肝內膽管細胞癌發生的分子機制研究進展

賴曉龍 陸才德

肝內膽管細胞癌發生的分子機制研究進展

賴曉龍 陸才德

肝內膽管細胞癌是一類預后較差的惡性腫瘤。其發病的分子機制尚不明確，近年來的研究揭示肝內膽管細胞癌異常的分子遺傳學特征，其中融合基因（FGFR2、ROS1）、代謝相關基因突變（IDH1/2）及Wnt、Notch信號通路異常可能參與其發生、發展，而這些發現有望推動疾病的診斷、預后評估并引領精準靶向治療。本文就肝內膽管細胞癌發生的分子機制研究進展作一綜述。

肝內膽管細胞癌 分子機制 綜述

肝內膽管細胞癌（intrahepatic cholangiocacinoma，ICC）是起源于肝內膽管上皮的惡性腫瘤，約占原發性肝癌的10%～15%，且其發病率呈逐年上升趨勢[1]。手術治療是目前唯一治愈性的治療策略，但由于ICC極易早期轉移及復發，術后5年生存率僅為14%～40%。放、化療等輔助治療亦未能明顯改善ICC患者的總體生存率[2]。同時，臨床目前缺乏ICC的靶向治療藥物。

ICC發生的分子機制目前尚不明確，早期研究認為與慢性膽道炎癥及膽汁淤積持續刺激膽管上皮細胞，一系列炎癥因子的釋放和生長因子的激活引起細胞增殖、凋亡相關基因調控失衡（如IL-6/MAPK/STAT、HGF/ met、EGF/c-erbB-2、p53信號通路），最終導致腫瘤性增殖，并獲得特征性的細胞學改變：無限增殖（端粒酶逆轉錄酶激活）、凋亡逃避（由Bcl-2、COX-2介導）、促血管生成作用（血管內皮生長因子水平上調）、侵襲轉移能力增強（E-cadherin低表達、MMP高表達）等有關[3-4]。近些年來，ICC基因組的異常改變及基因表達調控通路異常被證實，與此同時針對這些改變的靶向治療藥物也逐步進入實驗研究階段。因此，充分了解相似組織形態學下所蘊含的不同分子遺傳學改變及其功能，可以為ICC的臨床診治提供參考。現將ICC發生的分子機制研究進展綜述如下。

1 基因組異常改變

1.1 FGFR2融合基因 成纖維細胞生長因子受體（fi-broblast growth factor receptor，FGFR）是一種跨膜酪氨酸激酶受體，廣泛存在于正常細胞。它通過與成纖維細胞生長因子配體結合發生二聚體化、自磷酸化，進一步激活下游信號通路如MAPK、PI3K/AKT/mTOR、JNK/ STAT等，調控細胞增殖、分化、遷移及血管生成等[51]。Wu等[6]對數種實體腫瘤進行基因測序，首次發現ICC中存在FGFR2融合基因。ICC患者中FGFR2融合基因的檢出率約為13.6%～45.0%，已發現的融合類型有FGFR2-BICC1、FGFR2-PPHLN1、FGFR2-MGEA5、FGFR2-TACC3等[6-10]。值得注意的是，FGFR2融合基因均出現在ICC患者中，而在肝細胞肝癌及肝外膽管細胞癌中沒有發現，這提示FGFR2基因融合可能是ICC特征性的遺傳學改變[9-10]。FGFR2融合基因與ICC患者臨床病理資料的相關性不明確。日本人群的研究數據分析提示FGFR2融合基因與乙肝、丙肝的感染相關，與預后無關[10]。北美的數據分析則顯示女性人群FGFR2融合基因的檢出率高于男性，融合基因陽性患者的中位生存時間明顯高于陰性患者[11]。這兩項研究結果的差異可能與地域、人種、飲食等因素有關，需要后續大規模的流行病學調查進一步驗證。

