苦參素對實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠腦內神經干細胞增值的影響

張慧君， 薛敬禮， 劉紅春， 趙曉玉， 劉 楠， 朱 琳

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苦參素對實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠腦內神經干細胞增值的影響

張慧君1， 薛敬禮2， 劉紅春3， 趙曉玉1， 劉 楠1， 朱 琳1

目的 觀察苦參素對實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)大鼠的治療作用及對腦內神經干細胞標志物-巢蛋白Nestin、轉錄因子Sox-2表達的影響，探討苦參素對EAE大鼠的治療機制。方法 將60只雌性Wistar大鼠隨機分為正常組、模型組和治療組，每組20只。用新鮮豚鼠全脊髓勻漿免疫誘導建立EAE模型，自免疫后第11天(發病初期)起，治療組大鼠每日腹腔注射苦參素6.70 ml/kg(250 mg/kg)，同時正常組與模型組注射等量生理鹽水。每天觀察并記錄大鼠的體重變化及神經功能學評分。給藥1 w后將大鼠處死，取脊髓和大腦，免疫組織化學法檢測腦內Nestin的表達，RT-PCR法測定腦內SOX-2含量的變化。結果 與模型組相比，治療組大鼠神經功能評分明顯降低，Nestin陽性細胞數和SOX-2的表達均顯著增加(P<0.05)。結論 苦參素對EAE大鼠有治療作用，其機制可能與增加中樞神經系統中神經干細胞的數量有關。

苦參素； 實驗性自身免疫性腦脊髓炎； 神經干細胞； 巢蛋白(Nestin)； SOX-2

多發性硬化癥(multiple sclerosis,MS)是一種慢性的退行性疾病，病變部位主要在中樞神經系統(central nervous system，CNS)，該病常伴隨有炎癥、免疫細胞浸潤、髓鞘脫失以及軸索損傷等病理變化。實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)是研究MS的經典動物模型[1]。苦參素(C15H24N2O2·H2O， 分子量282.38)是從苦參、廣豆根等豆科植物中提取出來的四環喹嗪啶類生物堿，其具有抗肝炎病毒、抗炎抗變態反應和抗腫瘤等作用[2]。神經干細胞(neural stem cell，NSC)是一種具有自我更新能力的細胞，可增殖分化為中樞神經系統內的3種基本細胞：神經元細胞、星形膠質細胞和少突膠質細胞[3]。巢蛋白(nestin)是神經上皮前體細胞中的一種中間絲蛋白，目前被廣泛用作NSCs的標志物[4]。Sox-2是轉錄因子的一種，其表達發生在整個成年期的中樞神經系統的神經發生區域，被看作是NSCs的另一個標志物[5]。本實驗通過測定EAE大鼠腦內神經干細胞Nestin和Sox-2的表達，探究苦參素對EAE防治作用機制。

1 實驗動物及試劑

1.1 實驗動物 清潔級雌性Wistar大鼠60只，6～8周齡， 體重180～220 g，動物批號：37009200001109； 健康豚鼠14只，體重300～350 g，批號：SCXK魯20130001，均由濟南朋悅實驗動物繁殖有限公司提供。

1.2 實驗藥品和試劑 苦參素注射液，0.6 g/2 ml，江蘇正大天晴藥業有限公司，批號：國藥準字H20057480；卡介苗，60 mg/支，北京生物制品研究所；完全弗氏佐劑，美國 Sigma 公司；Trizol，Transgene公司；RT-PCR逆轉錄試劑盒，Fermentas MBI；SOX-2引物由北京博大泰克公司合成；兔抗大鼠Nestin多克隆抗體,Santa cruz公司；濃縮DAB試劑盒，北京中杉生物工程有限公司。

1.3 儀器 S100 型PCR擴增儀； Imagemaster VDS凝膠成像分析儀；DYY-8C型電泳儀，北京市六一儀器廠；OLYM PUS病理圖像采集成像系統。

2 實驗方法

2.1 動物模型 參照文獻[6]提供的方法， 豚鼠用10%水合氯醛麻醉后，心臟灌流注生理鹽水，于無菌條件下取豚鼠脊髓，稱重，加等量生理鹽水，制成 50%(w/v) 豚鼠全脊髓勻漿， 將該勻漿與含有6 mg/ml卡介苗的完全弗氏佐劑等體積混合，于冰上反復抽推成油包水型乳劑，四肢足墊皮內及頸背部皮下注射免疫40只大鼠，每只 0.5 ml，誘導EAE模型。將60只大鼠隨機分成3組，分別為正常組、EAE模型組和苦參素治療組,苦參素治療組于免疫后第11天起每天一次腹腔注射6.70 ml/kg(250 mg/kg),連續給藥1 w，同時正常組和EAE模型組每天一次腹腔注射等量生理鹽水。

