羅伊氏乳桿菌發酵液中具有降膽固醇能力蛋白的分離、純化和鑒定

陳 臣,于瑞莉

(1.上海應用技術大學,香料香精技術與工程學院,上海 201418; 2.江南大學,食品科學與技術國家重點實驗室,江蘇無錫 214122)

?

羅伊氏乳桿菌發酵液中具有降膽固醇能力蛋白的分離、純化和鑒定

陳 臣1,*,于瑞莉2

(1.上海應用技術大學,香料香精技術與工程學院,上海 201418; 2.江南大學,食品科學與技術國家重點實驗室,江蘇無錫 214122)

羅伊氏乳桿菌DSM122460無細胞上清發酵液(cell-free supernatant,CFS)具有較高的膽固醇移除能力,經初步鑒定有效成分為蛋白質。通過超濾濃縮、硫酸銨分級沉淀、DEAE Sepharose F.F陰離子交換層析進一步對該活性成分進行分離純化。純化后,其比活力達到61.6 U/mg,純化倍數為32.4。經SDS-PAGE檢測,樣品達到電泳級純,分子量約為60 ku。通過質譜鑒定初步認定該活性蛋白為一假設蛋白,其功能尚待進一步研究。

羅伊氏乳桿菌,無細胞上清發酵液,移除膽固醇,純化,假設蛋白

膽固醇又稱膽甾醇,是動物組織細胞所不可缺少的重要物質,它不僅參與形成細胞膜,而且是合成膽汁酸、維生素D和甾體激素的原料,是人體內重要的營養成分[1]。膽固醇分為高密度膽固醇和低密度膽固醇兩種,前者對心血管有保護作用,后者偏高,能對動脈造成損害。隨著人們生活水平的逐漸提高,低密度膽固醇攝入量普遍偏高。血清中低密度膽固醇含量偏高,容易導致動脈粥樣硬化、冠心病、腦中風、高血壓等心腦血管疾病,嚴重威脅人類健康。研究表明,血清中低密度膽固醇減少1%就可以使冠心病的危險降低2%～3%[2],因此,降低血清和食物中低密度膽固醇含量是當前科學研究熱點之一。

早在1974年,Mann等研究者就發現大量飲用酸乳等發酵乳制品的非洲Masai人血清膽固醇保持在非常低的水平[3],之后的很多研究都表明乳酸菌具有降低血清總膽固醇及低密度膽固醇的功能[4]。然而益生菌降解血清膽固醇的確切機理目前仍不明確。Gilliland等[5]認為在厭氧的條件下,乳酸菌在含有膽鹽的高膽固醇培養基中生長時,菌體細胞可以吸收介質中的膽固醇,降低介質中的膽固醇含量。Klaver[6]和Corzo[7]研究表明乳酸菌從培養基中去除膽固醇是因其分泌膽鹽水解酶促進甘氨酸鈉和牛磺酸鈉水解,細菌在動物或人體內通過水解結合型膽鹽轉變為游離膽酸,進而與膽固醇發生共沉淀作用。隨著研究的開展,目前人們越來越傾向于認為,細菌降低膽固醇的作用是由于菌體吸收和膽固醇共沉淀協同作用的觀點,而且不同條件下細菌會表現出以某種方式(吸收或共沉淀)為主的能力[8]。此外,研究還發現乳酸菌發酵生成的不可消化短鏈脂肪酸、胞外多糖、蛋白質等均參與對膽固醇的分解和去除作用[9-10]。上述研究結果充分說明乳酸菌的降膽固醇機制是復雜的,或許還有其它的作用方式存在。

