響應面法優化腰果蛋白提取工藝

張晶晶，李 蕭,姚廣龍,曹獻英,陳 健

(海南大學食品學院,海南海口 570228)

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響應面法優化腰果蛋白提取工藝

張晶晶，李 蕭,姚廣龍,曹獻英,陳 健*

(海南大學食品學院,海南海口 570228)

本實驗以海南盛產的腰果為原料,以料液比、提取液pH、提取溫度、提取時間為因子,應用單因素及響應面實驗優化腰果蛋白堿溶酸沉法提取的工藝條件。結果表明:當料液比為1∶50(g/mL),pH為11,溫度為40 ℃,浸提時間為1.5 h時,腰果蛋白質的提取率最高,可達87.1%±1.05%。所得腰果蛋白提取回歸模型高度顯著(R2=0.9406),擬合性好,可用于預測蛋白提取率。

腰果蛋白,響應面優化,堿溶酸沉法,工藝參數

腰果,一種腎形堅果,有豐富的營養價值,是世界著名四大干果之一。通過對幾種重要堅果的營養性分析發現腰果蛋白的氨基酸模式與人體氨基酸模式非常接近,是一種價值很高的優質蛋白質。其蛋白質含量可高達21%,是一般谷類作物的2倍之多,氨基酸的種類也與其他谷類作物的氨基酸種類互補,是一種具有高營養價值的食物[1-3]。研究[4-5]表明除色氨酸外,腰果蛋白中富含17種氨基酸,其中包括亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、蘇氨酸等7種人體必需氨基酸,且含量皆高于FAO/WHO/UNO成人推薦標準。非必需氨基酸中的谷氨酸和精氨酸含量較高。Ribeiro[6]等研究認為可將濃縮腰果蛋白作為營養添加劑添加到食品中,增強食物的營養;還可以作為功能性食品,改善人體由于缺少蛋白質而引起的一些疾病等的情況。因此,腰果蛋白作為一種優質的植物蛋白資源,具有極大的開發潛力。

目前有關腰果的研究主要集中在對腰果油、腰果酚等的報道[7]以及一些加工工藝上。對腰果中蛋白質的綜合利用還鮮有研究。Bora[8]等比較研究天然腰果蛋白和變性蛋白功能性質的區別。Yuliana[9]等研究pH和NaCl對腰果殼分離蛋白功能性質的影響。盡管有一些腰果蛋白功能性質的研究報道,但關于提取優化的工藝研究甚少。本實驗以海南腰果為原料,采用堿溶酸沉法和響應面法提取優化腰果蛋白質工藝參數,為腰果蛋白的提取及綜合開發利用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海南腰果 購自海南省樂東市,于陰涼處貯藏;Albumin Bovine V:Solarbio 北京索萊寶科技有限公司;石油醚 沸程30～60 ℃,西隴化工股份有限公司;乙醇、濃硫酸、硼酸 國產分析純,鄭州億中化工原料有限公司;硫酸銅、硫酸鉀 鄭州方點圓化工有限公司;氫氧化鈉 聯慶化工股份有限公司。

DS-1組織搗碎機 上海右一儀器有限公司;SHB-Ⅲ 循環水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司;HH-4數顯恒溫水浴鍋 金壇市盛藍儀器制造有限公司;TDZ5-WS多管架自動平衡離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司;Synergy HT多功能酶標儀 美國伯騰儀器有限公司;SHIMADZU AUW220電子天平 廈門群隆儀器有限公司;電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司;LNK860自動凱氏定氮儀 山東綠能儀器科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 脫脂腰果粉的制備 將一定量的顆粒飽滿、無蟲害的腰果放入DS-1組織搗碎機中進行粉碎,用沸程為30～60 ℃的石油醚脫脂15～20 min,而后抽濾,重復3～4次,得到脫脂腰果粉[10-11]。

1.2.2 脫脂腰果蛋白提取液的制備 采用堿溶酸沉法[12-13]。稱脫脂腰果粉1 g,加入一定量的蒸餾水,用氫氧化鈉調節至一定pH,浸提一定時間,用4000 r/min轉速離心后取上清液,測蛋白質含量。

1.2.3 腰果粗蛋白的測定 腰果粉中總蛋白質含量采用凱氏定氮法[14-16]測定,進行三次平行測定實驗,取平均值。按下式計算蛋白質含量:

總蛋白含量(%)=c×V×0.0140×F×100/m

式中,c為標準酸濃度;V表示標準酸消耗量;F為蛋白質系數,m為腰果粉質量。

1.2.4 可溶性蛋白質含量的測定 采用考馬斯亮藍法[17-19]。用考馬斯亮藍G-250染色,以牛血清蛋白為標準蛋白,建立回歸方程:y=4.6468x-0.0188,R2=0.9907,其中y代表在595 nm下測得的吸光度,x表示蛋白質濃度。按下式計算腰果蛋白提取率:

提取率(%)=(上清液中的蛋白質含量/提取材料中蛋白質含量)×稀釋倍數×100

1.3 蛋白質提取工藝的確定

1.3.1 單因素實驗設計 對提取pH、浸提溫度T、浸提時間t和料液比進行單因素實驗。

1.3.1.1 pH的確定 在料液比為1∶30 g/mL,T=45 ℃,t=1.0 h時,對pH8、9、10、11、12進行研究。

1.3.1.2 浸提溫度T的確定 在料液比為1∶30,pH=9,t=1.0 h時,T采用25、30、35、40、45 ℃進行研究。

1.3.1.3 浸提時間的確定 在料液比為1∶30 g/mL,pH=9,T=45 ℃時,t分別取 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h。

1.3.1.4 料液比的確定 在pH=9,T=45 ℃,t=1.0 h時,對料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL進行研究。

1.3.2 響應面法優化提取工藝 根據單因素實驗結果,按照Box-Benhnken中心組合實驗設計原理,采用Design ExpertV7.0軟件進行實驗設計[20-23]。本實驗選擇pH(A)、浸提時間(B)、料液比(C)三個因素為考察因素,以蛋白質提取率為指標,其因素水平見表1。

1.4 數據處理

使用SPSS 19.0進行方差分析。

表1 腰果蛋白響應面設計因素及水平編碼

2 結果與分析

2.1 腰果蛋白含量測定結果

用凱氏定氮法測得脫脂腰果中的總蛋白含量為19.41%。

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 pH對腰果蛋白質提取率的影響 由圖1知，當pH由8上升到10時,蛋白質的提取率明顯增加。當pH為10時,蛋白質提取率達到最大,而當pH大于10時提取率減小。這是因為堿可以分解蛋白質分子間的氫鍵,從而使其結構變得松散,促進了淀粉和蛋白質分離,使蛋白提取率增加,但是當pH過高時,會導致在強堿性作用下,蛋白質發生了各種脫氨,脫羧和水解反應[24]。據實驗觀察還會使蛋白浸提液顏色變深,這是因為蛋白質長期受強堿作用會影響蛋白質活性,甚至產生有毒化合物,不利于工業生產。綜合考慮,提取體系的pH宜保持在10左右。

圖1 pH對腰果蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of pH on extraction rate of cashew nuts protein

2.2.2 浸提溫度對腰果蛋白質提取率的影響 由圖2知，當溫度在25～40 ℃,蛋白質提取率逐漸增加。當提取溫度達到40 ℃時,蛋白質提取率最大。當超過40 ℃時,提取率明顯減小。因為溫度升高,分子運動更快,更容易溶解來自原料中的蛋白質;但隨著溫度的持續升高,蛋白質的提取率反而減小,這是由于溫度過高,破壞了蛋白質的結構,使得蛋白質分子聚集,溶解度下降。并且高溫會使蛋白質變性,直接影響產品質量[11,25]。所以綜合考慮,提取體系的溫度應保持在40 ℃左右。

圖2 溫度對腰果蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of temperature on extraction rate of cashew nuts protein

2.2.3 浸提時間對腰果蛋白質提取率的影響 由圖3知，腰果蛋白的提取率在0.5～1.0 h呈現上升趨勢,在1.0 h時達到最高,而后逐漸減小。可能因為當提取時間過短時,來自原料中的蛋白質還沒有完全溶解出來。而提取時間過長會導致浸提液中蛋白質分子間產生相互作用導致蛋白質聚集在一起,溶解度隨之下降,所以浸提液中蛋白質含量下降[9,26];并且隨著時間的推移,提取溶劑慢慢揮發,料液比隨之減小,這也間接導致了蛋白質提取率的減小。綜合考慮,提取體系最終確定最佳提取時間為1.0 h。

圖3 浸提時間對腰果蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction rate of cashew nuts protein

2.2.4 料液比對腰果蛋白質提取率的影響 由圖4知，蛋白質提取率隨料液比的增加呈現先增加后減小的趨勢。當料液比為1∶40(g/mL)時,提取率達到最大值。可能是因為隨著浸提液的增加,來自原料中的蛋白質更容易被溶解出來,提取率相應增大。當提取液用量過多時,會造成原料的浪費,增加產品成本。綜合考慮,提取體系最終確定最佳料液比為1∶40(g/mL)。

圖4 料液比對腰果蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of solid-to-liquid ratio on extraction rate of cashew nuts protein

