維生素C熒光光譜的機理研究

陳亞斌,何建國,馬天蘭,丁佳興,吳龍國,賀曉光,王松磊,劉貴珊

(寧夏大學農學院,寧夏銀川 750021)

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維生素C熒光光譜的機理研究

陳亞斌,何建國*,馬天蘭,丁佳興,吳龍國,賀曉光,王松磊,劉貴珊

(寧夏大學農學院,寧夏銀川 750021)

以VC標品為研究對象,利用熒光分光光度計分別采集了280～350 nm激發波長下的熒光發射光譜,結果表明:VC溶液的最大熒光峰位于EX310 nm/EM400 nm,VC光譜的二階導數有4個極值點和3個拐點,分別為:328、345、355、372、395、425、525 nm。通過理論分析,證實395 nm是-OH發生的n→σ*電子躍遷,二烯醇結構π→π*電子躍遷產生的熒光峰由于共軛體系的作用發生紅移而位于425、525 nm。分子中的各個熒光團相互疊加且彼此制約,在分子團簇作用和水分子的H鍵的共同作用下,最終使得VC溶液在400 nm有最大熒光峰。

維生素C,熒光光譜,熒光峰

隨著人們生活水平的提高,人們更加提倡合理的膳食結構。VC是一種水溶性維生素易從體內流失,但由于人體不能合成VC,因此合理的補充VC對人體健康至關重要。VC是一個具有5元環平面剛性的多-OH化合物,其分子的雙烯醇式-OH極易解離,釋放出H+而被氧化成脫氫VC,是供電子體可清除自由基[1]。當VC缺乏時膠原蛋白的合成受阻,結締組織改變[2]。同時VC可改善鐵、鈣和葉酸的利用,預防動脈硬化,還與膝骨關節炎密切相關[3]。但同樣VC也有危害,如果一次性攝入VC2.5～5.0 g以上的藥劑,可能致使紅細胞大量破裂而出現溶血等現象[4]。可見如何準確的檢測出VC的含量對消費者至關重要。

果蔬中VC常用的測量方法有2,6-二氯靛酚滴定法、2,4-二硝基苯肼分光光度法、紙色譜法、薄層色譜法、高效液相色譜法、熒光分光光度法等[5]。針對不同的方法許多學者進行了研究,李天華等[6]用2,6-二氯靛酚滴定法結合近紅外實現了對番茄VC含量的預測。朱娜[7]采用HPLC法對果汁中VC的含量進行測定。傅維等[8]采用熒光分光光度法測定了幾種市售水果中VC的含量,建立了回歸方程。龔時瓊等[9]用分子熒光光譜儀測定了西紅柿、青椒的VC含量,檢出限為0.03 μg/mL。一般的研究僅僅是針對其含量進行定量分析建模,即使測定其熒光也僅僅考慮溶劑、pH、離子等熒光促滅效應,針對光譜的發射機理和熒光特性的研究卻很少。

本文以VC標品為研究對象,利用日立F-7000熒光分光光度計測定不同激發波長下的VC的熒光光譜,并結合VC的化學結構從理論上對VC熒光光譜的發射機理和熒光特性進行研究,旨在解釋VC的熒光光譜機理,為VC的熒光檢測與評價提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

VC標品 純度為100%,中國食品藥品檢定研究院。

日立F-7000熒光分光光度計 日立高新技術公司;石英比色皿(12.4 mm×12.4 mm×45 mm) 上海光譜儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 待測溶液 用超純水將VC稀釋成濃度為1 mg·mL-1的溶液。

1.2.2 熒光光譜的采集 使用日立F-7000熒光分光光度計,用沒有熒光的石英比色皿裝待測溶液,并將其放在熒光池中心點上。激發狹縫(EX Slit)10.0 nm,發射狹縫(EM Slit)10.0 nm,光電倍增管負高壓(PMT Voltage)400 V,掃描速度(Scan speed)2400 nm/min。采用波長掃描方式,發射波長的采集范圍下限比原激發波長大20 nm,分別采集280～350 nm的不同激發波長(激發波長每隔5 nm測量一次)下VC水溶液和蒸餾水的熒光發射光譜,得到相應的熒光譜圖。所有樣本測量均在常溫下完成(20～25 ℃)。

