基于氣相色譜質譜聯用的乳酸菌輔助發酵過程中腐乳組分變化的分析

楊 芹,陳曉華,2,*,張 灝,陳 衛,陳永泉

(1.江南大學食品學院,江蘇無錫 214122;2.衡陽師范學院生命科學與環境學院,湖南衡陽 421008)

?

基于氣相色譜質譜聯用的乳酸菌輔助發酵過程中腐乳組分變化的分析

楊 芹1,陳曉華1,2,*,張 灝1,陳 衛1,陳永泉1

(1.江南大學食品學院,江蘇無錫 214122;2.衡陽師范學院生命科學與環境學院,湖南衡陽 421008)

采用代謝組學的思路,利用GC/MS聯用方法分析了腐乳在常規毛霉菌發酵以及鼠李糖乳桿菌GG株(LactobacillusrhamnosusGG strain,LGG)輔助發酵過程下其化合物的變化。分離鑒定85個化合物,涉及到氨基酸,有機酸和糖類等物質,其中33個化合物的定性結果得到了標樣驗證。通過對發酵過程中化合物種類及其濃度變化的分析發現在添加乳酸菌LGG輔助發酵的腐乳中,丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸等甜味氨基酸和天冬氨酸等鮮、酸味氨基酸的含量顯著高于常規毛霉菌發酵的腐乳,這為在實際的腐乳生產及工藝流程優化時考慮加入乳酸菌來改善腐乳成品的口味提供了物質依據。但實驗中同時也發現,LGG輔助發酵條件不會促進腐乳后期發酵速度的加快。基于上述結論,在腐乳的發酵過程中,可以通過添加乳酸菌來進行輔助發酵,以此調控、優化腐乳發酵的生化過程。同時該工作亦表明代謝組學的研究思路可以用于優化腐乳發酵過程工藝設計,也適用于類似的傳統發酵食品發酵過程的監控。

氣相色譜-質譜聯用,乳酸菌,腐乳發酵,代謝組學,氨基酸

腐乳為常規發酵食品,它是以大豆為原料,在毛霉菌等微生物的作用下進行發酵而成,在我國食用豆腐乳已有上千年的歷史。腐乳的發酵過程可以分為前期發酵與后期發酵兩個階段。在腐乳的發酵過程中豆腐坯中的蛋白質在微生物的作用下會分解為游離氨基酸以及一些風味物質;淀粉等在這個過程中轉化為酒精與有機酸。同時腐乳發酵過程中產生的小分子還會與輔料中的香料、酒等相互作用,生成酯類等具有特殊風味的腐乳成品[1]。

腐乳的發酵過程實際上是一個多酶系協同作用下的一個復雜的生物化學過程,其發酵過程的變化及終點時的營養組成與參與腐乳發酵的微生物的種類息息相關[2]。目前用于腐乳生產及使用在腐乳發酵前期的微生物主要是毛霉屬、根霉屬、細菌中芽孢桿菌屬和微球菌屬等,以霉菌為主[3]?？紤]到毛霉耐溫范圍窄、根霉菌絲稀疏以及其蛋白酶和肽酶活性低而細菌中芽孢菌的含量較少等原因,有必要開發具有很好抗雜菌能力和優良發酵性能的菌種,擴展用以腐乳生產的菌種類型。另一方面,亦可以通過在后發酵開始時添加合適的微生物來達到縮短腐乳的發酵周期、改善其口味、品質等目的。此類微生物的篩選可以通過追蹤腐乳生產過程中酶活力及化學組分的變化,考察實際生產中微生物對腐乳發酵成熟、縮短生產周期和提高腐乳品質等因素的影響來實現。周熒等[4]分析了腐乳發酵過程中化學組分含量和質構參數的變化,發現低鹽含量下腐乳游離氨基酸和游離脂肪酸的含量較高,且腐乳成熟時間較短。Serrazanetti等[5]將乳酸菌(Lactobacilluscasei和Lactobacillusacidophilus)應用于豆腐發酵,并分析了發酵后豆腐中的抗菌化合物。他們發現L.casei和L.acidophilus的聯合使用可以延長豆腐的貨架期,而且發酵過程中產生的化合物及其感官特性與使用的發酵菌株息息相關。他們還指出,乳酸菌用做發酵菌株可以抑制豆腐中多不飽和脂肪酸的過氧化,降低其中醇類化合物的氧化。

