基于響應(yīng)面法優(yōu)化Flavobacteriaceae sp.CZ1127中巖藻糖苷酶提取參數(shù)的研究

陳 豐,王 俊,申晶晶,董書君,常耀光

(中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266003)

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基于響應(yīng)面法優(yōu)化Flavobacteriaceaesp.CZ1127中巖藻糖苷酶提取參數(shù)的研究

陳 豐,王 俊,申晶晶,董書君,常耀光*

(中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266003)

海洋細菌Flavobacteriaceaesp.CZ1127胞內(nèi)含有大量巖藻糖苷酶,為高效獲取該胞內(nèi)酶,本文比較了超聲破碎法、化學(xué)試劑法、反復(fù)凍融法、溶菌酶法及滲透壓沖擊法等多種細胞破碎方法,確定了超聲破碎法為較優(yōu)的提取方式。在此基礎(chǔ)上,利用響應(yīng)面實驗設(shè)計研究超聲破碎各因素對提取效果的影響。最終建立了基于超聲破碎法提取巖藻糖苷酶實驗數(shù)據(jù)的數(shù)學(xué)模型,優(yōu)化后的工藝條件參數(shù)為:破碎功率300 W,菌懸液濃度20 mg/mL,破碎總時長10.2 min,單次破碎時長2 s,間歇時長2 s。在優(yōu)化條件下,Flavobacteriaceaesp.CZ1127菌體中獲得巖藻糖苷酶酶活為(13285.6±274.3) mU/g。本文針對巖藻糖苷酶的提取建立了一種高效簡便的方法,對該酶的進一步開發(fā)利用具有積極意義。

巖藻糖苷酶,提取,優(yōu)化,響應(yīng)面,Flavobacteriaceaesp.

L-巖藻糖是常出現(xiàn)于糖基片段末端的單糖之一,研究認為巖藻糖基化能夠賦予被修飾的寡糖、多糖及復(fù)合物眾多獨特的功能特性,例如:以L-巖藻糖為主要組分的多糖類化合物-巖藻聚糖硫酸酯被證實具有抗腫瘤[1]、抗凝血[2]、調(diào)節(jié)免疫[3]以及預(yù)防乙醇型胃潰瘍[4]等多種生理調(diào)節(jié)功能;對一種海參來源類硫酸軟骨素的研究表明,去掉其巖藻糖支鏈將顯著降低其抗凝血活性[5];巖藻糖基化乳糖作為人乳寡糖的重要成分,是嬰兒發(fā)育早期重要的益生元[6-7]。巖藻糖基化化合物在功能食品開發(fā)方面展現(xiàn)出巨大潛力,如日本的“海の雫”沖劑和韓國“FUCOIDAN”口服液等基于巖藻聚糖硫酸酯開發(fā)的功能食品已實現(xiàn)商業(yè)化,但國內(nèi)仍缺乏相關(guān)產(chǎn)品。巖藻糖苷酶是研究及改造巖藻糖基化化合物不可缺少的工具酶[8],因此,巖藻糖苷酶的獲取及進一步應(yīng)用可能將有利于巖藻糖基化化合物的研究與產(chǎn)品開發(fā)。

巖藻糖苷酶廣泛存在于動物、植物與微生物中,相較動物與植物產(chǎn)生的巖藻糖苷酶,微生物所產(chǎn)生的酶產(chǎn)量更大,更適于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)以及滿足應(yīng)用所需[8-9]。本課題組前期從近海海水中篩選得到一株海洋細菌Flavobacteriaceaesp.CZ1127,可大量產(chǎn)生巖藻糖苷酶,但其主要產(chǎn)酶位置為胞內(nèi)。基于此背景,本研究擬針對Flavobacteriaceaesp.CZ1127胞內(nèi)巖藻糖苷酶的提取方式及條件展開系統(tǒng)探索,從而為該酶制備與應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Flavobacteriaceaesp.CZ1127 本實驗室分離于近海海水[10],保藏于中國典型微生物保藏中心(保藏號:CCTCC AB 2015089T);海地瓜參(Acaudinamolpadioides) 購自青島南山水產(chǎn)品市場;TritonX-100 AMRESCO公司;對硝基苯酚巖藻糖苷、十二烷基硫酸鈉(SDS) Sigma公司;吐溫20、吐溫40、吐溫60、吐溫80 天津博迪化工股份有限公司;溶菌酶 北京Solarbio科技有限公司;其他試劑 購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

