狗棗獼猴桃多酚對60Coγ射線輻射防護作用的研究

左麗麗,富校軼,高永欣,孫茂成,王振宇,王舒然,*

(1.吉林醫藥學院,公共衛生學院,吉林吉林132013;2.哈爾濱工業大學食品科學與工程學院,黑龍江哈爾濱 150090)

?

狗棗獼猴桃多酚對60Coγ射線輻射防護作用的研究

左麗麗1,富校軼1,高永欣1,孫茂成1,王振宇2,王舒然1,*

(1.吉林醫藥學院,公共衛生學院,吉林吉林132013;2.哈爾濱工業大學食品科學與工程學院,黑龍江哈爾濱 150090)

以狗棗獼猴桃為原料,研究分離純化的狗棗獼猴桃多酚(AKP)的輻射防護作用。雄性昆明小鼠隨機分為6組:正常對照組、輻射模型組、利可君片組(1.4 mg/kg·d)、狗棗獼猴桃多酚低、中、高劑量組(分別為50、100、200 mg/kg·d),連續給藥14 d,除正常對照組外所有小鼠采用60Coγ射線進行全身照射,劑量率為0.792 Gy/min,輻射劑量為6.0 Gy,輻射后觀察小鼠體內抗氧化物酶以及丙二醛(MDA)的表達情況,同時測定還原型谷胱甘肽(GSH)的含量。結果表明:與對照組相比,模型組小鼠各組織超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性降低(p<0.05),MDA含量升高(p<0.01)。與模型組相比,中劑量的AKP能夠顯著提高輻射小鼠體內SOD的活性(p<0.05);低劑量AKP能夠使心臟、腎臟、血漿中CAT活性基本恢復到正常對照組水平;中劑量AKP使肝臟、脾臟、血漿中GSH-Px活性顯著提高(p<0.01),不同劑量的AKP能夠有效降低輻射小鼠各組織中MDA含量(p<0.05);中劑量的AKP使機體各組織中乳酸脫氫酶(LDH)的活性基本恢復到正常水平。但是總體效果不及利可君片。因此,狗棗獼猴桃多酚可一定程度地保護機體,減少氧化損傷對機體造成的不良影響,也為其進一步開發利用提供了科學依據。

狗棗獼猴桃,多酚,氧化損傷,輻射防護

科技的不斷進步以及生物技術的迅速發展增加了人體暴露在電離輻射中的機會,例如核輻射、空間環境、放射醫療等輻射給人體造成了極大的危害,導致機體直接或間接性的損傷,引起氧化應激,產生大量的活性氧自由基,攻擊生物大分子如DNA、蛋白質、脂類等,從而產生一系列的鏈式反應,最終導致癌癥、炎癥、畸形以及孕婦流產等一系列疾病[1-5]。因此,輻射損傷引起了人們的廣泛關注[6],為了有效預防輻射對機體造成的損傷,人們一直致力于輻射防護作用的研究,然而,大多數合成輻射防護劑都具有毒副作用,不能長期服用等特點。多酚、黃酮類、花色苷、多糖等天然產物由于其超強的抗輻射作用,且具有安全、毒副作用小的特點而備受關注[7]。研究顯示,松多酚、元蘑多糖、大豆異黃酮、藍靛果以及越橘花色苷等天然成分能降低脂質過氧化反應,增加體內抗氧化物酶的活性[8-12],同時能夠修復DNA的損傷,提高細胞的生存率[13-14]。前期研究發現狗棗獼猴桃多酚具有非常好的體外抗氧化能力[15],因此,本文通過60Coγ射線誘導小鼠建立氧化損傷模型,研究狗棗獼猴桃多酚對機體抗氧化酶系表達的影響,研究其輻射防護作用,為進一步開發安全高效的天然抗輻射食品提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