本文采用氣相色譜質譜聯用(GC/MS)技術分析腐乳在不同發酵條件下不同時間點的小分子變化,討論鼠李糖乳桿菌GG株(LactobacillusrhamnosusGG strain,LGG,ATCC53103)輔助發酵條件對發酵過程的影響,為腐乳品質的改善及工藝的改進提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

正己烷與甲醇 購于天地公司(色譜純,Tedia Company Inc.,USA);鹽酸甲氧胺和無水吡啶 購自百靈威公司(J&K Chemical Ltd.,China);硅烷化試劑N-甲基-N-三甲基硅三氟乙酰胺(MSTFA) 購于西格瑪公司(Sigma-Aldrich Co.,USA);十五碳酸甲酯(FAME C15∶0) 購于Nu-Chek公司(Nu-Chek Prep,Inc.,USA);實驗用水 由Milli-Q8超純水發生器(Millipore Co.,USA)制備;豆腐白坯 購于當地超市;鼠李糖乳桿菌GG株(LactobacillusrhamnosusGG strain,LGG,ATCC53103) 購于中國普通微生物菌種管理中心，保存在江南大學食品生物技術中心菌種保藏中心。

Trace1310-TSQ 8000 Evo氣相色譜質譜聯用儀 美國賽默飛公司;Rtx-5 MS毛細管色譜柱(0.25 mm×30 m,0.25 μm) 美國Restek公司;Milli-Q8超純水發生器 美國密理博公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 實驗室使用的豆腐乳樣本,由豆腐白坯開始,將豆腐坯側面放入蒸籠,行間留約1 cm左右空間,以通氣散熱,促進毛霉菌生長。采用自然接種法接種毛霉菌,溫度控制在20～24 ℃,接種22 h開始第一次翻格,以調節上下溫差和補充空氣;培養到28 h進行第二次翻格,36 h時菌絲生長成熟。45 h時毛霉呈現淺黃色,此時通風降溫,搭蒸籠涼花,促進毛霉散熱和水分散發。毛霉涼透之后,將相互依連的毛霉菌絲分開,搓毛,使其包住豆腐坯。同時,在拌料盆內依次加入食鹽、辣椒粉、五香粉用勺拌勻,將搓毛后的豆腐坯裹滿配料依次排列、壓平置消毒好的瓶子,分層加料。其中LGG輔助發酵組在拌料時將LGG菌加入配料。豆腐坯裝瓶后灌入茶油,茶油淹過坯面2 cm。此時要注意茶油不宜過滿以防止發酵時涌出瓶外,之后加蓋封嚴進行后發酵。腐乳的后發酵在貯藏過程中完成,在常溫條件下,一般經過1～3個月左右腐乳可發酵成熟。

將保存在-80 ℃的LGG接入液體MRS培養基,37 ℃培養18 h,活化三代。LGG培養液離心,菌體用PBS清洗2次,調濃度為109cfu/mL,以5%(v/g)的含量采用噴灑方式攪拌到配料中,大概配料中含有5×107CFU/g LGG。

1.2.2 樣品處理 腐乳凍干研磨成粉,稱取5 mg,加入0.5 mL正己烷,超聲1 min,置振蕩器上(轉速:60 r/min)振蕩30 min后,3600 r/min離心10 min傾去上清。殘渣再加入0.5 mL正己烷,按上述條件超聲,振蕩,離心,再次棄去上清,留殘渣。所得殘渣加入0.5 mL 80%甲醇水溶液,超聲1 min,置振蕩器上(轉速:60 r/min)振蕩30 min后,3600 r/min離心10 min,取上清,冷凍離心機凍干,即為樣品中的極性組分。

樣品極性組分溶于40 μL 20 mg/mL的鹽酸羥甲胺吡啶溶液,37 ℃水浴加熱肟化90 min,然后加入40 μL MSTFA在37 ℃下硅烷化60 min。反應完畢,添加40 μL FAME(C15∶0,1 mg/mL)作為內標,渦旋,13000 r/min離心15 min,取上清進樣分析。

另取各腐乳凍干粉5 mg混勻,稱取混勻樣5 mg共6份,按上述方法提取,作為質控(quality control,QC)樣品,監控處理方法的重復性及分析過程中儀器的穩定性。