高速冷凍離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠;HZQ-F160振蕩培養(yǎng)箱 哈爾濱市東聯(lián)生化儀器;UV-2550紫外可見分光光度計 SHIMADZU公司;Scientz-650E超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 巖藻聚糖硫酸酯的制備 以海地瓜參體壁為原料,按參考文獻方法提取其中的巖藻聚糖硫酸酯[10],關(guān)鍵步驟如下:干海參粉碎,丙酮浸泡脫脂,木瓜蛋白酶酶解,氯化十六烷基吡啶沉淀得到粗多糖,Sepharose Q Fast Flow離子交換樹脂純化,透析脫鹽,凍干后得到巖藻聚糖硫酸酯。

1.2.2 菌體制備 接種Flavobacteriaceaesp.CZ1127至液體發(fā)酵培養(yǎng)基(巖藻聚糖硫酸酯 0.2%,NaNO30.2%,MgSO40.5%,CaCl20.01%,Fe2(SO4)30.001%,溶于過濾膜海水,pH7.0),接種量5%,25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h[10]。培養(yǎng)結(jié)束后4 ℃離心(10000 r/min,10 min),以20 mmol/L pH7.2 Tris-HCl緩沖液(含5 mmol/L MgCl2)重懸沉淀并再次離心(10000 r/min,10 min),收集沉淀得到濕菌體并稱重。

1.2.3 提取方法的篩選 分別采用化學(xué)試劑法[11]、反復(fù)凍融法[12]、溶菌酶法[12]、滲透壓沖擊法[12]及超聲破碎法[12-13]提取Flavobacteriaceaesp.CZ1127菌體胞內(nèi)的巖藻糖苷酶,測定提取酶液中巖藻糖苷酶的酶活(方法見1.2.6),依據(jù)公式(1)計算提取率。

式(1)

1.2.3.1 化學(xué)試劑法 選擇吐溫20、吐溫40、吐溫60、吐溫80、TritonX-100及SDS作為提取試劑,分散或溶解于20 mmol/L pH7.2 Tris-HCl緩沖液中,濃度分別為0.2%(v/v)、0.2%(v/v)、0.2%(v/v)、0.2%(v/v)、0.75%(v/v)及0.03 mg/mL。將菌體按20 mg/mL的濃度重懸于各提取液,25 ℃振搖1 h后4 ℃離心(10000 r/min,10 min),取上清即得酶液。

1.2.3.2 反復(fù)凍融法 將菌體按20 mg/mL的濃度重懸于20 mmol/L pH7.2 Tris-HCl緩沖液,-40 ℃冷凍2 h后于25 ℃融化,反復(fù)凍融5次,4 ℃離心(10000 r/min,10 min)收集上清即得酶液。

1.2.3.3 溶菌酶法 將菌體以20 mg/mL的濃度重懸于溶菌酶溶液(10 mg/mL,20 mmol/L Tris-HCl,pH8.0)中,37 ℃孵育1 h,4 ℃離心(10000 r/min,10 min)取上清即得酶液。

1.2.3.4 滲透壓沖擊法 將菌體以20 mg/mL的濃度重懸于高滲透壓溶液(20 mmol/L pH7.2 Tris-HCl緩沖液含0.5 mg/mL EDTA及0.15 g/mL蔗糖),冰水浴0.5 h,4 ℃離心(12000 r/min,10 min),收集菌體沉淀并加入與高滲透壓溶液等體積的20 mmol/L pH7.2 Tris-HCl緩沖液,冰水浴0.5 h,4 ℃離心(10000 r/min,10 min)收集菌體,再次重復(fù)上述操作,取上清即得酶液。

1.2.3.5 超聲破碎法 將菌體按20 mg/mL的濃度重懸于20 mmol/L pH7.2 Tris-HCl緩沖液。菌懸液置于冰水浴中超聲破碎,超聲功率500 W,單次破碎時長2 s,間歇時長2 s,工作總時長12 min。完畢后4 ℃離心(10000 r/min,10 min),取上清即得酶液。

1.2.4 超聲破碎法單因素實驗 選擇超聲功率、超聲總時長、菌懸液濃度、單次超聲時長、間歇時長等5個因素進行單因素實驗,考察這5個因素對巖藻糖苷酶提取率的影響。

1.2.4.1 破碎功率的影響 破碎總時長固定為12 min,菌懸液濃度為20 mg/mL,單次破碎時長為2 s,間歇時長為2 s,破碎功率分別為100、200、300、400、500 W。

1.2.4.2 破碎總時長的影響 破碎功率固定為300 W,菌懸液濃度為20 mg/mL,單次破碎時長為2 s,間歇時長為2 s,破碎總時長分別為3、6、9、12、15 min。