目前認為，FGFR2融合基因的致癌機制通過活化酪氨酸激酶進而引發下游信號通路異常激活，其中部分融合形式（FGFR2-BICC1、FGFR2-PPHLN1、FGFR2-AHCYL1）的促癌作用已在體內、體外實驗中得到證實[9-10]。FGFR2融合基因的存在預示著腫瘤細胞可能對選擇性FGFR2抑制劑敏感。Borad等[7]對2例晚期ICC患者（接受正規化療后疾病未控制）進行基因檢測發現存在FGFR2融合基因（FGFR2-TACC3、FGFR2-MGEA5），在使用小分子激酶抑制劑帕唑帕尼（美國，葛蘭素史克，200mg/片，NDA:022465）及帕納替尼（美國，阿瑞雅德，45mg/片，NDA:203469）治療后腫瘤進展得到有效的控制，這項結果為FGFR酪氨酸激酶抑制劑在ICC合并FGFR2融合基因或FGFR2基因突變患者的臨床應用提供了初步依據。然而不同融合類型的預后及其對抑制劑的敏感性尚無報道，需要未來大樣本的回顧性研究及實驗研究進行評估。

1.2 ROS1融合基因 原癌基因1（c-ros-oncogene1，ROS1）編碼的受體酪氨酸蛋白激酶參與胞內信號通路的調節，ROS1基因融合、突變等原因可導致ROS蛋白持續表達，驅動細胞增殖進而促進腫瘤的生長。ROS1基因融合在ICC、惡性膠質瘤及非小細胞性肺癌等多種腫瘤中均有報道[12]。Gu等[13]研究發現8.7%（2/23）的ICC患者中存在ROS1融合基因，后續的體內、外實驗中發現FIG-ROS融合蛋白使NIH3T3細胞發生致癌性轉化，而這種現象可以被ALK抑制劑逆轉。另一項研究在合并有K-ras和p53突變的ICC動物模型上證實了FIG-ROS融合基因的致癌作用，而去激活融合基因后表現出預期的抗腫瘤效應，進一步支持FIG-ROS作為治療靶點的可行性[14]。已有個案報道酪氨酸激酶抑制劑克唑替尼（美國，輝瑞，250mg/片，NDA:202570）對ROS1融合基因陽性的晚期非小細胞性肺癌治療有效[15]。然而ROS1融合基因在ICC患者中的檢出率及ROS1激酶抑制劑的治療效果需要后續的進一步研究。

1.3 IDH1/2基因突變 異檸檬酸脫氫酶（IDH）是人體中重要的代謝酶，參與三羧酸循環。IDH1/2基因突變在膠質瘤和急性髓細胞性白血病較為常見，在ICC中的突變率約為10%～28%[16]。一項基于32例ICC組織外顯子測序研究發現，IDH1/2突變與預后呈負相關，IDH1/2突變組患者的3年生存率（33%）低于IDH野生型患者（81%）[17]，另一項326例大樣本研究的數據則顯示IDH1/2突變組患者的術后無瘤生存時間及總生存時間均大于未突變組[18]。在晚期ICC患者中，IDH突變與患者預后未表現出明顯的相關性[19]。IDH正常生理作用為催化異檸檬酸轉化為α-酮戊二酸（α-KG），并產生NADPH。目前的研究證實，IDH基因突變能改變酶的催化活性，催化α-KG產生2-羥戊二酸（2-HG），2-HG能競爭性抑制多種α-KG依賴的雙加氧酶(包括DNA去甲基化酶、組蛋白去甲基化酶等)，改變基因的表觀遺傳學特征，影響細胞增殖分化，促進腫瘤的發生[16]。Wang等[18]研究發現在IDH1/2突變的ICC中出現P53蛋白水平升高而p53基因未發生突變，推測IDH1/2突變引起細胞應激反應繼而導致p53基因的激活。Saha等[20]發現IDH突變所產生的 2-HG能夠抑制肝細胞核因子 4α（HNF4α），然后阻斷肝細胞分化，并誘導肝祖細胞增殖并向ICC分化。鑒于IDH1/2突變在腫瘤機制研究的深入，IDH突變引起的代謝改變有望成為靈敏、特異的早期診斷指標。目前靶向治療的策略以抑制突變酶及其產物為主，特異性針對突變酶的小分子抑制劑已有報道，其可行性已經在膠質瘤及白血病的實驗研究中得到驗證[21-22]。此外，IDH1/2突變有關的表觀遺傳學及代謝組學的機制研究，有望為發展更多治療靶點提供理論支持。