狗棗獼猴桃野生漿果 采摘于黑龍江省大興安嶺地區;狗棗獼猴桃多酚(AKP,純度為38.6%) 哈爾濱工業大學食品科學與工程學院生物化工實驗室制備[16];利可君片 江蘇吉貝爾藥業有限公司;考馬斯亮蘭蛋白測定、MDA、SOD、CAT、GSH-Px、LDH試劑盒 南京建成科技有限公司;清潔級雄性昆明小鼠 6～8周齡,體重(22±2)g,許可證號:SCXK(黑)2013-001，購于哈爾濱醫科大學腫瘤醫院動物實驗中心。

HR2006型料理機 飛利浦電子香港有限公司;TDZ4-WS型低速離心機 湖南湘儀實驗儀器有限公司;Sp-752PC型紫外可見分光光度計 北京光譜儀器有限公司;RE-3000旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠;KQ-5200超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;FD-18真空凍干機 上海田楓實業有限公司;恒溫水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司;HT-2酶標儀 Biocell公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠輻射損傷模型的建立 雄性昆明小鼠,6～8周齡,體重(22±2) g,保持實驗室溫度在(25±2) ℃,相對濕度在40%～50%,適應性喂養一周,此期間所有小鼠自由攝食和飲水。適應期后,將小鼠隨機分成六組(正常對照組,輻射模型組,陽性對照組,AKP低、中、高劑量干預組),每組20只小鼠,并進行組內和組間標記。AKP低劑量干預組:50 mg/kg·d;AKP中劑量干預組:100 mg/kg·d;AKP高劑量干預組:200 mg/kg·d,陽性對照組:1.4 mg/kg·d利可君片;正常對照組和模型組灌胃一定體積的生理鹽水。每天上午9:00進行灌胃,連續灌胃14 d,第15 d用60Coγ射線輻射,劑量率為0.792 Gy/min,輻照時間10 min 40 s,皮源照射距離為170 cm,劑量為6.0 Gy,輻射后第2 d摘眼球取血,脫臼處死,迅速剝離小鼠的心、肝、脾、腎等組織,放置在4 ℃預冷的生理鹽水中清洗3次,去除血污及結締組織,然后用濾紙將臟器表面的水分吸干,并稱重記錄。

1.2.2 組織勻漿液的制備及蛋白含量測定 小鼠組織勻漿液的制備:將小鼠心、肝、脾、腎置于研缽中,向其中加入少許液氮,用缽杵將其快速磨碎,使組織充分勻漿,加入一定體積的0.86%生理鹽水,將其充分混勻,轉移至離心管中,補充生理鹽水的總體積至組織重量的9倍,制成10%的組織勻漿液,以1000 r/min的速度離心10 min,棄去沉淀取上清液分裝,-80 ℃保存備用。各組織勻漿液蛋白含量的測定按照考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒說明書進行操作。

1.2.3 體內相關過氧化物酶活性的測定 取一定體積的1.2.2步驟中的組織勻漿液,測定心、肝、脾、腎、血漿等各組織中MDA、SOD、CAT、GSH-Px、LDH、GSH的活力嚴格按照南京建成試劑公司提供的試劑盒說明書進行操作。

1.3 統計與分析

每組實驗進行三次重復,數據以平均值±標準差表示,采用Original 8.5進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 AKP對小鼠體重的影響

以60Coγ-射線誘導小鼠建立氧化損傷模型,測定輻射損傷對動物機體中各指標的影響。給藥期間AKP對小鼠體重動態變化的影響如圖1所示,可見,氧化損傷前小鼠的體重組內和組間沒有顯著的變化,均呈緩慢增長的趨勢,灌胃10 d后高劑量組體重出現些許降低的趨勢,其他劑量組之間的體重變化沒有顯著性差異。表明AKP和利可君片選取的劑量對小鼠的生長沒有急性毒性。氧化損傷后模型組小鼠受到大劑量γ射線的全身照射,使其出現精神不振、食欲不佳,飲食量和飲水量下降等現象,從而導致輻射后小鼠的體重出現一定程度的降低,而灌胃AKP和利可君片的小鼠體重也有所降低,但降低幅度小于模型組,且組間差異不顯著,同時給藥組小鼠的精神狀態良好,這表明狗棗獼猴桃多酚和利可君片在一定程度上緩解了氧化損傷導致的小鼠體重降低,減少氧化損傷的癥狀。