1.2.3 樣品分析條件 衍生后樣品在Trace1310氣相色譜儀上分析,進樣口溫度為240 ℃,載氣為高純氦氣,采用恒流模式,流速為1.5 mL/min;進樣體積為1 μL,分流比10∶1。色譜柱為Rtx-5MS,柱溫箱的初始溫度為70 ℃,5 ℃/min升至230 ℃后以90 ℃/min升溫至320 ℃,保持5 min。

TSQ 8000 Evo質譜儀配備EI源,采集數據:離子源及接口溫度分別為250和280 ℃,掃描方式為全掃,質量數范圍為33～600。

1.3 數據處理

通過與NIST庫,Fiehn的數據庫以及標樣驗證等方法對腐乳發酵GC/MS分析譜中的化合物。通過TraceFinder軟件提取定性的化合物,采用各自樣品(腐乳干粉)的重量以及內標(C15∶0 FAME)進行歸一化校正。所得數據矩陣導入SIMCA P,進行多變量統計分析,尋找腐乳在發酵過程中以及在不同的微生物環境下變化顯著的化合物。

此外,數據采用SPSS進行t檢驗,認為p<0.05的變量在兩組間有顯著性差異。

2 結果與討論

2.1 基于GC/MS的代謝組學分析

本文采用常規提取極性小分子使用的溶劑80% MeOH[6]來最大化的獲得樣品中的化合物信息。鑒于在腐乳制備過程中為了提升其風味及營養添加了茶油,在進行極性化合物提取前,我們使用正己烷溶劑對腐乳干粉進行了脫脂處理。在比較了采用80% MeOH 兩次重復提取與單次提取的GC/MS分析結果后,基于二者差異僅限于化合物的濃度,對所得化合物的種類并無影響的事實,為提高樣品分析的通量,我們選取了單次提取樣品的方法。

表1 腐乳提取物的GC/MS分析結果所鑒定的化合物列表

本工作采用GC/MS分析了腐乳在常規發酵及添加乳酸菌LGG后發酵過程中的化合物變化。QC樣品的GC/MS總離子流色譜圖見圖1。圖2顯示的是采用QC樣品來評價方法重復性的結果:在所有的特征化合物中,RSD<15%的化合物占總化合物的73.8%,RSD<30%的化合物占總化合物的84.5%。表明了該分析方法重復性良好,所得數據可以用來反應、表征腐乳發酵過程中化合物的變化。

圖1 GC/MS分析乳腐的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of GC/MS based metabolic profiling of sufu extracts

圖2 質控樣品中不同化合物的相對標準偏差(RSD,%)分布Fig.2 RSD(%)of metabolites in quality control samples注:柱狀圖:目標化合物占總化合物的個數百分比,折線圖:目標化合物占總化合物的累計個數百分比。

使用上述表征的方法采集腐乳在常規發酵(Control)和添加乳酸菌LGG輔助發酵(LGG)0、1、2、3、4、5、6周的數據。首先將腐乳的提取物進行肟化反應,降低還原糖的色譜圖的復雜性[7],同時亦減小隨后定性工作的難度,隨后進行硅烷化衍生,用于GC/MS分析。所得結果通過與文獻對比以及NIST/Fiehn數據庫檢索,鑒定得到85個化合物,其中33個化合物的定性結果得到了標樣驗證,所得的化合物涉及到20余種氨基酸,10余種有機酸和多種糖及糖醇、糖酸類物質,鑒定結果見表1。

續表

續表

注：*定性結果已經標樣驗證。此前,Ma等[8]采用HPLC-UV方法分析了臭腐乳(grey sufu)在發酵過程中的化合物變化,檢測到15種游離氨基酸和乳酸、丁酸、琥珀酸等揮發性有機酸酸。Han[9]等分析了固態發酵的腐乳,檢測到18種游離氨基酸。相對于文獻報道,我們當前的方法檢測到了較豐富的化合物種類,為從腐乳化學組成的角度表征腐乳發酵的過程與特征提供了充分依據。此外,本實驗中還檢測到一個黃酮類化合物,經與數據庫對照,為染料木素(Genistein)。

