到生理鹽水組大鼠體內。對照組僅建立模型，假手術組僅分離出頸總動脈、頸內動脈及頸外動脈。

1.4 神經功能缺損評分 3組大鼠模型制備后1 d、7 d、 14 d、28 d采用改良的神經功能缺損評分分別進行盲評，共18分，其中1～6分為輕度神經功能缺損；7～12分為中度神經功能缺損；13～18分為重度神經功能缺損[3]。

1.5 外周血Foxp3的表達人臍帶血MSC注射成功后1 d、7 d、14 d、28 d分別抽取各組大鼠尾靜脈血0.1 ml，肝素抗凝。TRZzol一步法提取總RNA。按照說明書步驟操作，紫光分光光度計測其濃度并反轉錄合成cDNA,膠回收法純化DNA片段作為標準品。熒光RT-PCR法測定外周血單個核細胞Foxp3 mRNA表達，并以U6和β肌動蛋白(β-actin)為內參物，采用標準曲線法計算其相對表達量的U6和β-actin校正值。

1.6 TUNEL法細胞凋亡檢測對照組、生理鹽水組、MSC組各取10只大鼠分別于再灌注28 d再次麻醉，4%多聚甲醛心臟灌注固定，分別于每例切片的缺血區取腦，10%甲醛溶液固定，制備5 mm厚的石蠟切片。常規脫蠟至水，按照試劑說明書操作，對氨基聯苯胺顯色、乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封固。在顯微鏡200倍視野下細胞核出現棕黃色顆粒者為陽性細胞，即凋亡細胞。缺血區連續拍攝6張照片，并計算TUNEL陽性凋亡細胞數。

2 結果

2.1 各組不同時間點神經功能缺損評分比較 MSC組、對照組和生理鹽水組1 d、7 d神經功能缺損評分比較，差異無統計學意義(P>0.05)。MSC組14 d、28 d神經功能缺損評分明顯低于對照組和生理鹽水組，差異有統計學意義(P< 0.05，見表1)。

2.2 各組不同時間點外周血Foxp3 mRNA表達比較對照組、生理鹽水組及MSC組1 d、7 d、14 d、28 d 外周血Foxp3 mRNA表達明顯高于假手術組，差異有統計學意義(P< 0.01)。 MSC組1 d、7 d外周血Foxp3 mRNA表達明顯高于對照組和生理鹽水組，差異有統計學意義(P<0.05，見表2)。

2.3 各組大鼠28 d凋亡細胞數的比較光鏡下可見，假手術組皮質區僅有少數或無凋亡細胞。生理鹽水組、對照組可見大量棕黃色凋亡細胞。假手術組、對照組、生理鹽水組和MSC組28 d凋亡細胞數分別為(1.50±1.08)個、(9.80±2.57)個、(10.10±2.33)個和(7.60±1.43)個。假手術組和MSC組28 d凋亡細胞數明顯少于對照組和生理鹽水組，差異有統計學意義(P<0.05，見圖1～圖4)。

表1 各組不同時間點神經功能缺損評分比較±s，n=10)