2 結果與分析

2.1 熒光發射圖譜分析

熒光光譜是受激發電子從激發態以輻射的形式回到不同振動能級的基態時所發出的光[10]。激發光譜則是分子從基態躍遷至第一電子激發態或更高電子激發態的各個不同振動能級所吸收的光能量。由于熒光光譜中存在的一個普遍現象—斯托克斯位移[11],斯托克斯位移是指熒光光譜與相應的吸收光譜相比出現的紅移現象,所以導致物質的發射波長大于原激發波長。實驗利用F-7000熒光分光光度計分別采集了280～350 nm的不同激發波長下的VC溶液和蒸餾水水的熒光發射光譜,結果如圖1、圖2所示。

圖1 VC溶液的熒光發射光譜圖Fig.1 Fluorescence spectra of vitamin C solution

從圖1、圖2得到的數據來看,在熒光發射光譜中550 nm之后的峰值是原激發波2次衍射造成的，不是VC的熒光,所以550 nm之后的峰不在考慮的范圍之內。圖1可以看出VC的熒光隨著激發波長的增加而發生不規則變化。激發波長從280～330 nm時,最大熒光峰出現在400 nm處一直不變。但當激發波長為335 nm時熒光峰變為370 nm處。在激發波長大于335 nm以后,最大熒光峰從370 nm向400 nm移動。激發波長為330～335 nm之間最大熒光峰有較大的位移。為了了解溶劑對溶質熒光光譜的影響,測量了蒸餾水在不同激發波長下的熒光光譜。從圖2可以看出蒸餾水在280～350 nm不同激發波長下的熒光發射光譜隨著激發波長的變化與VC溶液變化趨勢相同,在280～310 nm激發波長下最大熒光峰在335 nm處。當激發波長為315～330 nm時,最大熒光峰從355 nm移動到370 nm,蒸餾水激發波長為310～315 nm之間最大熒光峰有較大的位移。

圖2 蒸餾水的熒光發射光譜圖Fig.2 Fluorescence spectra of distilled water

VC水溶液發射光譜在激發波長330～335 nm之間最大熒光峰有較大的位移,而蒸餾水發射光譜在激發波長為310～315 nm之間最大熒光峰也有較大的位移,兩者峰位置不一致的原因在于VC水溶液中VC的-OH躍遷以及水分子團簇和H鍵的作用下使得熒光出現了較大的紅移現象。VC水溶液的熒光在激發波長大于330 nm時最大熒光峰有較大的位移，這是由于激發波長大于330 nm時激發波的光子能量不足以使得VC結構中的電子發生躍遷,溶液中的躍遷主要表現為水的熒光,所以最大熒光峰出現了較大的位移。

2.2 有機物分子中電子的存在形式

有機物電子以三種形式存在:形成單鍵的σ電子、形成雙鍵的π電子、未成鍵的n電子。基態時電子都處在各自最低能及軌道上,即σ成鍵軌道、π成鍵軌道上和n非成鍵軌道上。當激發的光子能量適合、碰撞方式正確時,處于基態的電子吸收合適的能量后,就會躍遷到任意一個較高能級的反鍵軌道上。一個允許的躍遷不僅要考慮能量的因素,還需符合動量守恒、自旋動量守恒以及受軌道對稱性的制約。即使是允許的躍遷,它們的躍遷概率也是不相同的。躍遷的情況如圖3所示,躍遷時吸收能量的大小順序為:n→π*<π→π*

圖3 能級圖Fig.3 Energy level diagram

2.3 VC結構與熒光的分析

VC的結構式如圖所示,可以看出維生素C是由一個五元環構成封閉的大的平面共軛體系結構,含有多個手性C原子,且平面結構可以增大分子的吸光截面,增大摩爾吸光系數,增強熒光強度,所以有利于熒光的產生[12]。同時VC具有給電子取代基-OH,由于-OH 上的n電子云幾乎與雙烯醇的π電子軌道平行,因此它們共享了共軛π電子軌道,形成了p-π共軛,擴大了共軛體系,增強了VC的熒光特性[13]。VC的結構由于-OH中的n電子吸收激發光光子,結構容易發生n→σ*躍遷,其吸收峰值位置在近紫外區。熒光峰值在395 nm 處經理論分析表明該熒光是由基團C-OH 中的孤對電子產生的。VC中的二烯醇具有很強的還原性,容易發生n→σ*峰躍遷和π→π*的躍遷,再考慮到分子中的共軛結構以及助色團,使得VC溶液的吸收峰出現紅移現象。