圖1 AKP對小鼠體重的動態變化Fig.1 The changes of body weight in experimental period

表1 AKP對輻射小鼠各組織和血漿中MDA含量的影響

注:各組織中MDA含量單位為nmol/mg prot;血漿中MDA含量單位為nmol/mL;#與正常對照組存在顯著性差異,p<0.05,##與正常對照組存在極顯著性差異,p<0.01;*與輻射模型組存在顯著性差異,p<0.05,**與輻射模型組存在極顯著性差異,p<0.01；表2～表6同。

表2 AKP對輻射小鼠各組織及血漿中SOD活性的影響

注:各組織中SOD含量單位為U/mg prot;血漿中SOD含量單位為U/mL。2.2 AKP對體內MDA及相關抗氧化酶活力的影響

2.2.1 AKP對機體MDA含量的影響 MDA的產生是衡量機體自由基代謝的敏感指標,其含量的多少反映出氧自由基生成與否以及脂質過氧化的程度[17]。AKP對輻射小鼠各組織及血漿中MDA含量的影響如表1所示。與正常對照組相比,輻射后各臟器組織中MDA含量極顯著增加(p<0.01),表明6.0 Gy的輻射劑量導致小鼠各組織器官產生了明顯的脂質過氧化反應,即氧化損傷模型建立成功。與模型組相比,加藥后陽性對照組MDA含量都極顯著降低(p<0.01),即利可君片能夠防止機體發生脂質過氧化反應,起到很好的防護作用。AKP低、中、高劑量組中MDA的含量顯著低于輻射模型組(p<0.05),這表明狗棗獼猴桃多酚對輻射引起的氧化損傷具有很好的防護作用。而腎臟和血漿中MDA含量表明AKP中劑量組效果較好,顯著地優于低、高劑量組。分析其原因可能是給藥濃度過高,對機體的腎臟和血液系統產生了一定的毒副作用,使得高劑量組小鼠各組織和血漿中的MDA含量偏高,同時小鼠個體之間的差異也是導致此現象的一個重要原因。

2.2.2 AKP對超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響 AKP對輻射損傷小鼠各組織及血漿中SOD活力的影響如表2所示,與正常對照組相比,輻射后模型各組織中SOD的活性顯著下降(p<0.05),輻射前灌胃利可君片和AKP后,利可君片及低、中劑量組小鼠各臟器組織和血漿中SOD活力顯著提高(p<0.05),使輻射后機體SOD的水平得到有效的恢復,基本保持在正常水平,使其免受輻射造成的嚴重損傷。但是當AKP濃度較高時,達到200 mg/kg·d時,各組織中SOD的活力相對于模型組有一定程度的改善(p<0.05),但是效果不及低、中劑量組,這表明一定劑量的AKP能夠提高機體SOD活力,抑制輻射對機體造成的嚴重損傷。機體受到損傷后,自由基產生增加,機體本身能夠通過自我調節能力提高體內SOD的水平,有利于對超氧自由基的清除,而灌胃AKP和利可君片組的機體自我調節能力明顯大于輻射模型組,因此,SOD的超表達也可能是各臟器組織增加脂質過氧化反應的適應性反應,它的高活性可能是通過增加超氧化物陰離子的產生而誘導的[18]。