羅伊氏乳桿菌普遍存在于人類和大部分動物的腸道中,是目前已報道的具有降膽固醇能力的乳酸菌之一。研究發現羅伊氏乳桿菌DSM122460在無細胞參與的情況下仍表現出膽固醇移除能力,其無細胞上清發酵液(Cell free supernatant,CFS)的膽固醇移除率可達到69%。通過比較對照組和處理組的膽鹽水解酶活性和移除膽固醇能力得出CFS中含有除膽鹽水解酶以外的可移除膽固醇的有效成分,經硫酸銨沉淀等方法初步鑒定為蛋白類物質[11]。本文對此有效成分進行了分離純化,并通過質譜進行初步鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅伊氏乳桿菌DSM122460 臺灣大學贈送;鄰苯二甲醛 Sigma公司;MRS培養基 德國Merck公司;DEAE Sepharose F.F Ameisham Biosciences 公司;膽固醇、硫酸銨、牛血清白蛋白、考馬斯亮藍G250等其他試劑 國藥集團化學試劑有限公司。

Avanti J30I高速冷凍離心機 美國Beckman Coulter公司;CE7250型紫外分光光度計 英國BIO-AQUARIUS公司;真空冷凍干燥機 美國LABCONCO公司;AKTK purifier層析儀 美國GE Healthcare公司;Mini-PROTEAN Tetra垂直電泳儀、Geldoc 2000凝膠成像系統 美國Bio-Rad公司;4800 MALDI-TOF/TOF串聯質譜儀 美國Applied Biosystems公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化 羅伊氏乳桿菌DSM122460使用前按1%的接種量接種到MRS肉湯,在37 ℃培養12 h,傳代兩次進行活化,實驗菌株在實驗過程中4 ℃冰箱保存。

1.2.2 粗蛋白液的制備 羅伊氏乳桿菌DSM122460菌液按1%接種于2 L MRS培養基中,37 ℃培養24 h,4 ℃,12000×g離心10 min收集上清液,經0.22 μm微濾膜過濾后用截留分子量為30000 ku的膜超濾濃縮至200 mL。

1.2.3 硫酸銨分級沉淀 取200 mL蛋白濃縮液在冰浴條件下緩慢加入研磨好的硫酸銨粉末,依次至30%、40%、50%、60%、70%、80%的飽和度,緩慢攪拌防止泡沫產生。每加完一次硫酸銨后,將上清液于4 ℃冰箱靜置3 h,然后離心(10000×g,4 ℃,25 min),收集上清和沉淀,吸取少量上清液測定蛋白質含量。剩余上清液繼續加入硫酸銨至下一設定飽和度,靜置,離心收集上清和沉淀,如此循環操作。考馬斯亮藍法測定上清液的蛋白含量,沉淀用約兩倍體積的磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L,pH7.0)溶解后,透析,測定膽固醇清除能力。

確定最佳飽和度后,在后續操作中,首先在冰水浴條件下向上清液中加入硫酸銨至飽和度范圍的下限,4 ℃冰箱靜置過夜,離心(10000×g,4 ℃,25 min),棄去沉淀,量取上清液體積;冰浴條件下向上清液中加入硫酸銨至飽和度上限,4 ℃冰箱靜置3 h,離心(10000×g,4 ℃,25 min),收集沉淀,棄去上清液,將沉淀復溶至約2倍體積的磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L,pH7.0)中,透析除鹽。透析后的蛋白樣品裝入凍干瓶中,經真空冷凍干燥后得到蛋白粉,磷酸鹽緩沖液溶解后進行下一步純化操作。

1.2.4 陰離子交換層析 將DEAE-Sepharose F.F離子交換瓊脂糖凝膠沿玻璃棒緩慢加入到型號XK16/20層析柱中,凝膠沉降過夜,確保膠面平整。連接AKTA purifier層析儀,使用Unicorn軟件調整流速為0.5 mL/min,最大柱壓為0.15 MPa,UV 280 nm進行檢測。先用經抽濾脫氣的超純水平衡兩個柱體積至儀器基線平直,再用經抽濾脫氣的緩沖液(pH7.0,25 mmol/L磷酸鹽緩沖液)平衡至儀器基線平直。上樣前,樣品需經過0.45 μm膜過濾,用注射器將樣品注入每次上樣量為3mL待樣品全部進入層析柱后,用緩沖液洗脫,流速0.5 mL/min,UV 280 nm檢測紫外吸收峰,待穿透峰洗脫結束后,以含0.5 mol/L NaCl的平衡緩沖液洗脫蛋白[12]。手動收集樣品,當UV 280 nm吸收開始明顯升高時開始進行收集,每管5 mL,待UV 280 nm吸收值降低至基線時停止收集。收集產物4 ℃透析除鹽后濃縮測定其膽固醇清除能力。