圖4 VC結構圖Fig.4 Structure of vitamin C

2.4 溶質與溶劑之間的關系

為了探究溶質與溶劑之間的關系,分別在同一激發波長下同時激發獲得VC溶液和蒸餾水的熒光光譜。從圖1、圖2可以看出,隨著激發波長的增加發射波長的熒光先增加后減小。VC水溶液的熒光在310 nm激發波長下出現最大熒光峰。溶液中分子的團簇現象使得物質的結構更加復雜,因此推測VC分子和水分子混合發生團簇形成新的結構類型。由于VC中富含-OH結構,O原子與H原子共用一對電子,所以使得VC分子結構容易吸引水分子與其形成團簇分子結構,并且水中的分子會形成H鍵,H鍵與VC分子之間作用,從而增大了VC的平面鋼性結構提高了VC水溶液的熒光量子效率。當水溶液的濃度較低時,H鍵結構占主導結構,且共軛體系中π電子共軛度越大熒光強度越大,同時也伴隨著熒光峰紅移。如圖5為310 nm激勵波長下的蒸餾水的和VC的熒光光譜圖,水的熒光峰位置為370 nm,在VC中-OH電子的躍遷在395 nm處,分子團簇作用和水分子的H鍵的共同作用下,使得VC水溶液在400 nm處有最大吸收峰[14]。

圖5 激發波長310 nm下VC水溶液與蒸餾水的熒光發射圖Fig.5 Fluorescence spectra of vitamin c solution and distilled water were measured with the excitation wavelength at 310 nm注:1為VC水溶液,2為蒸餾水。

2.5 VC溶液熒光光譜的二階導數

VC水溶液在310 nm激發波長下熒光強度最強,經過光譜理論分析,將最佳激發波長得到的熒光發射光譜求二階導數。二階導數函數中的極值點、拐點波長處可能與VC不同熒光團發射的熒光相對應[15]。本文采用在Origin 7.5軟件對熒光發射光譜求二階導數,熒光的二階導數圖如圖6所示。

圖6 VC溶液的二階導數熒光光譜Fig.6 Second order derivation of fluorescence spectra of vitamin c

VC溶液的二階導數熒光光譜存在四個極小值點,分別為345、355、372、425 nm,三個零點分別對應原光譜的拐點,分別為328、395、525 nm,因此這7個波段可能對應與7種不同的熒光團。雖然從圖5可以看出,VC溶液只有一個明顯的熒光峰,但這個熒光峰可能是這7個波段所對應的熒光團的共同作用相互影響的結果。由于熒光物質具有加和性,345、372 nm處是水的熒光峰。物質中的C=C、C=O等結構上的π電子吸收光子產生π→π*的躍遷,通常單獨的雙鍵結構如乙烯,其π→π*的躍遷發射光譜在170～200 nm,然而VC具有大的共軛結構,使得π→π*的躍遷的波長都發生了紅移。萘環的π電子發生π→π*躍遷的熒光峰為530、687、635 nm[16],所以推測425、525 nm的波長處是由于VC中的雙鍵上的躍遷引起的。由于不同的熒光團對熒光發射光譜的作用程度各不相同,在生成熒光的過程中,各個熒光團相互疊加且彼此制約,最終使得VC溶液的熒光發射光譜中只出現了一個明顯的熒光峰。

3 結論

系統研究了VC的熒光光譜,分別采集了280～350 nm的激發波長下的熒光發射光譜,VC溶液的最大熒光峰位于EX310 nm/EM400 nm。為了研究水對VC溶液熒光的影響,同時采集了蒸餾水的熒光發射光譜。蒸餾水的最大熒光峰位于EX295 nm/EM370 nm。對VC溶液的熒光光譜求二階導數,發現熒光光譜有4個極值點和3個拐點,分別為328、345、355、372、395、425、525 nm。通過對熒光光譜的理論分析,認為395 nm是由-OH發生的n→σ*的電子躍遷引起的、二烯醇結構發生π→π*電子躍遷的熒光位于425、525 nm。由于不同的熒光團對熒光發射光譜的作用程度各不相同,VC結構中n→σ*躍遷和π→π*的躍遷在分子團簇作用和水分子的H鍵的共同作用下,使得VC水溶液在400 nm處有最大熒光峰。

[1]崔乃杰,崔乃強,傅強,等.維生素C抗氧化促氧化雙向作用的研究[J].中國中西醫結合外科雜志,2004,10(6):419-421.