與對照組比較*P<0.05；與生理鹽水組比較△P<0.05

表2 各組不同時間點外周血Foxp3 mRNA表達比較

與假手術組比較*P<0.01；與對照組比較△P<0.05；與生理鹽水組比較#P<0.05

3 討論

近些年中樞神經系統疾病治療中，細胞移植物的來源主要有神經干細胞和胚胎組織細胞，但由于供體來源困難、法律上和倫理學存在異議、免疫排斥反應、移植細胞存活困難等問題導致發展空間有限。人臍帶血MSC具有全能干細胞的特點，一定條件下可跨胚層橫向分化，與骨髓比較，臍血來源更充足，臍血免疫原性較弱，能耐受更大程度的人類白細胞抗原配型不符，并且來源豐富、易于采集、保存方便、傳代穩定，因此可作為一種新的替代細胞來源用于中樞神經系統疾病的細胞移植治療[4]。國內外研究表明,人臍帶血MSC經體循環遷移至腦損傷區域并存活，分化為神經細胞，促進受損的神經功能恢復[5～8]。炎性反應在急性腦缺血后的腦損傷中起到非常重要的作用[9,10]。CD4、CD25 T細胞在此過程中可抑制促炎性因子表達的上調及阻止淋巴細胞、中性粒細胞、小膠質細胞的活化以及對大腦的損害，從而減輕腦組織免疫損傷的發生，而CD4、CD25 T細胞是調節性T細胞的一個重要亞群,具有免疫抑制性和免疫無能性兩大功能特征,由調節性T細胞分泌的抗炎細胞因子在抑制免疫炎性反應中發揮重要作用，它們可以抑制TNF-α、IFNγ和白細胞介素-6的神經毒性作用，可減弱缺血性腦卒中所致的炎性反應，減輕血腦屏障的損傷，具有促進神經細胞再生和神經保護的功能，Foxp3可作為調節性T細胞特異分子標記物[11～16]。它的表達是該細胞發揮功能的前提。

本研究大腦中動脈缺血模型制作成功后，對照組、生理鹽水組及MSC組外周血Foxp3 mRNA表達明顯高于假手術組，說明急性腦缺血可引起免疫炎性反應的發生，從而誘導Foxp3 mRNA表達上調，發揮其免疫抑制作用。MSC組1 d、7 d Foxp3 mRNA表達明顯高于對照組及生理鹽水組，說明急性腦缺血初期人臍帶血MSC可更明顯的抑制免疫炎性反應的發生，從而產生腦保護作用。人臍帶血MSC移植后28 d，MSC組凋亡細胞數明顯少于對照組及生理鹽水組，且神經功能缺損評分明顯低于對照組及生理鹽水組，說明Foxp3 mRNA表達增高與神經功能恢復相關。

綜上所述，Foxp3參與了急性腦缺血的病理生理過程，在急性腦缺血后抑制免疫炎性反應的發生以及促進神經功能的恢復中發揮著重要作用， MSC移植改善大鼠急性腦缺血神經功能恢復的機制之一，可能與上調炎癥初期Foxp3 mRNA的表達有關。

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Effect of human umbilical cord blood mesenchymal stem cells transplantation on Foxp3 expression in peripheral blood of errebral infarction rats

HOULiang,XUFang,LIUXuechun,etal.

(DepartmentofNeurology,ChinesePLACollegeofClinicalMedicine,Hefei230031,China)

Objective To explore the possible mechanisms of human umbilical cord blood mesenchymal stem cells (hUCB-MSCs) transplantation on improving ischemic brain damage,Foxp3 expression in peripheral blood was observed in rats following focal cerebral ischemia reperfusion (I/R).Methods 40 healthy SD rats were randomly divided into sham operation group,I/R group,saline group and hUCB-MSCs group.Foxp3 mRNA expression in peripheral blood mononuclear cells and modified neurological severity score(mNSS) were measured 1 d,7 d,14 d and 28 d after reperfusion.Neural cell apoptosis was detected by TUNEL 4 w after reperfusion.Results mNSS in hUCB-MSCs group 14 d and 28 d after reperfusion was significantly lower than that of control group and saline group[(6.1±1.4) points vs (7.3±1.1) points，(7.3±0.9) points;(5.2±1.0) points vs (6.2±1.0) points，(6.3±0.5) points;P<0.05].The number of neural cell apoptosis in hUCB-MSCs was obviously less than that of control group and saline group 28 d after reperfusion (P<0.05).Foxp3 mRNA expression level in hUCB-MSCs group was significantly higher than that of control group and saline group 1 d and 7 d after reperfusion (P<0.05).Conclusion Up-regulation of Foxp3 mRNA expression is one of the possible mechanisms of hUCB-MSCs transplantation on improving ischemic brain damage the mechanisms of inhibiting inflammatory reaction.

Mesenchymal stem cells; Brain infarction; Foxp3