2.2.3 AKP對過氧化氫酶(CAT)活性的影響 CAT存在于能呼吸的生物體內,主要存在于動物的線粒體,內質網以及動物的肝臟和紅細胞中,其活性為機體提供了有效的抗氧化防御機制。不同來源的CAT具有不同的結構,在不同的組織中其活性水平也不相同。AKP對輻射小鼠不同組織中及血漿中CAT活力的影響如表3所示,與正常對照組相比,輻射后模型組各臟器組織中CAT含量顯著降低(p<0.05)。與模型組相比,利可君片組能夠顯著提高輻射小鼠心臟、脾臟、腎臟和血漿中CAT的水平(p<0.05),AKP低劑量組效果較好,能夠使心臟、腎臟、血漿中CAT含量基本恢復到正常對照組水平,而中、高劑量組可能是由于AKP濃度過高,產生一定的副作用,或者機體間存在一定的個體差異,使得各組織中CAT水平相比于低劑量組有所下降,但是也優于輻射模型組,這表明一定劑量的AKP能夠顯著提高小鼠各臟器組織及血漿中CAT的活力,但在不同的組織中CAT提高的水平不一致,具有顯著性的差異。

表3 AKP對輻射小鼠各組織及血漿中CAT活力的影響

注:各組織中CAT含量單位為U/mg prot;血漿中CAT含量單位為U/mL。

表4 AKP對小鼠各組織及血漿中GSH-Px活性的影響

注:各組織中GSH-Px含量單位為U/mg prot;血漿中GSH-Px含量單位為U/L。

表5 AKP對輻射小鼠各組織及血漿中GSH含量的影響

注:各組織和血漿中GSH含量單位為μmol/L。

2.2.4 AKP對谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性的影響 AKP對輻射小鼠各臟器組織和血漿中GSH-Px活力的影響如表4所示,與正常對照組相比,模型組中GSH-Px的活性顯著降低(p<0.01),其中心臟中GSH-Px活性最低,這表明心臟受到的輻射損傷最嚴重。輻射前灌胃利可君片和不同劑量的AKP后,與模型組相比,各組織器官中GSH-Px的活力都有不同程度的升高(p<0.05),由于心臟受到的損傷最嚴重,修復也比較困難,因此,加藥組雖然對GSH-Px的水平有一定的提高,但是相比正常對照組還具有顯著性的差異(p<0.05)。而AKP中劑量組使肝臟、脾臟以及血漿中GSH-Px的含量得到很好的修復(p<0.05),AKP高劑量組效果相對較差,從總體上看,利可君片和中劑量AKP對保護GSH-Px的活性、提高機體抗輻射能力、預防氧化損傷起到很好的作用。

2.2.5 AKP對體內微量還原型谷胱甘肽(GSH)的影響 GSH是機體內最重要的非酶抗氧化劑,能夠阻斷自由基的鏈式反應,抑制脂質過氧化反應的發生,保護生物膜及生物大分子免受自由基的攻擊,同時能夠有效的保護由放射線、放射性藥物以及某些抗癌藥物引起的白細胞減少等癥狀[19]。AKP對輻射小鼠各組織及血漿中GSH含量的影響如表5所示,與正常對照組相比,輻射模型組小鼠各組織和血漿中GSH的水平顯著降低(p<0.01)。與輻射模型組相比,長期灌胃AKP和利可君片增加了心臟、肝臟、脾臟、腎臟和血漿中GSH的含量(p<0.05),大約是輻射模型組的1.32～3.02倍,而中劑量AKP使心臟、脾臟和腎臟中GSH含量接近正常對照組的水平,GSH含量的增加能夠有效提高機體的免疫力,保護機體組織免受傷害。這表明一定劑量的AKP和利可君片能夠有效提高機體內GSH的水平,以提高機體抵抗氧化損傷的能力。

2.2.6 AKP對乳酸脫氫酶(LDH)活力的影響 AKP對輻射小鼠各組織及血漿中LDH活力的影響如表6所示,與正常對照組相比,輻射模型組血漿中LDH的活性極顯著升高(p<0.01),而各組織中LDH的水平出現一定程度的下降,這表明輻射使得機體的各組織器官受到損傷,使其膜的通透性降低,致使各器官組織中LDH大量外溢,釋放到血液中,最終導致血漿中LDH大幅度升高。LDH釋放率表明了機體損傷的嚴重程度,同時細胞代謝發生紊亂,導致惡性腫瘤因子的啟動,癌癥的發生率逐漸提高。輻射前灌胃利可君片和AKP后,能夠提高小鼠不同組織中LDH的活性,隨著AKP劑量的增加,低、中劑量AKP對機體各器官的保護作用增強,使得小鼠組織中的LDH活性也逐漸增加(p<0.05),尤其以中劑量效果最好,幾乎達到了正常對照組水平。這表明AKP對機體的損傷有很好的防護作用,細胞膜受損程度較輕,各組織向外釋放的LDH含量也逐漸降低,因此血漿中LDH的水平也逐漸降低,接近正常水平,即一定劑量的AKP能夠保護細胞膜免受輻射造成的傷害,防止癌癥等一系列疾病的發生。