綜合四個因素對腰果蛋白質提取率的影響結果,發現溫度相對于其它三個因素對結果的影響較小,因此選擇pH、浸提時間、料液比三個因素進行響應面優化。

2.3 腰果蛋白質響應面優化提取條件

2.3.1 回歸模型的建立 實驗結果見表2。利用Design Expert軟件可得到二次多元回歸方程:

提取率Y=58.85+3.08A+1.57B+12.12C+2.27AB-1.68AC-1.07BC+7.94A2+9.31B2-4.23C2

表2 實驗設計與結果

回歸方程的方差分析結果見表3。回歸模型的p值小于0.01,R2=0.9406，表明所得模型極顯著。模型誤差失擬項中p>0.05,說明該方程對實驗擬合度較好,可以利用上述模型預測提取條件對蛋白質提取率的影響。由F值可得各因素對腰果蛋白提取率的影響順序為:料液比>pH>提取時間。C、A2、B2對蛋白質提取率影響極顯著,其他因素影響不顯著。

2.3.2 各因素對腰果蛋白提取率的響應面分析 響應面圖形能較直觀地反映出各因素對蛋白質得率的影響,其響應曲面的陡峭程度反映了各因素對響應量的影響顯著程度。二者呈正比關系,即曲面越陡峭,影響越顯著。圖5～圖7反映了各因素對腰果蛋白提取率的影響。由圖5可知,料液比為1∶40 g/mL時,提取時間一定時,蛋白質提取率隨著pH升高呈先下降后上升趨勢。由圖6可以看出,當浸提時間為1.00 h,料液比一定時，蛋白質提取率隨著pH升高呈先減小后增加趨勢。同理,圖7與圖6表現出類似的變化趨勢。對比三張圖可得,提取pH(A)和提取時間(B)的交互作用最為顯著,料液比(C)與提取 pH(B)的相互影響最小,與上述的模型方差分析結果一致。

表3 方差分析

圖5 pH和浸提時間對蛋白質得率影響的響應面Fig.5 Responsive surfaces of the effect of pH and time on protein extraction yield

圖6 pH和料液比對蛋白質得率影響的響應面Fig.6 Responsive surfaces of the effect of pH and solid-to-liquid ratio on protein extraction yield

圖7 提取時間和料液比對蛋白質得率影響的響應面Fig.7 Responsive surfaces of the effect of time and solid-to-liquid ratio on protein extraction yield

注:**表示在α=0.01水平上極顯著。

2.3.3 獲取最佳提取條件 由Design-ExpertV7.0分析得最佳提取條件是:pH11.00,液料比1∶49.94(g/mL),提取時間1.50 h,此條件下的理論提取率為88.15%。為檢驗實驗結果的可靠性,可進行驗證實驗。但顯然料液比的比例不便于操作,所以將最佳工藝條件修正為:料液比1∶50(g/mL),pH11,提取時間1.5 h,三次驗證實驗的腰果蛋白的實際提取率為87.1%±1.05%。

3 結論

本研究以腰果為原料,采用堿溶酸提法提取腰果中的蛋白質。在單因素實驗的基礎上,通過響應面實驗優化工藝參數,得出最佳工藝條件為:料液比1∶50,pH11,提取時間1.5 h,在此工藝條件下,蛋白質的得率可達87.1%±1.05%。說明通過響應分析法得到的回歸方程可較好地預測實驗結果。

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Optimization of cashew nuts protein extraction using response surface methodology

ZHANG Jing-jing,LI Xiao,YAO Guang-long,CAO Xian-ying,CHEN Jian*

(Food Science and Technology,Hainan University,Haikou 570228,China)

The cashew nuts produced abundantly by Hainan were used to be the research object,the alkaline extraction and acid precipitation technology of extraction process was optimized with solid-to-liquid(S/L)ratio,solvent pH,extraction temperature and time by single-factor and response surface methodology designs. The results showed that the best experimental conditions were found to be extraction at 40 ℃ for 1.5 h using an extraction solvent at pH11 with S/L ratio of 1∶50(g/mL). Under the optimized conditions,the yield of protein was 87.1%±1.05%. The cashew nuts protein extraction regression model was highly significant(R2=0.9406),with good fitting and could be used to predict protein extraction rate.

cashew nuts protein;response surface optimization;alkaline extraction and acid precipitation;process parameters

2016-05-04

張晶晶(1990-)，女，大學本科，研究方向：天然產物的加工與利用，E-mail：18976363119@163.com。

*通訊作者:陳健(1985-)，男，講師，研究方向：天然產物的加工與利用，E-mail：chenjian19850702@163.com。

海南省自然科學基金項目(20163053);海南大學科研啟動基金項目(kyqd1553)。

TS255.6

B

1002-0306(2016)22-0305-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.22.051