siVEGF增敏吉西他濱對人膀胱癌小鼠移植瘤的治療作用

范海濤 馮樹強 張 明 田文杰 楊 瀟

(吉林大學第二醫院泌尿外科,吉林 長春 130041)

siVEGF增敏吉西他濱對人膀胱癌小鼠移植瘤的治療作用

范海濤 馮樹強 張 明 田文杰 楊 瀟

(吉林大學第二醫院泌尿外科,吉林 長春 130041)

目的 探討血管內皮生長因子小干擾RNA(siVEGF)增敏吉西他濱(GEM)對人膀胱癌T24細胞株在小鼠膀胱成瘤情況的影響及其對瘤細胞生長的治療作用。方法 采用細胞移植法分別把經過處理(治療組)和未經過處理(對照組)的T24細胞接種到小鼠膀胱內，然后用256排極速CT定期檢測，并在28 d時處死動物稱瘤重量，測定瘤體積，進行組織病理學和細胞學檢查。結果 治療組和對照組的成瘤率分別為40%(6/15)和93%(14/15)，治療組瘤細胞生長速度明顯低于對照組(P<0.05)。兩組腫瘤重量和體積比較差異有統計學意義(P<0.05)。組織病理學和細胞學檢查結果顯示，治療組移植瘤細胞增殖能力減弱，惡性度下降，瘤細胞生長轉移風險降低，而對照組則未出現相應的變化。結論 模擬人的小鼠膀胱癌原位模型更接近人體膀胱腫瘤的微環境和向膀胱腔內生長的特征，故更適合臨床膀胱癌的治療研究。推測靶向基因治療聯合細胞毒藥物的化療策略極有可能為提升目前臨床膀胱癌的治療水平和提高膀胱癌病人的生存率帶來幫助。

膀胱腫瘤；基因治療；細胞毒藥物

腫瘤微環境對腫瘤的發生發展有著至關重要的影響。研究膀胱癌的理想動物模型除應與人體膀胱癌在組織結構和生物學行為上相似外，腫瘤還應生長在膀胱腔內(原位生長)〔1,2〕。本實驗選用小鼠，把經過血管內皮生長因子小干擾RNA(siVEGF)表達質粒轉染并在其內加進細胞毒藥物吉西他濱(GEM)的人膀胱癌T24細胞和未經上述處理的人膀胱癌T24細胞分別接種到小鼠膀胱內，通過CT定期檢測兩種細胞的成瘤情況，通過腫瘤組織標本檢測瘤細胞的生物學行為。

1 材料與方法

1.1 一般材料 人膀胱癌細胞T24購于中國科學院上海細胞生物學研究所。siVEGF表達質粒轉染的T24細胞株由本實驗室構建并傳代保存〔3〕。GEM來自江蘇豪森藥物有限公司。小鼠購于中國醫學科學院中國協和醫科大學醫學實驗動物研究所，雌性30只，平均體重(150±72)g，飼養于恒定溫度(25℃～27℃)、恒定濕度(40%～50%)的SPF層流室中。

1.2 建立動物模型 按照參考文獻〔4〕建立人膀胱癌小鼠原位膀胱腫瘤模型。苯巴比妥鈉麻醉(30 mg/kg),無菌條件下8號導尿管通過尿道插入膀胱，100 μl 0.1 mol/L HCl處理后注入100 μl 0.1 mol/L KOH中和，磷酸鹽緩沖液沖洗，分別注入經siVEGF表達質粒轉染+GEM處理(治療組)和未經同樣處理(對照組)的T24細胞，濃度為每150 μl含1.5×106個細胞的平衡液(HBSS)，在膀胱內保留1 h后分別使小鼠仰臥和左右側變換體位共4次，30 min/次，以使HBSS液與整個膀胱腔黏膜充分接觸，2 h后拔管，備檢。

1.3 采用256排極速CT檢測小鼠膀胱成瘤情況 小鼠被麻醉后仰臥固定，經導管注入450 μl NaCl，以間距1 mm、層厚1.5 mm掃描成像。

1.4 組織病理學和細胞學檢查 對成瘤的21只小鼠在細胞移植后第28天處死并實時解剖，完整剝離出瘤塊，用游標卡尺測定腫瘤大小并稱重，顯微鏡觀察確認瘤細胞分級和瘤細胞生長浸潤狀況。

1.5 統計學方法 應用SPSS19.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1 小鼠成瘤狀況 對照組在T24細胞移植后第7天出現腫瘤，而治療組第13天才檢測到腫瘤，第28天時處死所有成瘤小鼠，切取腫瘤稱重并計算瘤體積。對照組小鼠腫瘤重量為(3.9±0.7)g，體積(1895±273)mm3；治療組分別為(2.3±0.6)g，(1 207±148)mm3，兩組瘤重和瘤體積比較均有統計學意義(P<0.05)，表明siVEGF和GEM聯用對腫瘤生長具有明顯的抑制作用。對照組和治療組的成瘤率分別為93%和40%，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2 小鼠成瘤模型生長變化 CT檢測對照組和治療組，分別在T24細胞移植后第7天和第13天見到腫瘤結節，隨著時間的延后，腫瘤向膀胱腔內生長和向黏膜下浸潤現象愈加明顯，提示瘤細胞增殖能力逐漸增強，惡性度逐漸增大，這種變化與處死后動物的組織病理學檢查結果相吻合。

