甘藍型油菜異三聚體G蛋白原生質體瞬時表達體系的建立

陳 云，于一帆，潘淑芬，周 研，葛會敏，劉立軍

(揚州大學 江蘇省作物遺傳生理重點實驗室，江蘇 揚州 225009)

甘藍型油菜異三聚體G蛋白原生質體瞬時表達體系的建立

陳 云，于一帆，潘淑芬，周 研，葛會敏，劉立軍

(揚州大學 江蘇省作物遺傳生理重點實驗室，江蘇 揚州 225009)

為建立甘藍型油菜異三聚體G蛋白各組分原生質體瞬時表達體系，以油菜葉片為試材，從試材選取、平搖時間和聚乙二醇濃度方面優化了油菜原生質體制備條件和轉化條件。結果表明，選取30 d苗齡葉片、平搖10 min時原生質體游離狀態最佳，產量為10.73×106/mL，活力可達96.4%。采用30% PEG轉化原生質體時，目的蛋白表達量最高。 Western Bolt的檢測分析表明，異三聚體G蛋白各組分均參與了甘藍型油菜對ABA的應答反應，當ABA濃度分別為100，150，100，50 mmol/L時，BnGA1、BnGB1、BnGG2和BnRGS1蛋白的表達量最高。

油菜；原生質體瞬時表達；異三聚體G蛋白

異三聚體G蛋白(簡稱G蛋白)介導的信號轉導途徑是真核生物最為保守的信號轉導途徑之一。G蛋白包括3個亞基(Gα、Gβ和Gγ)以及1個G蛋白調節蛋白(RGS蛋白)。目前，已經在擬南芥、水稻、玉米、大豆、油菜等十幾種植物中發現了G蛋白。在模式植物擬南芥和水稻中的研究表明，G蛋白參與了植物生長發育的諸多過程，包括種子萌發、側根和頂端鉤形成、下胚軸生長、葉片伸展，在植物響應生物和非生脅迫中起著十分重要的調節作用[1-2]。Gao等[3-5]于2010年先后在甘藍型油菜中分離和鑒定出了G蛋白的α亞基、β亞基和γ亞基，江蘇省作物遺傳生理重點實驗室于2013年鑒定出了BnRGS1蛋白[6]。通過分析G蛋白組分在不同生長時期的表達特征，以及外源激素處理后G蛋白表達的變化，發現G蛋白在不同組織器官和不同生長時期表達均有差異，各個亞基在響應激素信號時其表達水平有差異，但有關G蛋白參與這些途徑的作用機制缺乏深入研究。本試驗在前期已經克隆得到G蛋白相關基因及獲得相應抗體的工作基礎上，優化了油菜原生質體分離方法，建立了G蛋白組分的原生質體瞬時表達體系，并應用以上體系，采用Western Blot檢測方法，初步分析了G蛋白對脫落酸(ABA)的響應。以期為進一步深入闡明G蛋白在油菜中的生理功能提供理論和實踐依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試植物材料為甘藍型油菜(Brassicanapus)揚油6號，種子經4 ℃春化48 h后，播種于土壤中，置于恒溫23 ℃、光照/黑暗 16 h/8 h的培養箱中生長，選取生長一定葉齡的油菜葉片作為提取原生質體的外植體材料。轉化用G蛋白組分基因(BnGA1、BnGB1、BnGG2和BnRGS1)重組質粒為江蘇省作物遺傳生理重點實驗室構建留存。

1.2 試驗方法

1.2.1 油菜原生質體的提取和轉化 取40～50株植株，將其完全展開的葉片切成0.5～1.0 mm的小段，置于預處理液中，預培養20 min后，置于30 mL酶解液(0.25%纖維素酶，0.05%離析酶，0.6 mol/L甘露醇)中，25 ℃黑暗培養16 h，在水平搖床上40 r/min平搖以釋放原生質體。收集原生質體，用10 mL Wash溶液(0.154 mol/L NaCl，0.125 mol/L CaCl2·2H2O，0.005 mol/L KCl，0.005 mol/L葡萄糖，pH值 5.8)洗滌，1 000 r/min離心5 min沉淀原生質體。用10 mL預冷的Wash溶液重懸原生質體，冰浴30 min，1 000 r/min離心5 min。最后用500 μL MMG溶液(10.93% 甘露醇，0.304% MgCl2，4% MES)重懸原生質體。使用血球計數板進行計數。