2.2 神經功能學評分 自免疫當日起,每日觀察并記錄大鼠體重變化，臨床癥狀及神經功能學評分。EAE模型評分采用五分評分法：1分：動物尾部無力；2分： 后肢無力；3 分：后肢癱瘓；4分：前、 后肢體均癱瘓；5分：瀕死或死亡。以大鼠達到或超過1分為臨床EAE發病。

2.3 免疫組織化學檢測大腦內Nestin蛋白的表達 實驗大鼠于免疫后第18天，均腹腔注射10%水合氯醛至麻醉，剪開大鼠胸腔，灌注針經左心室穿入主動脈，用預冷生理鹽水進行心臟灌流，直至肝臟變白，取脊髓腰膨大處和左腦固定于4%多聚甲醛中，固定24 h后，石蠟包埋制備成5 μm的切片，4 ℃保存備用；剩余脊髓和右腦置于-80 ℃冰箱保存備用。取石蠟切片，采用生物素蛋白-過氧化物酶(SP)法進行檢測。切片常規脫蠟水化，PBS漂洗3遍，檸檬酸抗原修復10 min，自然冷卻，PBS漂洗3遍，3% H2O2去離子水室溫孵育20 min， PBS漂洗3遍，滴加封閉用正常山羊血清工作液，37 ℃孵育40 min，甩去多余液體滴加1∶150 比例稀釋的一抗，4 ℃ 過夜后，PBS漂洗3遍，滴加山羊抗小鼠二抗工作液，37 ℃孵育30 min，PBS漂洗3遍，滴加辣根酶標記鏈酶卵白素工作液，37 ℃孵育30 min， PBS漂洗3遍，DAB顯色，顯微鏡下控制顯色時間(2～3 min)，蘇木素復染5 min，鹽酸乙醇分化， 自來水充分沖洗， 脫水、 透明、 封片、 鏡檢。以胞漿呈棕黃色為細胞陽性表達，用病理圖像分析軟件分析每個高倍視野下陽性染色細胞數。

2.4 逆轉錄聚合酶鏈反應法(RT-PCR)檢測腦內Sox-2的表達 將凍存管中的脊髓投入液氮中研碎， 按Trizol 提取試劑盒提取總RNA， 進行逆轉錄反應：8 μl總RNA、 1 μl oligo(dT)、10 μl 2ES及1 μl ES， 輕輕混勻，42 ℃孵育30 min， 85 ℃加熱 5 min。取2 μl進行后續擴增， 其余-80 ℃保存。PCR擴增：SOX-2的引物序列：Sense：5’-GGCCTGGGTGCGGGCGTGAA-3’；Antisense:5’-GAGTGGGAGGAAGAGGTAACCACGG-3’；片段大小為346 bp。內參為GAPDH，內參引物序列：Sense：5’-ACAAGATGGTGAAGGTCGGTGTGAA -3’；Antisene：5’-TTCACACCGACCTTCACCATCTTGT-3’；片段大小為571 bp。反應體系：cDNA 2 μl，SOX-2前后引物各1 μl 或GAPDH前后引物各1 μl，10×Buffer 5 μl， dNTP 4 μl， DNA Polymerase 1 μl， DEPC 36 μl，總反應體系為50 μl ，SOX-2及內參循環條件均為94 ℃預變性2 min，一個循環；94 ℃變性30 s，58 ℃(及52 ℃)退火30 s，72 ℃延伸2 min，35 個循環；72 ℃終末延伸6 min。取 5 μl PCR 擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳， 圖像使用Quantity One分析軟件進行灰度掃描分析，目的基因Sox-2 mRNA 的表達量是目的基因Sox-2與β-actin的PCR 條帶灰度值之比。

3 結 果

3.1 苦參素對于EAE大鼠神經功能評分的影響 在本次實驗中，自免疫后第9天起，大鼠開始陸續出現臨床指癥，具體表現為毛色晦暗松亂，活動減少，尾部無力，相繼出現后肢癱瘓，體重迅速下降，易激怒，繼而全身癱瘓，個別處于瀕死狀態。 與正常組比較， 模型組大鼠神經功能學評分顯著增加。自免疫后第11天起，苦參素組大鼠開始接受藥物治療，藥物治療組大鼠的神經功能學評分均低于模型組，且第16天起兩組評分間呈現顯著性差異(P<0.05,見圖1)。

3.2 大鼠腦內Nestin陽性細胞表達量 與正常組比較，模型組大鼠腦內Nestin陽性細胞數顯著增加,有統計學意義(P<0.01)；與EAE模型組相比，苦參素治療組腦內Nestin陽性細胞數也顯著增加(P<0.05)(見圖2)。

3.3 大鼠腦內Sox-2 mRNA 表達 與Nestin陽性細胞數變化一致，模型組大鼠腦內Sox-2表達量較正常組顯著增加(P<0.01)，而苦參素能顯著增加EAE大鼠腦內Sox-2表達(P<0.01)(見圖3)。