2.3 細胞學檢查 移植的人膀胱癌細胞株T24特征包括有絲分裂相、高核質比和多型核，這些與未移植前的T24細胞幾乎一致。以中度分化為主的細胞多向腔內生長，而以低分化為主的細胞則多向黏膜層呈浸潤性生長。腫瘤細胞分級(按世界衛生組織標準)：對照組G1級5只，G2級8只，G3級2只；治療組G1級4只，G2級2只。臨床病理分期(按國際抗癌協會標準)：對照組T1期3只，T2期9只，T3期3只；治療組T1期4只，T2期2只。提示治療組瘤細胞惡性程度降低，浸潤轉移能力減弱；而對照組瘤細胞惡性度依舊，其固有的惡性特征——浸潤轉移的能力沒有改變。

3 討 論

本文按照參考文獻〔4〕所述方法步驟建立的小鼠膀胱癌原位動物模型與人體膀胱癌的發生發展過程以及生物學行為大體一致，從原位癌的發生、生長、浸潤以及轉移的全過程中，可以捕捉到膀胱癌發生發展的一些生物學行為規律，更適合新抗癌制劑治療效果的客觀評價。與非原位模型(例如：皮下移植瘤)相比，原位膀胱癌動物模型能更好地模擬人膀胱癌的生物學行為。隨著動物膀胱癌原位模型逐漸成熟，其應用空間也擴大到了藥物開發、藥物臨床試驗〔5〕。這為更好地開展動物實驗研究奠定了堅實的基礎，亦將為推廣在臨床實際應用提供強有力的實驗依據。由于本實驗選用小鼠構建的動物原位膀胱腫瘤模型有別于以往的皮下移植瘤，也更優于不具有免疫功能的裸鼠腫瘤模型，故這可能更適合人類膀胱腫瘤的治療研究。

本研究結果亦顯示，動物膀胱癌原位模型能較好地模擬人的膀胱癌生長方式，因此被廣泛認為不僅是觀察評價抗癌生物制劑和抗癌化學藥物的理想方法，而且對進一步闡明人體膀胱癌的生長轉移，甚至治療后復發的機制也有一定幫助。另外，由于膀胱獨特的解剖特點，經尿道直接灌注藥物治療膀胱癌的方法是目前公認的優于其他給藥途徑的方法。這是因為首先給藥方便，保留時間易于人為控制，能使藥物發揮并達到最佳的治療效果；其次藥物無須穿過血管屏障及腫瘤局部的高組織間隙壓力屏障，這大大提高了藥物與靶細胞的結合率；最后避免了血液循環系統對藥物的稀釋和非特異性攝取導致的藥量有效濃度遞減和可能誘發的損傷性免疫反應。故建立動物小鼠膀胱癌原位模型并進行治療實驗將成為基礎與臨床研究的重要方面和相互連接的橋梁。

另外，本文數據表明， siVEGF+GEM治療使人膀胱癌細胞株T24在小鼠膀胱內成瘤率低，生長緩慢，惡性度降低，浸潤轉移能力減弱，這與以往的單純基因治療效果相比〔6,7〕似有更大優勢。也許抗血管生成的基因靶向治療和細胞毒藥物的化療聯合治療方案將為提高目前膀胱癌的治療水平和病人的5年生存率帶來新的幫助〔8,9〕。

1 Giubellino A,Woldemichael GM,Sourbier C,etal.Characterization of two mouse models of metastatic pheochromocytoma using bioluminescence imaging〔J〕.Cancer Lett,2012;316(1):46- 52.

2 Arentsen HC,Hendricksen K,Oosterwijk E,etal.Experimental rat bladder urothelial cell carcinoma models〔J〕.World J Urol,2009;27(3):313- 7.

3 范海濤，楊 瀟，郭 航，等.VEGF siRNA和吉西他濱聯用對膀胱尿路上皮癌T24細胞株增殖和凋亡的影響〔J〕.中國實驗診斷學，2016;20(11):1830- 3.

4 Cozzi PJ,Malhotra S,McAuliffe P,etal.Intravesical oncolytic viral therapy using attenuated,replication- competent herpes simplex viruses G207 and Nv1020 is effective in the treatment of bladder cancer in an orthotopic syngeneic model〔J〕.FASEB J,2001;15(7):1306- 8.

5 Xiao Z，Brown K，Tulip J,etal.Whole bladder photodynamic therapy for orthotopic superficial bladder cancer in rats:a study of intravenous and intravesical administration of photosensitizers〔J〕.J Urol,2003;169(1):352- 6.

6 Hernández V,De LaPena E,Martin MD,etal.External validation and applicability of the EORTC risk tables for non- muscle- invasive bladder cancer〔J〕.World J Urol,2011;29(4):409- 14.

7 Zhang JL,Cheng Q,Zhou Y,etal.Slug is a key mediator of hypoxia induced cadherin switch in HNSCC:Correlations with poor prognosis〔J〕.Oral Oncol,2013;49(11):1043- 50.

8 Khadim MT,Ahmed SA,Khan FA,etal.Evaluation of vascular endothelial growth factors A,C and D as indicators of lymphangiogenesis and angiogenesis in invasive and non- invasive urothelial carcinoma bladder〔J〕.J Pak Med Assoc,2015;65(8):851- 6.

9 Mazzola CR,Chin J.Targeting the VEGF pathway in metastatic bladder cancer〔J〕.Exp Opin Investig Drugs,2015;24(7):913- 27.

〔2017- 05- 11修回〕

(編輯 袁左鳴)

吉林省自然科學基金項目(No.20150101195JC)

張 明(1963- )，男，主任醫師，主要從事泌尿系統腫瘤的防治研究。

范海濤(1974- )，男，副教授，博士，主要從事膀胱腫瘤的防治研究。

R737.14

A

1005- 9202(2017)15- 3648- 02；

10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.004