表6 AKP對輻射小鼠各組織及血漿中LDH活力的影響

注:各組織中LDH含量單位為U/g prot;血漿中LDH含量單位為U/L。

3 結論

本實驗研究了狗棗獼猴桃多酚的抗輻射作用,通過構建60Coγ射線輻射誘導的氧化損傷模型,進行體內抗氧化酶系表達的研究。與模型相比,AKP能夠顯著提高機體各臟器組織中SOD、CAT和GSH-Px等酶的活性,顯著的降低機體內LDH以及MDA的含量,同時還能夠促進體內抗氧化物質GSH的形成,提高機體的抗氧化能力,從而很好的保護機體免受輻射造成的氧化損傷。因此,狗棗獼猴桃多酚具有很好的輻射損傷防護作用,為其進一步應用于醫藥、保健食品提供了科學依據。

[1]Le Roux A,Josset E,Benzina S,et al. Evaluation of the radioprotective potential of the polyphenol norbadione A[J]. Lett Drug Des Discovery,2012,9(1):48-53.

[2]Aqil F,Gupta A,Munagala R,et al. Antioxidant and antiproliferative activities of anthocyanin/ellagitannin-enriched extracts fromSyzygiumcuminiL.(Jamun,the Indian Blackberry)[J]. Nutrition and Cancer-an International Journal,2012,64(3):428-438.

[3]Hassimotto N M A,Lajolo F M. Antioxidant status in rats after long-term intake of anthocyanins and ellagitannins from blackberries[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture,2011,91(3):523-531.

[4]Park S-J,Ahn G,Lee N H,et al. Phloroglucinol(PG)purified from Ecklonia cava attenuates radiation-induced apoptosis in blood lymphocytes and splenocytes[J]. Food and Chemical Toxicology,2011,49(9):2236-2242.

[5]Nishad S,Ghosh A. Dynamic changes in the proteome of human peripheral blood mononuclear cells with low dose ionizing radiation[J]. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis,2016,797:9-20.

[6]Nakanishi S,Moore J E,Matsuda M,et al. Bacterial stress response to environmental radiation relating to the Fukushima radiation discharge event,Japan:Will environmental bacteria alter their antibiotic susceptibility profile?[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety,2012,76:169-174.

[7]Li N,Shen X,Liu Y,et al. Isolation,characterization,and radiation protection ofSipunculusnudusL. polysaccharide[J]. Int J Biol Macromol,2016,83:288-296.

[8]Dixit A K,Bhatnagar D,Kumar V,et al. Antioxidant potential and radioprotective effect of soy isoflavone against gamma irradiation induced oxidative stress[J]. Journal of Functional Foods,2012,4(1):197-206.

[9]樊梓鸞. 紅豆越橘多酚對氧化誘導損傷及癌細胞增殖抑制作用研究[D].哈爾濱:哈爾濱工業大學,2012.

[10]Matito C,Agell N,Sanchez-Tena S,et al. Protective effect of structurally diverse grape procyanidin fractions against UV-induced cell damage and death[J]. J Agric Food Chem,2011,59(9):4489-4495.

[11]Li X,Wang Z,Wang L. Polysaccharide of Hohenbuehelia serotina as a defense against damage by whole-body gamma irradiation of mice[J]. Carbohydr Polym,2013,94(2):829-835.

[12]李輝,白海娜,刁巖,等. 松多酚及其炭黑曲霉轉化產物對γ-輻射誘導小鼠免疫損傷的防護研究[J]. 航天醫學與醫學工程,2016(2):84-89.