梯度洗脫時,起始緩沖液A為pH7.0,25 mmol/L的磷酸鹽緩沖液,洗脫緩沖液B為含1 mol/L NaCl的pH7.0、25 mmol/L的磷酸鹽緩沖液,60 min內洗脫8個柱體積后,兩種緩沖液按合適比例混合,可得到NaCl濃度在0～0.5 mol/L范圍的離子強度梯度。

1.2.5 SDS-PAGE電泳分析 采用不連續垂直板SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行蛋白的純度和分子量的分析,5%濃縮膠,12%分離膠,以低分子量標準蛋白為標準。模式為恒壓模式,電壓為110 V;電泳完后,用考馬斯亮藍染色液于室溫染色2 h,用脫色液脫色至蛋白條帶清晰。通過凝膠成像儀灰度掃描電泳膠板,分析蛋白分布與濃度。

1.2.6 目的蛋白的二級質譜鑒定 將含有目的蛋白的SDS-PAGE膠塊切成1 mm3左右的小塊,裝入離心管中,水洗一次。用脫色緩沖液浸泡15 min。反復三次,直至將顏色脫盡,蒸餾水洗滌1次,將膠塊浸入30 μL 100%乙腈中5 min,脫水使膠塊變白,然后室溫抽干加8 μL胰蛋白酶液(0.005 mg/mL),37 ℃放置16 h左右。將0.3 μL已酶解的樣品點到樣品板上,室溫晾干,上MALDI-TOF/TOF串聯質譜儀選用正離子反射模式進行一級質譜解析,選擇強度最大的10個峰進行二級質譜,將一級和二級質譜數據整合并使用GPS 3.6(Applied Biosystems)和Mascot 2.1(Matrix Science)對質譜數據進行分析和蛋白鑒定。

1.2.7 膽固醇清除能力的測定 為了防止CFS有效成分純化過程中膽鹽水解酶的干擾,在每一步純化后進行移除膽固醇能力測定時不再添加牛磺膽酸鈉。

取一定量的溶液或凍干粉溶于1 mL pH4.4的醋酸-醋酸鈉的緩沖液中,以相同體積的緩沖液作對照,分別加入制備好的卵磷脂-膽固醇膠束,混合均勻,37 ℃反應30 min,利用改良的鄰苯二甲醛法[14]測定對照組和樣品組膽固醇含量。以1 h內轉化1 μg膽固醇所需的物質含量定義為一個活力單位[13]。

式中:K,蛋白液稀釋倍數;W,轉化膽固醇的量(μg);V,蛋白液液的體積(mL);T,反應時間(h)。

1.2.8 蛋白質濃度的測定 采用考馬斯亮藍G250的方法,并計算比活力。

2 結果與討論

2.1 粗蛋白液的濃縮

在分別研究羅伊氏乳桿菌DSM122460的CFS和細胞裂解物移除膽固醇能力后,結果顯示羅伊氏乳桿菌DSM122460的CFS具有相當高的膽固醇移除能力,細胞裂解物基本無移除能力,表明參與移除膽固醇的物質主要位于CFS[11]。經蛋白濃度測定實驗,CFS中蛋白含量偏低,蛋白濃度只有40 μg/mL左右,不利于進一步蛋白的分離和純化。因此,CFS經超濾濃縮至十分之一體積的濃縮液作為粗蛋白液的來源。