2 基因表達調控通路異常

基因表達調控通路的異常是腫瘤發生的重要機制之一。一項研究通過對149例ICC基因組測序分析，根據基因表達譜差異及信號通路改變情況對ICC進行分子病理學分類，分為增殖型和炎癥型。增殖型腫瘤主要以RAS/MAPK、HGF/MET、EGFR等細胞增殖相關信號通路過度激活為特征，炎癥型則表現為細胞因子相關通路信號分子的富集和STAT3持續表達[23]。此外，最新的研究將關注點聚焦于Notch及Wnt信號通路。

2.1 Notch信號通路 Notch信號通路在肝臟發育、正常肝臟結構形成及維持過程中具有重要的調節作用，同時它參與細胞的分化增殖與凋亡、肝臟的損傷修復及肝臟代謝。近年的實驗結果顯示Notch信號通路可能在ICC的發生、發展過程中扮演重要的角色[24]。2項獨立的研究利用轉基因小鼠均驗證Notch信號通路的激活可以使分化正常的肝細胞轉化為膽管癌細胞[25-26]。Zender等[27]通過在轉基因小鼠肝臟中過表達Notch1胞內區域（Notch 1 intracellular domain，N1ICD）誘導發生ICC，其機制可能與Notch信號通路下游的cyclin E啟動子激活有關，過度表達的cyclin E影響基因的穩定性導致腫瘤的發生。此外，亦有報道稱p53基因去活化協同Notch通路增加腫瘤的負荷[28]。Wu等[29]對ICC及癌旁組織免疫組化分析比對發現，79.5%的腫瘤組織存在細胞膜及細胞質中Notch1蛋白水平高表達的現象，腫瘤細胞在敲除Notch1基因處理后，增殖能力、侵襲力減弱，對氟尿嘧啶的敏感性增加。由此可見，阻斷Notch信號通路有望成為ICC的治療靶點。Huntzicker等[30]對AKT、NRAS共激活的轉基因小鼠肝癌模型應用特異性抗體觀察靶向不同Notch受體產生的效應，其結果發現，Notch2抑制劑可以降低肝細胞癌樣及膽管癌樣腫瘤的負荷，而Notch1抑制劑則改變不同類型腫瘤的相對比例，肝細胞癌樣腫瘤減少而膽管癌樣腫瘤增加。總之，Notch信號通路中各基因及表達蛋白相互作用及機制、與其他通路之間相互聯系、在原發性肝癌發病某些關鍵環節中的作用有待進一步研究明確。

2.2 Wnt信號通路 Wnt信號通路涉及胚胎發育過程及組織穩態的調控，多種腫瘤與其異常激活有關，尤其是消化道腫瘤。Ong等[31]在對肝吸蟲相關性ICC的外顯子測序中發現基因PEG3、RNF43存在突變，而兩者負性調節Wnt信號通路，其功能缺失性突變可以激活Wnt信號通路影響染色體穩定性。Goeppert等[32]通過對ICC組織全基因組異常啟動子甲基化情況進行檢測，發現部分沉默基因與Wnt信號通路有關。進一步研究證實，膽管癌細胞在經過去甲基化處理后，Wnt信號通路相關基因（如SOX17、WNT3A、DKK2、SFRP1、SFRP2、SFRP4）的沉默狀態發生逆轉。其中SFRP2蛋白在ICC組織中表達下調，推測SFRP2基因可能作為抑癌基因參與ICC的發生。Boulter等[33]在ICC組織中發現經典Wnt通路存在異常激活，其靶基因及配體WNT7B、WNT10A表達水平升高。他們隨后進一步研究發現轉基因小鼠及化學誘導大鼠ICC模型中也同樣存在Wnt信號通路的持續激活，并證實這種狀態的維持依賴于由癌旁間質中巨噬細胞所分泌的WNT7B蛋白，這與Loilome等[34]的研究結果相符。此外，Boulter等[33]亦發現給予實驗動物Wnt信號通路抑制劑后，可有效地減少腫瘤細胞增殖并促進細胞凋亡。目前，盡管Wnt信號通路抑制劑在不斷研發優化，但其在多種惡性腫瘤中并沒有展現出預期的臨床療效，這可能與經典WNT信號通路中一些關鍵基因發現突變（如APC、CTNNB1等）有關，而散發性ICC的報道少有APC及CTNNB1基因變異，這為Wnt信號通路抑制劑在ICC中的應用提供了可能性。