與治療組比較差異有統計學意義*P<0.05

與正常組相比差異有統計學意義**P<0.01；與模型組相比差異有統計學意義#P<0.05

圖2 免疫組化染色檢測腦中Nestin表達 A：免疫組化染色圖片，×400；B：Nestin陽性細胞表達數

與正常組相比差異有統計學意義**P<0.01；與模型組相比差異有統計學意義##P<0.01

圖3 RT-PCR檢測腦中Sox-2含量 A：PCR結果圖示；B：Sox-2相對灰度值分析

4 討 論

中樞神經系統脫髓鞘和軸突損傷是MS的主要病理改變，也是MS患者永久殘疾的重要病理決定因素[1]。長期以來，人們普遍認為哺乳動物CNS受損后不能產生新的神經元，也不能大量產生有功能的軸突，修復能力十分微弱。近年來許多研究發現，成年個體海馬和管室膜下層細胞具有分裂產生新神經元的能力，并成功分離出了能不斷增值且具有多種分化潛能的細胞群，即神經干細胞。其通過神經修復作用在治療MS等神經系統疾病中顯示了巨大的應用前景[7]。NSCs分為外源性和內源性兩種，但外源性NSCs難以向功能性神經元定向分化而多分化成神經膠質細胞。因此，通過激活內源性NSCs增殖、分化，使受損的CNS進行自我修復成為MS等腦損傷疾病的研究熱點[8]。在之前的研究中我們發現，苦參素在預防MS的過程中可抑制T細胞、B細胞以及巨噬細胞的免疫功能活性[9]，但對于其能否促進內源性內源性神經干細胞的增殖尚未可知。

本次實驗中，檢測到EAE組大鼠較正常組大鼠脊髓內NSCs數量顯著增加，其機制可能是由于NSCs在正常狀態下并不存在增殖分化活動，當腦內受到病理損傷等刺激而引起微環境發生改變，達到引起其分裂的閾值時，可刺激NSCs的增殖分化[10]。在MS發病過程中，炎性因子透過血腦屏障進入CNS，引起CNS中微環境改變，從而激活了其中休眠的NSCs,使其從靜息狀態轉為激活狀態。給予苦參素治療后，EAE大鼠神經功能學評分得到了顯著改善，同時炎癥浸潤及髓鞘脫失狀況得到有效緩解，同時，治療組EAE大鼠腦內Nestin和Sox-2表達均高于模型組，提示苦參素可能通過促進EAE大鼠中樞神經內NSCs的增殖，從而加速腦損傷的修復。

綜上所述，苦參素能有效緩解EAE大鼠臨床癥狀，可能與其能促進EAE大鼠CNS內神經干細胞的增殖有關。

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The effect of Matrine on the endogenous neural stem cells proliferation in the experimental autoimmune encephalomyelitis rat brain

ZHANGHuijun,XUEJingli,LIUHongchun,etal.

(DepartmentofPharmacy,TheFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China)

Objective To observe the effect of matrine on neural stem cells (NSCs) marker (Nestin and SOX-2) in the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) rats brains,and explore the mechanism of matrine on EAE.Methods Sixty female Wistar rats were randomly divided into 3 groups:Normal group (n=20),EAE model group (n=20) and MAT treated group (n=20),EAE model was established by injecting fresh guinea cord homogenate (GPSCH) plus Freund’s adjuvat (CFA).MAT was injected intraperitoneally (i.p.) at 6.70 ml/kg(250 mg/kg)daily,starting from day 11 post immunization (p.i.).Immunized rats that received the same volume of normal saline only i.p.Served as the vehicle control group,and nonimmunized naive rats that received the same amount of normal saline i.p.served as the naive control.Rats were monitored and weighed daily from the day one post immunization to evaluate clinical scores of EAE after immunization.On day 18 p.i rats were sacrificed and spinal cords and brains were harvested,then inflammatory infiltration were determined by hematoxylin and eosin (H&E) staining and demyelination by Luxol fast blue (LFB) staining,the expression of Nestin and Sox-2 was detected by Immunochemistry and RT-PCR,respectively.Results The neurology scores,inflammatory infiltration and foci of demyelination was significantly inhibited by MAT treatment (P<0.01),and the level of Nestin and Sox-2 was increased notably (P<0.05) in MAT treated group.Conclusion Matrine has therapeutic effect on EAE,which may be related to the increased number of NSCs.

Matrine; Experimental autoimmune encephalomyelitis(EAE); Neural stem cells(NSCs)； Nestin; Sox-2

1003-2754(2016)12-1101-03

2016-08-13；

2016-11-30 基金項目：河南省科技廳(No.152102310044) 作者單位：(1.鄭州大學第一附屬醫院藥劑科，河南 鄭州 450000；2.河南省醫學實驗動物中心，河南 鄭州 450000；3.鄭州大學第一附屬醫院檢驗科，河南 鄭州 450000) 通訊作者：朱 琳，E-mail：zhulin66zhulin@126.com

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