2.2 硫酸銨濃度的確定

如圖1所示,隨著硫酸銨濃度的增加,發酵上清液中的蛋白濃度隨著硫酸銨加入量的增加而逐漸減少,硫酸銨飽和度為30%時上清液中蛋白濃度為31.2 μg/mL時,硫酸銨達到80%時上清液中蛋白濃度減低到10.8 μg/mL。不同飽和度沉淀得到的蛋白經過鹽析脫鹽后,測得其去除膽固醇的能力。研究表明硫酸銨飽和度為30%、40%、50%和80%時沉淀出的蛋白沒有移除膽固醇的能力;飽和度為60%時,活力為8.4 U/mL,飽和度為70%時,活力為14.8 U/mL,膽固醇清除除能力最高。因此選用50%～70%硫酸銨飽和度純化該蛋白。

圖1 硫酸銨飽和度與降膽固醇能力的關系曲線Fig.1 The relationship between saturated ammonium sulfate solution and the cholesterol reduction ability

2.3 陰離子交換層析

羅伊氏乳桿菌DSM122460在pH為4.0的情況下膽固醇移除率最高,隨著pH的升高,移除率下降,推斷此蛋白的等電點在pH7.0以下[11]。因此選用陰離子交換劑(DEAE-Sepharose F.F)進行實驗[15]。

圖2 pH7.0,NaCl濃度為0.5 mol/L時目的蛋白在DEAE-Sepharose F.F層析圖譜Fig.2 Chromatography of the active substance on a DEAE-Sepharose F.F column at pH7.0 and 0.5 mol/L NaCl

從圖2可以看出,進樣后得到一個蛋白峰Ⅰ,經過0.5 mol/L NaCl-25 mmol/L磷酸鹽緩沖液洗脫后得到洗脫峰Ⅱ,經活力測定,峰Ⅱ具有降膽固醇能力。蛋白電泳結果表明(圖4),峰Ⅱ中含有多種蛋白。可能由于離子濃度太強,幾種蛋白同時洗脫下來。采用起始緩沖液A(pH7.0,25 mmol/LPBS)與洗脫緩沖液B(pH7.0、25 mmol/LPBS,1 mol/L NaCl)進行線性梯度洗脫,經過60 min緩沖液B從0達到100%,峰II被洗脫開,得到3個洗脫峰,分離效果較好,結果如圖3所示。經活力測定,NaCl濃度約為0.25 mol/L時洗脫出的峰Ⅱ-3具有降膽固醇能力,收集該組分,凍干備用。

圖3 pH7.0、采用線性梯度洗脫(NaCl濃度0～0.5 mol/L)時目的蛋白在DEAE-Sepharose F.F層析圖譜Fig.3 Chromatography of the active substance on a DEAE-Sepharose F.F column at pH7.0 with linear gradient elution of NaCl(0～0.5 mol/L)

由表1中可得,粗蛋白液成分較復雜,比活力較低;經超濾濃縮和硫酸銨沉淀后,對目的蛋白進行了富集,其比活力達到29.4 U/mg;再通過陰離子交換層析進行分離,采用線性梯度洗脫方式,比活力達到了61.6 U/mg,純化倍數為32.4。

表1 降膽固醇相關蛋白的分離純化結果

2.4 SDS-PAGE蛋白電泳分析

將純化過程中硫酸銨分級沉淀、兩次陰離子交換層析收集的樣品用分離膠濃度12%的SDS-PAGE分析,選擇低分子量的標準蛋白作為分子量標準(圖4)。電泳結果表明,經過上述純化步驟后得到目的蛋白的單一條帶,達到電泳純,結合Marker分析,此蛋白的分子質量約為60 ku。

圖4 分離純化各組分的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE of samplesfrom different steps of purification注:M.Marker,1.硫酸銨分級沉淀,2.陰離子層析(0.5 mol/L NaCl洗脫),3. 峰Ⅱ-3,陰離子層析(0.1～0.5 mol/L NaCl梯度洗脫)。