[2]Ahmet Unlu,Onder Kirca,Mustafa Ozdogan. High-dose vitamin C and cancer[J].Journal of Oncological Science,2016(1):10-12.

[3]R K Chaganti,Tolstykh M K Javaid. High plasma levels of vitamin C and vitamin E are associated with incident radiographic knee osteoarthritis[J].Osteoathritis and Cartilage,2014(22):

190-196.

[4]陸基宗.過量使用維生素C的危害[J].東方食療與保健,2007(11):22-23.

[5]謝志方.氫氧化鈉兩點電位滴定法測定維生素C含量[J]. 廣州化工,2011(15):125-127.

[6]李天華,施國英,魏珉,等.番茄維生素C含量近紅外預測光譜的小波去噪[J].農業機械學報,2013(44):200-204.

[7]朱娜.高效液相色譜法測定維生素C含量[J].實驗室研究與探索,2013,32(10):315-328.

[8]傅維,楊彩霞.熒光分光光度法測定幾種天津市售水果中維生素的含量[J].安徽農業科學,2011,39(23):14392-14393.

[9]龔時瓊,趙麗華,陳芳.熒光法快速檢測水果和蔬菜中的抗壞血酸[J].實驗室研究與探索,2012,31(10):19-32.

[10]王歡博,張玉鈞,肖雪.等.三種酚類化合物的三維熒光光譜特性研究[J].光譜學與光譜分析,2010,30(5):1271-1274.

[11]何迪潔.芳香族化合物的斯托克斯位移[J].發光與顯示,1983(3):25-26.

[12]張春艷. 基于固體粉末態物質的熒光光譜實驗及其機制研究[D].天津:南開大學,2010.

[13]王芳芳. 有機π-電子共軛材料的線性與非線性光學性質研究[D].開封:河南大學,2007.

[14]蘭秀風,劉瑩,高淑梅,等.乙醇溶液的熒光光譜及其特性的研究[J].激光技術,2003(5):477-479.

[15]金海龍,嚴冰,王玉田.基于導數熒光光譜的活體海藻識別方法研究[J].燕山大學學報,2005(6):493-496.

[16]史愛敏,朱拓,顧恩東,等.胭脂紅熒光光譜機理研究[J]. 光譜學與光譜分析,2009(1):193-195.

Study on fluorescence spectra mechanism of vitamin C

CHEN Ya-bin,HE Jian-guo*,MA Tian-lan,DING Jia-xing,WU Long-guo, HE Xiao-guang,WANG Song-lei,LIU Gui-shan

(Ningxia University School of Agriculture,Yinchuan 750021,China)

Taken standard vitamin C for research objects,fluorescence emission spectra were measured with fluorescence spectrophotometer and the excitation wavelength were 280～350 nm. The results showed that the fluorescence excitation and emission wavelengths of the vitamin C solution were 310 nm and 400 nm. The second order derivation of fluorescence spectrum had four extreme points and three inflection points which were 328,345,355,372,395,425,525 nm.Based on the theory analysis,we come to the conclusion that the fluorescence peak at 395 nm was formed by-OH n→σ*-electron jumps. The dienes alcohols structure emitted a π→π*-electron jumps of maximum peak that were a little red shift at 425 nm and 525 nm. The reason was strong affected by conjugated system. Each of molecule fluorescent group were restricted and superimposed. The molecular clusters and H bond of water molecule made maximum fluorescence peak of vitamin C solution at 400 nm.

vitamin C;fluorescence spectrum;fluorescence peak

2016-05-27

陳亞斌(1990-)，男，碩士研究生，研究方向：農產品無損檢測，E-mail：shenyang12536@126.com。

*通訊作者:何建國(1960-)，男，教授，研究方向：農業工程裝備及機電一體化技術、農產品無損檢測，E-mail：hejg@nxu.edu.cn。

國家自然科學基金項目(31560481)。

TS201

A

1002-0306(2016)22-0112-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.22.014