[13]Nambiar D,Rajamani P,Singh R P. Effects of phytochemicals on ionization radiation-mediated carcinogenesis and cancer therapy[J]. Mutation Research/Reviews in Mutation Research,2011,728(3):139-157.

[14]Kalpana K B,Devipriya N,Srinivasan M,et al. Evaluating the radioprotective effect of hesperidin in the liver of Swiss albino mice[J]. European Journal of Pharmacology,2011,658(2-3):206-212.

[15]Zuo L-L,Wang Z-Y,Fan Z-L,et al. Evaluation of Antioxidant and Antiproliferative Properties of Three Actinidia(Actinidia kolomikta,Actinidia arguta,Actinidia chinensis)Extractsinvitro[J]. Int J Mol Sci,2012,13(5):5506-5518.

[16]左麗麗,王振宇,富校軼,等. 狗棗獼猴桃多酚的純化工藝研究[J]. 食品研究與開發,2015,36(24):73-76，148.

[17]戴成國,王紀平,肖揚,等. 首烏藤黃酮的體內抗氧化作用研究[J]. 陜西師范大學學報:自然科學版,2011,39(4):75-78.

[18]Gokul S,Patil V S,Jailkhani R,et al. Oxidant-antioxidant status in blood and tumor tissue of oral squamous cell carcinoma patients[J]. Oral Dis,2010,16(1):29-33.

[19]白海娜,王振宇,李輝,等. 五種漿果多酚與黑木耳多糖復合物的輻射防護作用[J]. 食品工業科技,2013(16):117-120,124.

The radioprotection ofActinidiakolomiktapolyphenols against organism damage by60Coγ-rays

ZUO Li-li1,FU Xiao-yi1,GAO Yong-xin1,SUN Mao-cheng1,WANG Zhen-yu2,WANG Shu-ran1,*

(1.School of Public Health,Jilin Medical College,Jilin 132013,China; 2.School of Food Science and Engineering,Harbin Institute of Technology,Harbin 150090,China)

In this paper selectedActinidiakolomiktaas raw material,to investigate radiation-protective effect ofActinidiakolomiktapolyphenols(AKP)by separation and purification. Male Kunming mice were divided into 6 groups randomly:control group,radiation model group,leucogen tablets group,low AKP group(50 mg/mg/kg·d),medium AKP group(100 mg/mg/kg·d),and high AKP group(200 mg/mg/kg·d). The interventions for AKP exposure continued for 14 consecutive days. Except contrast group,all 5 groups were irradiated by60Coγ-rays,the dose rate was 0.792 Gy/min,and radiation dose was 6.0 Gy. After radiation,analyze expression of antioxidant enzymes,MDA and GSH in mice. The results indicated that model mice significantly decreased in tissue SOD,CAT,GSH-Px and GSH content(p<0.05),increased MDA content(p<0.01),compared with control group. Middle dose group mice increased SOD activity(p<0.05),low dose group mice CAT activity returning to normal in heart,kidney,plasma,middle dose group mice GSH-Px activity significantly increased in liver,spleen,plasma(p<0.01),different doses group mice MDA content effectively reduce in tissue(p<0.05),middle dose group mice LDH activity returning to normal in tissue. But overall effect was not in competition with leucogen tablets. In conclusion,AKP could greatly protect the body,reduce the adverse effects of oxidative damage on organism,and to provide a scientific basis for further development and utilization.

Actinidiakolomikta;polyphenols;oxidative damage;radioprotection

2016-04-14

左麗麗(1982-)，女，博士，講師，主要從事天然產物分離純化、結構鑒定及其功能研究,E-mail：zuolili213@163.com。

*通訊作者:王舒然(1968-)，男，博士，教授，主要從事慢性病的膳食預防和控制,E-mail：shuranwang@163.com。

吉林市科技創新發展計劃項目(20165016)。

TS255.3

A

1002-0306(2016)22-0344-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.22.059