3 小結

目前針對ICC的靶向治療藥物已成為臨床治療的迫切需求，基于一些靶向治療制劑在臨床前研究中的有效性，后續的Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗正在如火如荼地進行中，期待未來出現有效性高、耐受性好的靶向治療藥物。此外，ICC的分子機制研究仍然任重道遠，進一步發掘其中特異性的分子遺傳學改變，有助于腫瘤分子亞型的分類及靶向治療藥物的研發，最終給患者提供更精準、更個性化的治療方案及預后預測。

[1]Esnaola N F,Meyer J E,Karachristos A,et al.Evaluation and management of intrahepatic and extrahepatic cholangiocarcinoma[J].Cancer,2016,122(9):1349-1369.

[2]Lafaro K J,Cosgrove D,Geschwind J F,et al.Multidisciplinary Care of Patients with Intrahepatic Cholangiocarcinoma:Updates in Management[J].Gastroenterol Res Pract,2015,2015:860861.

[3]Berthiaume E P,Wands J.The molecular pathogenesis of cholangiocarcinoma[J].Semin Liver Dis,2004,24(2):127-137.

[4]Fava G,Lorenzini I.Molecular pathogenesis of cholangiocarcinoma[J].Int J Hepatol,2012,2012:630543.

[5]Ang C.Role of the fibroblast growth factor receptor axis in cholangiocarcinoma[J].J Gastroenterol Hepatol,2015,30(7):1116-1122.

[6]Wu Y M,Su F,Kalyana-sundaram S,et al.Identification of targetable FGFR gene fusions in diverse cancers[J].Cancer Discov, 2013,3(6):636-647.

[7]Borad M J,Champion M D,Egan J B,et al.Integrated genomic characterization reveals novel,therapeutically relevant drug targets in FGFR and EGFR pathways in sporadic intrahepatic cholangiocarcinoma[J].PLoS Genet,2014,10(2):e1004135.

[8]Ross J S,Wang K,Gay L,et al.New routes to targeted therapy of intrahepatic cholangiocarcinomas revealed by next-generation sequencing[J].Oncologist,2014,19(3):235-242.

[9]Sia D,Losic B,Moeini A,et al.Massive parallel sequencing uncovers actionable FGFR2-PPHLN1 fusion and ARAF mutations in intrahepatic cholangiocarcinoma[J].Nat Commun,2015,6:6087.

[10]Arai Y,Totoki Y,Hosoda F,et al.Fibroblast growth factor receptor 2 tyrosine kinase fusions define a unique molecular subtype of cholangiocarcinoma[J].Hepatology,2014,59(4):1427-1434.

[11]Graham R P,Barr Fritcher E G,Pestova E,et al.Fibroblast growth factor receptor 2 translocations in intrahepatic cholangiocarcinoma[J].Hum Pathol,2014,45(8):1630-1638.

[12]Davies K D,Doebele R C.Molecular pathways:ROS1 fusion proteins in cancer[J].Clin CancerRes,2013,19(15):4040-4045.

[13]Gu T L,Deng X,Huang F,et al.Survey of tyrosine kinase signaling reveals ROS kinase fusions in human cholangiocarcinoma[J].PLoS One,2011,6(1):e15640.

[14]Saborowski A,Saborowski M,Davare M A,et al.Mouse model of intrahepatic cholangiocarcinoma validates FIG-ROS as a potent fusion oncogene and therapeutic target[J].Proc Natl A-cad Sci U S A,2013,110(48):19513-19518.

[15]Chiari R,Buttitta F,Iacono D,et al.Dramatic response to crizotinib in ROS1 fluorescent in situ hybridization-and immunohistochemistry-positive lung adenocarcinoma:a case series[J]. Clin Lung Cancer,2014,15(6):470-474.

[16]Grassian A R,Pagliarini R,Chiang D Y.Mutations of isocitrate dehydrogenase 1 and 2 in intrahepatic cholangiocarcinoma[J]. Curr Opin Gastroenterol,2014,30(3):295-302.