2.5 目的蛋白的質譜鑒定

對圖4泳道3中的蛋白條帶挖點后進行酶切,然后將其進行串聯質譜(MALDITOF/TOF)分析,并利用Mascot搜索引擎將數據在蛋白質數據庫(NCBInr)中檢索。利用數據庫檢索對目的蛋白進行檢索后得到Mascot Score圖(圖5)。結果表明,目的蛋白與檢索結果的匹配分數達到108分,遠遠高于其閾值分數65分,說明兩者匹配上的概率是顯著的(p<0.05)。檢索結果顯示其分子量為60802,和樣品SDS-PAGE電泳顯示結果接近。肽段比對到的蛋白質為:hypothetical protein[Lactobacillus reuteri],NCBI數據庫中登錄號No.gi|:489764699。氨基酸覆蓋率為12%(圖6),已用粗體標明。目前對于該蛋白的研究還較少,通過保守結構域分析,該蛋白含有由63個氨基酸組成的含有三段重復區域糖苷結合位點,其中短的重組區域可能與膽堿的結合有關。

圖5 目的水解后肽段的序列檢索Mascot score圖Fig.5 Mascot score histogram of peptides from the digestion of the target protein searching in the database

圖6 質譜分析中與比對蛋白匹配的肽段序列Fig.6 Matched peptides identified by mass spectrometry with the target protein

與降膽固醇有關的蛋白主要包括膽鹽水解酶和膽固醇氧化酶。自從發現乳酸菌在腸道中可使結合膽鹽分解為游離膽鹽以來,膽鹽水解酶被認為在乳酸菌移除膽固醇方面起著關鍵作用。膽鹽水解酶將結合膽鹽水解為游離膽鹽后,游離膽鹽需要在酸性條件下(pH<6.0)才能和膽固醇發生共沉淀作用,從而起到移除膽固醇的能力[16]。通過前面的研究已經表明,CFS中除了膽鹽水解酶以外還含有可移除膽固醇的有效成分[11]。另一和膽固醇降解代謝相關的酶是膽固醇氧化酶,它在氧氣的參與下,可將膽固醇轉化成膽甾-4-烯-3-酮。然而,目前還未有乳酸菌產膽固醇氧化酶的報道[17]。除此以外,于平[18]等人也發現植物乳桿菌在生長過程中產生了特殊的酶系,從而將膽固醇降解成其他物質,導致其含量降低,然而具體酶的種類并未說明。韓國Kim等在嗜酸乳桿菌ATCC43121的CFS中也發現了與降低膽固醇有關的蛋白,其分子量為12 ku[13]。本研究中發現的與降膽固醇有關的蛋白為一假設蛋白,其功能尚需進一步研究。

3 結論

羅伊氏乳桿菌DSM122460的CFS通過超濾裝置得到濃縮液,硫酸銨分級沉淀的飽和度范圍為50%～70%,膽固醇移除能力最高;樣品采用DEAE Sepharose F.F陰離子交換層析進一步分離純化,當pH為7.0,采用含0.1～0.5 mol/L NaCl的磷酸鹽緩沖液進行梯度洗脫時,分離效果較好,得到了電泳純的目的蛋白,純化倍數為32.4;經SDS-PAGE分析,其分子量約為60 ku,通過質譜鑒定初步認定該活性蛋白為一假設蛋白,其功能尚待進一步研究。

[1]于守洋. 中國保健食品的進展[M]. 北京:人民衛生出版社,2001:1-213

[2]Manson J E,Tosteson H,Ridker P M,et al. The primary prevention of myocardial infarction[J]. N Engl J Med,1992,326(21):1406-1416.

[3]Mann G V. Studies of a surfactant and cholesteremia in Maasai[J]. Am J Clin Nutr,1974,27(5):464-469.

[4]Martinez R C,Bedani R,Saad S M. Scientific evidence for health effects attributed to the consumption of probiotics and prebiotics:an update for current perspectives and future challenges[J]. Br J Nutr,2015,114(12):1993-2015.

[5]Gilliland S E,Nelson C R,Maxwell C. Assimilation of cholesterol by Lactobacillus acidophilus[J]. Appl Environ Microbiol,1985,49(2):377-381.