1.2.4.3 菌懸液濃度的影響 破碎功率固定為300 W,破碎總時長為6 min,單次破碎時長為2 s,間歇時長為2 s,菌懸液濃度分別為5、10、20、30、40 mg/mL。

1.2.4.4 單次破碎時長的影響 破碎功率固定為300 W,破碎總時長為6 min,菌懸液濃度為20 mg/mL,間歇時長為2 s,單次破碎時長分別為1、2、4、6、8 s。

1.2.4.5 間歇時長的影響 破碎功率固定為300 W,破碎總時長為6 min,菌懸液濃度為20 mg/mL,單次破碎時長為2 s,間歇時長分別為1、2、4、6、8 s。

1.2.5 超聲破碎法響應(yīng)面優(yōu)化 利用Design Expert軟件(v 8.0.6),根據(jù)中心組合實驗設(shè)計原理,以破碎總時長(X1)、單次破碎時長(X2)及菌懸液濃度(X3)等三個變量為自變量,以提取率(Y)為響應(yīng)值,設(shè)計三因素五水平響應(yīng)面優(yōu)化實驗。實驗因素及其水平的取值見表1。

1.2.6 酶活測定方法 以巖藻糖苷酶降解對硝基苯酚巖藻糖苷的能力定量其酶活[14]:將150 μL底物溶液(對硝基苯酚巖藻糖苷溶于20 mmol/L pH7.2 Tris-HCl,濃度為3.0 mmol/L)與150 μL適當(dāng)稀釋的酶液混合,28 ℃下反應(yīng)30 min后立即加入2.7 mL 0.55 mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng),利用分光光度計測定400 nm 波長下吸光值,根據(jù)OD400 nm與對硝基苯酚濃度的關(guān)系,計算對硝基苯酚生成量,

表1 中心組合實驗設(shè)計因素與水平表

表2 不同提取方法對巖藻糖苷酶的提取效果

從而計算出巖藻糖苷酶酶活。酶活單位定義1 mL酶液于1 min內(nèi)水解底物產(chǎn)生1 μmol對硝基苯酚的活力為1 U;以單位質(zhì)量(g)菌體獲得巖藻糖苷酶酶活的量(10-3U,mU)表示提取率,其單位以mU/g表示。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 各實驗重復(fù)3次,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。利用Design Expert軟件進行響應(yīng)面實驗數(shù)據(jù)分析,建立數(shù)學(xué)模型。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同提取方法的比較研究

利用化學(xué)試劑法(Triton、SDS及吐溫)、反復(fù)凍融法、溶菌酶法、滲透壓沖擊法以及超聲破碎法對Flavobacteriaceaesp.CZ1127進行處理,各方法提取率,見表2。

Trition及SDS處理對Flavobacteriaceaesp.CZ1127胞內(nèi)巖藻糖苷酶具有一定的提取效果,吐溫20、40、60以及80的提取效果較差。TritonX-100、SDS、吐溫20、吐溫40、吐溫60及吐溫80屬于表面活性劑,具有雙親性,可通過擾亂細胞壁及細胞膜中脂質(zhì)分子的致密性、增加膜結(jié)構(gòu)的通透程度,實現(xiàn)胞內(nèi)酶釋放。吐溫20、40、60以及80的表面活性比Triton X-100和SDS弱,這可能導(dǎo)致它們的提取效果不如后兩者理想。

反復(fù)凍融法和滲透壓沖擊法的提取率并不顯著。反復(fù)凍融法是利用凍結(jié)-解凍過程中冰晶對細胞產(chǎn)生機械性損傷從而使細胞破碎的物理方法[16]。滲透壓沖擊法利用高滲透壓及低滲透壓的轉(zhuǎn)換使細胞發(fā)生溶脹,釋放胞內(nèi)物質(zhì)。

溶菌酶可水解細菌細胞壁中的肽聚糖,從而破壞細胞壁結(jié)構(gòu)、實現(xiàn)胞內(nèi)物質(zhì)的獲取。溶菌酶常用于革蘭氏陽性菌胞內(nèi)物質(zhì)的提取。Flavobacteriaceaesp.CZ1127屬于革蘭氏陰性菌[11],細胞壁中肽聚糖含量較少,這使得溶菌酶處理的提取率有限。

超聲波作為一種彈性機械振動波,可以產(chǎn)生空化效應(yīng)和強烈的振動作用,從而破壞細胞的完整結(jié)構(gòu)、釋放胞內(nèi)成分[15]。結(jié)果顯示,超聲破碎法的提取率最高,為12450.26 mU/g。基于此,選擇超聲破碎法進行下一步的條件優(yōu)化。