2.2 腐乳發酵過程中化學組分的變化

常規用于腐乳發酵的微生物主要為毛霉屬、根霉屬、細菌中的芽孢桿菌屬和微球菌屬菌株,較少使用其它菌類。然而,魯緋等[10]報道從青方腐乳中分離得到了三株對腐乳風味有促進作用的植物乳桿菌。Serrazanetti等[5]比較了兩株乳酸菌Lactobacilluscasei和Lactobacillusacidophilus共同以及單獨作用于豆腐生產及腐乳發酵的結果,發現,乳酸菌的加入可以降低豆腐發酵過程中多不飽和脂肪酸的過氧化和醛類化合物的還原。同時考慮到乳酸菌在食品方面利用的各種優勢,在本實驗中我們選擇在常規腐乳發酵方法的基礎上添加LGG來進行輔助發酵,考查添加乳酸菌后腐乳發酵小分子的變化以及對發酵整個過程進程的影響。

圖3 不同發酵條件(常規毛霉菌發酵(對照組)和鼠李糖乳桿菌GG株輔助發酵(LGG組))的腐乳的主成分分析得分圖(A)和PLS-DA得分圖(B)Fig.3 PCA(A)and PLS-DA(B)score plots of sufu fermented by Mucor only(Control) and Mucor-Lactobacillus rhamnosus GG strain(LGG)

首先采用主成分分析(PCA)不同的發酵過程中小分子的變化趨勢。在PCA得分圖(圖3 A)上,可以看到添加乳酸菌LGG后,發酵過程中的腐乳的小分子組分發生了明顯變化:在第一和第二個主成分對角線方向上,常規發酵(Control)及添加乳酸菌LGG輔助發酵(LGG)樣品呈現出由于發酵條件不同而帶來的差異性,第二個主成分則更多地反映了發酵時間對腐乳發酵過程的影響。

為了進一步比較添加LGG進行輔助發酵后對腐乳發酵過程的影響,以前期數據分析所得到的87個化合物為變量,對常規發酵條件下的21個腐乳樣本與LGG輔助發酵下的21個樣本進行偏最小二乘判別分析(PLS-DA)分析,以尋找在兩種發酵條件下變化較大的物質,進一步評價乳酸菌LGG輔助發酵的效果。其得分圖如圖3(B)所示,可以看到在第一個主成分上,兩類樣品按發酵條件的不同,常規發酵的腐乳與乳酸菌LGG輔助發酵的樣品得到了完全分離。該模型的參數R2Y=0.90,說明了所建模型可以很好地解釋建模數據,同時參數Q2=0.86,則表明該模型具有良好的對未知數據的預測能力。鑒于PLS-DA為有師監督的模式識別方法,為了確保所得模型的可靠性,對該模型進行交叉驗證,數據交互計算(permutation)999次,其R2和Q2的截距分別為0.347和-0.271,說明模型沒有過擬合,所得的PLS-DA的分析結果是可靠的。

表2 腐乳不同發酵條件下的差異性化合物

選取PLS-DA分析結果中VIP(variable importance in projection)值大于1的所有變量,發現在腐乳的發酵過程中,變化比較大的化合物主要涉及氨基酸,小分子酸和部分糖類(表2)。在LGG組呈上升趨勢的化合物以氨基酸為主,主要包括丙氨酸(1.40),甘氨酸(2.62),絲氨酸(1.67),蘇氨酸(1.47),高絲氨酸(1.78),天冬氨酸(1.85),鳥氨酸(1.44)和天冬酰胺(2.43)。小分子酸為乳酸(1.31)和甘油酸(1.77)(括號內數字為LGG輔助發酵組樣本相對對照組的變化倍數,詳見表2)。乳酸菌用于發酵腐乳的一個最大顧慮是其產乳酸的能力較強,可能在腐乳成品中引入較重的酸味。然而實驗結果表明,LGG組與Control組的乳酸含量雖然存在顯著性差異(p<0.01),但其絕對量的變化相對較小,而且相對于氨基酸在乳酸菌發酵下含量的提高,大部分有機酸小分子則呈現下降趨勢(表2),該結果可以部分地緩解我們對在腐乳發酵過程中引入乳酸菌后可能帶來的產品酸度升高的顧慮。油酸(0.75),11-反-十八烯酸(0.81)和單油酸甘油酯(0.63)是在腐乳進行脫脂后得到的三個長鏈脂肪酸相關的化合物,其含量在LGG輔助發酵組呈現下降趨勢,根據余若黔等[11]在解釋腐乳中游離脂肪酸變化時將脂肪酸的含量與催化其與乙醇進行酯化反應的脂肪酶的活性相聯系,本實驗中可能是由于乳酸菌LGG輔助發酵與常規發酵條件下對脂肪酶的活性影響不一致,乳酸菌環境導致了酶活的增強或是隨發酵的進行保持酶活力仍能保持而引起的。