[6]Klaver F A,Van Der Meer R. The assumed assimilation of cholesterol by Lactobacilli and Bifidobacterium bifidum is due to their bile salt-deconjugating activity[J]. Appl Environ Microbiol,1993,59(4):1120-1124.

[7]Corzo G,Gilliland S E. Measurement of bile salt hydrolase activity from Lactobacillus acidophilus based on disappearance of conjugated bile salts[J]. J Dairy Sci,1999,82(3):466-471.

[8]Tsai C C,Lin P P,Shieh Y M,et al. Cholesterol-lowering potentials of lactic acid bacteria based on bile-salt hydrolase activity and effect of potent strains on cholesterol metabolisminvitroandinvivo[J]. Scientific World J,2014,2014:690-752.

[9]Pereira D I,Gibson G R. Effects of consumption of probiotics and prebiotics on serum lipid levels in humans[J]. Crit Rev Biochem Mol Biol,2002,37(4):259-281.

[10]Lindstrom C,Holst O,Nilsson L,et al. Effects of Pediococcus parvulus 2.6 and its exopolysaccharide on plasma cholesterol levels and inflammatory markers in mice[J]. AMB Express,2012,2(1):66.

[11]于瑞莉,郭本恒,張灝,等. 羅氏乳桿菌無細胞上清培養液移除膽固醇能力的研究[J]. 天然產物研究與開發,2012(1):89-93.

[12]Panthi S,Choi Y S,Choi Y H,et al. Biochemical and Thermodynamic Characterization of a Novel,Low Molecular Weight Xylanase from Bacillus Methylotrophicus CSB40 Isolated from Traditional Korean Food[J]. Appl Biochem Biotechnol,2016,179(1):126-142.

[13]Kim Y,Jin Y W,Whang K Y. Characterization of the Cholesterol-Reducing Activity in a Cell-Free Supernatant of Lactobacillus acidophilus ATCC 43121[J]. Biosci Biotech Biochem,2008,72(6):1483-1490.

[14]Rudel L L,Morris M D. Determination of cholesterol using o-phthalaldehyde[J]. J Lipid Res,1973,14(3):364-366.

[15]田亞平. 生化分離技術[M]. 化學工業出版社,2006:235-292.

[16]Jones M L,Tomaro-Duchesneau C,Martoni C J,et al. Cholesterol lowering with bile salt hydrolase-active probiotic bacteria,mechanism of action,clinical evidence,and future direction for heart health applications[J]. Expert Opin Biol Ther,2013,13(5):631-642.

[17]張玲,楊海麟,孫燕,等. 微生物膽固醇氧化酶的研究進展[J]. 食品科學,2009,30(9):225-229.

[18]于平,孫海森,勵建榮,等. 植物乳桿菌LpT1和LpT2體外降膽固醇機制[J]. 微生物學報,2011,51(4):561-565.

Isolation,purification and identification of protein with cholesterol- reducing activity from the supernatant ofLactobacillusreuteri

CHEN Chen1,*,YU Rui-li2

(1.School of Perfume and Aroma Technology,Shanghai Institute of Technology,Shanghai 201418,China; 2.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

The cell-free supernatant(CFS)ofLactobacillusreuteriDSM122460 exhibited the cholesterol removal ability and the effective components were predicted as proteins. The active component was purified by ultrafiltration,ammonium sulfate precipitation,and DEAE-Sepharose F.F anion exchange chromatography. The specific activity of purified component was 61.6 U/mg with a purification factor of 32.4. The purified protein was electrophoresis pure determined by SDS-PAGE,and the estimated molecular weight was about 60 ku. The active protein was identified as a hypothetical protein by mass spectrometry and its function remains to be further studied.

Lactobacillusreuteri;cell-free supernatant(CFS);cholesterol reduction;purification;hypothetical protein

2016-05-24

陳臣(1982-)，男，博士，講師，研究方向：食品生物技術，E-mail：chenchen@sit.edu.cn。

國家自然科學基金(31501451)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)22-0200-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.22.031