2.2 超聲破碎法條件的單因素實驗

2.2.1 超聲破碎功率對提取效果的影響 在本實驗選取的條件范圍內(nèi),各破碎功率對應(yīng)的提取率之間無顯著性差異(p>0.05)(圖1)。其中破碎功率為300 W時提取率在數(shù)值上最高,因此將破碎功率固定為300 W進行后續(xù)優(yōu)化實驗。

圖1 功率對超聲破碎法提酶效果的影響Fig.1 Influence of power on the performance of ultrasonication

2.2.2 超聲破碎總時長對提取效果的影響 隨著破碎總時長增加,超聲破碎法的提取率呈現(xiàn)先明顯增加(3～6 min)后保持相對穩(wěn)定(6～15 min)的趨勢(圖2)。這提示破碎總時長達到6 min時細胞的破碎效果已較為完全,繼續(xù)延長可能將增強超聲破碎的熱效應(yīng)從而使酶活受到損失。因此選擇破碎時間為6 min進行后續(xù)優(yōu)化實驗。

圖2 破碎總時長對超聲破碎法提酶效果的影響Fig.2 Influence of total ultrasonic time on the performance of ultrasonication

2.2.3 超聲破碎菌懸液濃度對提取效果的影響 超聲破碎法的提取率隨著菌懸液濃度的增加呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢,當(dāng)菌懸液濃度為20 mg/mL時,提取率最高(圖3)。當(dāng)菌液濃度較低的時候,超聲波在傳遞中會損失較多的能量,不利于細胞的破碎;隨著菌液濃度的增加,超聲波的能量損失減少,表現(xiàn)為破碎效果的提高;但隨著菌液濃度的增加液體的粘稠度會相應(yīng)增加,從而使超聲波的空化效應(yīng)減弱,導(dǎo)致破碎效果降低[17]。

圖3 菌懸液濃度對超聲破碎法提酶效果的影響Fig.3 Influence of bacterial concentration on the performance of ultrasonication

2.2.4 超聲破碎單次破碎時長對提取效果的影響 隨著單次破碎時長的增長,超聲破碎法的提取率呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢,當(dāng)單次破碎時長為2 s時呈現(xiàn)出最高值(圖4)。超聲波的空化效應(yīng)是空氣泡形成、振動、膨脹、壓縮和崩潰閉合的過程,這種效應(yīng)的形成需要一定的時間,時間過短不足以完成空化,適時的工作方式使超聲波產(chǎn)生的空氣泡有更多時間和機會完成膨脹與爆炸,從而增加破碎效果[18],但是時間過長會產(chǎn)生過多熱量導(dǎo)致酶活損失。

圖4 單次破碎時長對超聲破碎法提酶效果的影響Fig.4 Influence of single ultrasonic time on the performance of ultrasonication

2.2.5 超聲破碎間歇時長對提取效果的影響 超聲破碎法的提取率隨間歇時長增加整體呈現(xiàn)先增長而后輕微降低的趨勢,間歇時長為2 s時提取效果最佳(圖5)。超聲破碎中設(shè)定間歇時長的目的是為了促進處理液與冰水浴環(huán)境之間的熱交換,從而降低超聲產(chǎn)熱導(dǎo)致的酶活損失。上述結(jié)果提示,間歇時長設(shè)置為2 s時熱交換的效果已較為充分,同時,從節(jié)約時間成本的角度考慮,選擇2s為適宜的間歇時長條件。

圖5 間歇時長對超聲破碎法提酶效果的影響Fig.5 Influence of interval time on the performance of ultrasonication

2.3 超聲破碎條件的響應(yīng)面優(yōu)化

單因素實驗的結(jié)果表明,破碎總時長(X1)、單次破碎時長(X2)以及菌懸液濃度(X3)可能對巖藻糖苷酶的提取率具有顯著影響。為進一步優(yōu)化提取條件,選取上述三個因素進行響應(yīng)面實驗。

根據(jù)中心組合實驗設(shè)計,共設(shè)置20個實驗點,實驗結(jié)果如表3所示。利用Design Expert軟件對表3進行多元線性回歸和二項式擬合,建立的模型為:

Y=13027.7+191.46X1- 510.62X2- 524.31X3-232.94X1X2+35.23X1X3+56.79X2X3- 122.08X12-241.93X22- 1134.19X32

表3 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果

模型方差分析如表4所示,模型整體達極顯著水平(p<0.01),失擬項不顯著(p>0.05),說明其他因素對實驗結(jié)果的干擾小。模型相關(guān)系數(shù)R2(0.9723)較高,表明該模型和實際情況擬合較好。同時,該模型的變異系數(shù)較低,為2.31%,變異系數(shù)是衡量每個平均值偏離情況的參數(shù),其值越小,重復(fù)性越好。綜上分析,該模型可以較好的描述各因素和響應(yīng)值之間關(guān)系,能夠用于預(yù)測超聲破碎法對Flavobacteriaceaesp.CZ1127胞內(nèi)巖藻糖苷酶的提取率。同時,對于回歸方程系數(shù)的顯著性檢驗結(jié)果表明,單次破碎時長(X2)、菌懸液濃度(X3)對提酶率影響極顯著,破碎總時長(X1)對提酶率影響顯著;同時,交互項X1X2也具有顯著性影響,表明破碎總時長和單次破碎時長之間存在顯著交互作用。

表4 回歸模型方差分析

注:*:差異顯著,p<0.05;**:差異極顯著,p<0.01。

各因素之間的交互影響如圖6所示。當(dāng)單次破碎時長較短時,增大破碎總時長利于細胞破碎,提取率呈增長趨勢;當(dāng)單次破碎時長較大時,增大破碎總時長會加劇超聲波的熱效應(yīng)使酶失活,提取率則呈減小趨勢(圖6a),這說明破碎總時長和單次破碎時長交互效應(yīng)顯著,與方差分析結(jié)果相一致。

圖6 各顯著因素對破碎效果的交互影響Fig.6 The interaction effect of significant factors on ultrasonic results

根據(jù)擬合的數(shù)學(xué)模型,預(yù)測提取率最高時的超聲條件為:破碎總時長10.2 min,單次破碎時長2 s,菌懸液濃度20 mg/mL。預(yù)測得出最優(yōu)的提取率為13664.4 mU/g。為驗證模型預(yù)測的準(zhǔn)確性,按照預(yù)測的提取條件進行巖藻糖苷酶的提取,提取率為(13285.6±274.3) mU/g,結(jié)果與預(yù)測值相近,說明模型的預(yù)測效果較為理想。

3 結(jié)論

考察了多種細胞破碎方法對Flavobacteriaceaesp.CZ1127胞內(nèi)巖藻糖苷酶的提取效果,確定了超聲破碎法是較優(yōu)的提取方式。通過單因素及響應(yīng)面優(yōu)化實驗,成功建立了超聲破碎提取效果與破碎總時長、單次破碎時長以及菌懸液濃度等顯著影響因素之間的數(shù)學(xué)模型,得出最優(yōu)工藝條件為:破碎功率300 W,菌懸液濃度20 mg/mL,破碎總時長10.2 min,單次破碎時長2 s,間歇時長2 s。在最優(yōu)條件下,可從單位質(zhì)量(g)菌體中獲得巖藻糖苷酶酶活(13285.6±274.3) mU。本研究建立了一種提取制備巖藻糖苷酶的良好方法,為該酶的進一步開發(fā)利用提供了有益的技術(shù)支撐。

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Optimization of the parameters for fucosidase extraction fromFlavobacteriaceaesp.CZ1127 based on response surface methodology

CHEN Feng,WANG Jun,SHEN Jing-jing,DONG Shu-jun,CHANG Yao-guang*

(College of Food Science and Engineering,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

The marine bacteriaFlavobacteriaceaesp.CZ1127 is abundant in intracellular fucosidase activity. This paper compared various methods for extracting fucosidase,including ultrasonication,chemical reagents,repeated freeze-thawing technique,lysozyme method and osmotic shock,and found that ultrasonication was an favorable one. In order to optimize parameters,the factors of ultrasonication for extracting fucosidase were investigated by response surface methodology,and a second order quadratic equation was finally established. The optimal operating parameters were determined as follows:total ultrasonic time 10.2 min,single ultrasonic time 2 s,intermittent 2 s,and bacterial concentration 20 mg/mL. Under those condition,the yield of fucosidase activity from the bacteria cells was high to(13285.6±274.3)mU/g. This study established an optimal method for extracting and preparing fucosidase,which would facilitate the further utilization of the enzyme.

fucosidase;extraction;optimization;response methodology;Flavobacteriaceaesp.

2016-03-24

陳豐(1992-),男,碩士研究生,研究方向:食品酶學(xué),E-mail:cfeng719@163.com。

*通訊作者:常耀光(1985-),男,副教授,研究方向:海洋食品碳水化合物,E-mail:changyg@ouc.edu.cn。

國家自然科學(xué)基金(31471684)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)22-0248-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.22.040