[17]Jiao Y,Pawlik T M,Anders R A,et al.Exome sequencing identifies frequent inactivating mutations in BAP1,ARID1A and PBRM1 in intrahepatic cholangiocarcinomas[J].Nat Genet,2013,45(12): 1470-1473.

[18]Wang P,Dong Q,Zhang C,et al.Mutations in isocitrate dehydrogenase 1 and 2 occur frequently in intrahepatic cholangiocarcinomas and share hypermethylation targets with glioblas-tomas[J].Oncogene,2013,32(25):3091-3100.

[19]Goyal L,Govindan A,Sheth R A,et al.Prognosis and Clinicopathologic Features of Patients With Advanced Stage Isocitrate Dehydrogenase(IDH)Mutant and IDH Wild-Type Intrahepatic Cholangiocarcinoma[J].Oncologist,2015,20(9):1019-1027.

[20]Saha S K,Parachoniak C A,Ghanta K S,et al.Mutant IDH inhibits HNF-4alpha to block hepatocyte differentiation and promote biliary cancer[J].Nature,2014,513(7516):110-114.

[21]Rohle D,Popovici-Muller J,Palaskas N,et al.An inhibitor of mutant IDH1 delays growth and promotes differentiation of glioma cells[J].Science,2013,340(6132):626-630.

[22]Wang F,Travins J,Delabarre B,et al.Targeted inhibition of mutant IDH2 in leukemia cells induces cellular differentiation[J]. Science,2013,340(6132):622-626.

[23]Sia D,Hoshida Y,Villanueva A,et al.Integrative molecular analysis of intrahepatic cholangiocarcinoma reveals 2 classes that have different outcomes[J].Gastroenterology,2013,144(4):829-840.

[24]Geisler F,Strazzabosco M.Emerging roles of Notch signaling in liver disease[J].Hepatology,2015,61(1):382-392.

[25]Sekiya S,Suzuki A.Intrahepatic cholangiocarcinoma can arise from Notch-mediated conversion of hepatocytes[J].J Clin Invest,2012,122(11):3914-3918.

[26]Fan B,Malato Y,Calvisi D F,et al.Cholangiocarcinomas can originate from hepatocytes in mice[J].J Clin Invest,2012,122 (8):2911-2915.

[27]Zender S,Nickeleit I,Wuestefeld T,et al.A critical role for notch signaling in the formation of cholangiocellular carcinomas[J]. Cancer Cell,2013,23(6):784-795.

[28]Elkhatib M,Bozko P,Palagani V,et al.Activation of Notch signaling is required for cholangiocarcinoma progression and is enhanced by inactivation of p53 in vivo[J].PLoS One,2013,8 (10):e77433.

[29]Wu W R,Zhang R,Shi X D,et al.Notch1 is overexpressed in human intrahepatic cholangiocarcinoma and is associated with its proliferation,invasiveness and sensitivity to 5-fluorouracil in vitro[J].Oncol Rep,2014,31(6):2515-2524.

[30]Huntzicker E G,Hotzel K,Choy L,et al.Differential effects of targeting Notch receptors in a mouse model of liver cancer[J]. Hepatology,2015,61(3):942-952.

[31]Ong C K,Subimerb C,Pairojkul C,et al.Exome sequencing of liver fluke-associated cholangiocarcinoma[J].Nat Genet,2012, 44(6):690-693.

[32]Goeppert B,Konermann C,Schmidt C R,et al.Global alterations of DNA methylation in cholangiocarcinoma target the Wnt signaling pathway[J].Hepatology,2014,59(2):544-554.

[33]Boulter L,Guest R V,Kendall T J,et al.WNT signaling drives cholangiocarcinoma growth and can be pharmacologically inhibited[J].J Clin Invest,2015,125(3):1269-1285.

[34]Loilome W,Bungkanjana P,Techasen A,et al.Activated macrophages promote Wnt/beta-catenin signaling in cholangiocarcinoma cells[J].Tumour Biol,2014,35(6):5357-5367.

2016-09-20）

（本文編輯：李媚）

寧波市科技項目（2013B82010）

315211 寧波大學醫學院（賴曉龍）；寧波市醫療中心李惠利東部醫院肝膽胰外科（陸才德）

陸才德，E-mail：lucaide@nbu.edu.cn