縱觀上述所有化合物的變化,其倍數主要處在0.5～2.5倍左右,主要為氨基酸且含量升高的氨基酸中大部分是具有增加甜味、鮮味或酸味的功能,這表明加入乳酸菌可以改善腐乳的發酵過程。

2.3 發酵過程氨基酸的變化

對于大豆產品來說,一旦發酵過程開始,主要的一個變化即為蛋白質的解離[12]。GC/MS的分析結果也表明在腐乳發酵過程中,添加乳酸菌后變化較大的化合物主要是氨基酸。因此,腐乳在發酵過程中的游離氨基酸,可以看作是監測腐乳發酵工藝、流程的一個重要指標。Dajanta等[12]分析了大豆發酵前后游離氨基酸的變化,發現發酵過程大大增加了Thua nao中游離氨基酸的含量。本工作中同樣檢測到大量氨基酸,由表1可知腐乳提取物發現了除了組氨酸、賴氨酸和精氨酸之外的其它17種蛋白質氨基酸以及多種必需氨基酸,這說明,腐乳可以提供相對豐富的氨基酸種類,與其它豆制品一樣也是優質的食物蛋白質來源[9]。同時,部分呈味氨基酸的存在也為腐乳提供了豐富的口感。

圖4 差異性氨基酸(p<0.05)在兩種發酵過程中含量的變化Fig.4 Changes of differential amino acids(p<0.05)along the fermentation

此外,在比較LGG輔助發酵及常規毛霉菌發酵條件下的氨基酸變化情況時亦發現:大多數的氨基酸在乳酸菌LGG輔助發酵條件下的含量比單純毛霉菌發酵條件下的含量高。這說明乳酸菌LGG的加入可以顯著促進腐乳的發酵程度。圖4所示為部分在兩組之間存在顯著差異(p<0.05)的氨基酸及其在整個發酵過程中含量的變化情況。這些氨基酸有多種為呈味氨基酸,這是氨基酸在食品中的另一重要作用[8,13]。天然蛋白質中的氨基酸都屬于L型,大多具有甜味或是苦味,有少數具有鮮味或是酸味[8]。本實驗對腐乳發酵過程中氨基酸化合物的分析結果表明,添加乳酸菌LGG輔助發酵的腐乳中丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸等甜味氨基酸和天冬氨酸等鮮、酸味氨基酸的含量顯著高于常規毛霉菌發酵的腐乳。這為在實際的腐乳生產及工藝流程優化時考慮加入乳酸菌來改善腐乳成品的口味提供了物質依據。

然而另一方面,由圖4我們可以發現雖然隨著發酵時間的延長,腐乳中的氨基酸含量呈上升趨勢,但對比各氨基酸在發酵過程中含量的變化情況,則發現兩種不同發酵條件下腐乳中氨基酸含量達到最高值的時間點基本是一致的。若以腐乳中大部分氨基酸的含量達最高值為后發酵階段基本完成的標志[4],本實驗結果表明乳酸菌LGG的加入對促進腐乳后發酵過程的速度并無明顯優勢。

3 結論

基于GC/MS技術采集了不同發酵條件下腐乳在發酵過程中的化合物信息,利用代謝組學的思路考察了發酵過程中化合物的變化并在此基礎上評估了乳酸菌輔助發酵對腐乳發酵的影響。添加乳酸菌后,雖然其乳酸的含量相對常規發酵過程會升高,但就其物質的絕對量來看,乳酸菌的添加不會導致腐乳最終口味的酸化。實驗結果表明,乳酸菌輔助發酵條件下,一些具有甜味的氨基酸如丙氨酸、甘氨酸等以及呈現鮮味的天冬氨酸等含量升高,此類化合物作為形成食物風味的物質基礎,也說明鼠李糖乳桿菌GG株的添加能夠提升腐乳的口味。

[1]王越鵬,李立英,王建明. 腐乳生產過程中風味物質的變化分析[J]. 食品與發酵科技,2012,48(2):76-81.

[2]吳擁軍,龍菊,程昌澤,等. 腐乳發酵過程中酶活力和化學組分變化研究[J]. 食品科學,2009,30(3):249-253.

[3]蔣芳芳. 腐乳發酵過程中各成分變化的研究[D]. 長沙:湖南農業大學,2012.

[4]周熒,潘思軼. 腐乳發酵過程中化學組分與質構的變化[J]. 食品科學,2011,32(1):70-73.

[5]Serrazanetti D I,Ndagijimana M,Miserocchi C,et al. Fermented tofu:Enhancement of keeping quality and sensorial properties[J]. Food Control,2013,34(2):336-346.

[6]Yuan M,Breitkopf S B,Yang X,et al. A positive/negative ion-switching,targeted mass spectrometry-based metabolomics platform for bodily fluids,cells,and fresh and fixed tissue[J]. Nat. Protocols,2012,7(5):872-881.

[7]Asres D D,Perreault H. Monosaccharide permethylation products for gas chromatography-mass spectrometry:how reaction conditions can influence isomeric ratios[J]. Canadian Journal of Chemistry,1997,75(10):1385-1392.

[8]He X,Liu J,Cheng L-l,et al,Quality Properties of Crispy Winter jujube Dried by Explosion Puffing Drying[J]. International Journal of Food Engineering,2013:99.

[9]Han B-Z,Rombouts F M,Nout M J R. Amino acid profiles of sufu,a Chinese fermented soybean food[J]. Journal of Food Composition and Analysis,2004,17(6):689-698.

[10]魯緋,腐乳發酵機理、品質改進和模式識別研究[D]. 北京:中國農業大學,2005.

[11]余若黔,涂煜,李杰偉,等. 腐乳生產后期發酵的化學變化[J]. 華南理工大學學報:自然科學版,2001,29(5):64-67.

[12]Dajanta K,Apichartsrangkoon A,Chukeatirote E,et al. Free-amino acid profiles of thua nao,a Thai fermented soybean[J]. Food Chemistry,2011,125(2):342-347.

[13]Fernstrom J D,Munger S D,Sclafani A,et al. Mechanisms for Sweetness[J]. The Journal of Nutrition,2012,142(6):1134S-1141S.

A gas chromatography/mass spectrometry based metabolomics study of the fermentation of sufu

YANG Qin1,CHEN Xiao-hua1,2,*,ZHANG Hao1,CHEN Wei1,CHEN Yong-quan1

(1.School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China; 2.College of Life Science and Environment,Hengyang Normal University,Hengyang 421008,China)

Metabolonic study of sufu fermented byMucorand Mucor-LactobacillusrhamnosusGG strain(LGG)was conducted,using gas chromatography/mass spectrometry(GC/MS)to acquire the changes of the chemical components of sufu during the fermentation. 85 compounds including amino acids,organic acids and sugars were identified and 33 of them were validated by authentic standards. The analysis revealed that sufu fermented with the assistance of LGG could produce higher content of amino acids such as alanine,glycine,serine,threonine and aspartate,thus enhance its taste of sweetness or palatable. Though profiles of compounds at different time under different fermentation indicated that the addition of lactobacillus could not accelerate fermentation of sufu,this work indicated that lactobacillus could be use to improve and optimize the fermentation of sufu. Besides,the study has demonstrated that metabolomic strategies could apply to optimize the fermentation process of sufu,as well as other traditional fermented foods.

gas chromatography/mass spectrometry; lactic acid bacteria; fermentation of sufu; metabolomics; amino acid

2016-06-17

楊芹(1981- )，女，博士，講師，研究方向：食品分析,E-mail:qyang@jiangnan.edu.cn。

*通訊作者:陳曉華(1981-)，女，講師，主要從事食品微生物和功能食品開發方面的研究，E-mail:chxh0217@163.com。

湖南省自然科學基金項目(2015JJ6012)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)22-0178-08

10.13386/j.issn1002-0306.2016.22.027