將20 μg DNA，200 μL原生質體，200 μL PEG/Ca2+溶液(9.1% 甘露醇，10% CaCl2，30% PEG 4000)輕輕混勻，室溫放置15 min。用W5溶液(154 mmol/L NaCl，125 mmol/L CaCl2，5 mmol/L KCl，2 mmol/L MES，pH值5.7)洗過后重懸于預先用5%牛血清白蛋白包被過的含200 μL WI溶液(0.5 mol/L 甘露醇，4 mmol/L MES-KOH，pH值5.7，20 mmol/L KCl)的12孔板中，室溫溫育2 h以使質粒轉化。

1.2.2 原生質體產量和活力測定 用W5溶液將純化的原生質懸浮液稀釋至一定倍數，取10 μL滴在0.1 mm 血球計數板上，在10倍物鏡下觀察和統計原生質體的數量，重復3次。每毫升原生質體數量=4個大方格中細胞數之和×2 500×稀釋倍數。

取10 μL純化的原生質體與10 μL 0.02% FDA(熒光素雙醋酸)慢慢混勻，室溫靜置10 min，在ZEISS倒置熒光顯微鏡下檢查原生質體活力。制備良好，具有活力的原生質體呈圓形，發黃綠色熒光。統計每一視野中原生質體總數和具有活性的原生質體數，重復觀察20個視野。原生質體活力=發黃綠色熒光的原生質體數/總原生質體數×100%。

1.2.3 Western Blot 檢測蛋白表達量 收集原生質體加入蛋白提取液(1 mL PBS，20 μL廣譜蛋白酶抑制劑，10 μL PMSF，1 μL DTT)，4 ℃渦旋振蕩30 min，用BCA法測定蛋白質濃度。SDS-PAGE分離后，經轉膜、封閉、洗膜、雜交、洗膜、顯色后觀察條帶。油菜異三聚體G蛋白各組分蛋白抗體為本實驗室留存(制備方法：克隆目的基因的全長序列，轉入大腸桿菌DH5α，培養后提取質粒，交由北京華大蛋白質研發中心有限公司制備抗體)。

2 結果與分析

2.1 油菜原生質體制備體系的優化

根據已經報道的擬南芥[7-8]和油菜[9-11]原生質體分離方法，制備獲得了活力為70%的原生質體。為了進一步提高原生質體活力和產量。本試驗探討了材料選取和平搖時間對原生質體提取的影響。

2.1.1 不同苗齡油菜葉片對原生質體產量的影響 原生質體的產量和活力受很多因素的影響，其中苗齡很重要。選取的材料從7 d的幼苗或下胚軸到30 d的葉片都有過報道，相對應的依據也不盡相同，有的認為選取幼嫩的組織細胞更容易破碎，原生質體更易釋放，有的則認為以苗齡更大一些的葉片為試材提取原生質體不易破碎[12-14]。本試驗就試材選取的時期做了如下對比：

在保持酶解條件一致的前提下，選取土培20 d的扇形葉片(圖1-A)作為材料提取原生質體，原生質體釋放不完全，大量原生質體仍然積聚在葉條中，且釋放出來的原生質體較小(圖1-B)。當選取土培30 d的鋸齒形葉片時，原生質體可以很好地釋放出來，光鏡下可以清晰看到分離良好并完整的原生質體，大小合適，產量可達10.22×106/mL(圖1-C)。因此，本試驗采用土培30 d的鋸齒形葉片為試材。

2.1.2 酶解后平搖時間對原生質體產量和活力的影響 酶解后平搖是原生質體提取中的一項重要操作，通過低轉速(40 r/min)的平搖可以將原生質體從破碎的細胞中更好地釋放出來。

A.不同苗齡油菜葉片；B.原生質體形態；C.原生質體產量。A.Leaves of different seedling age；B.Morphology of protoplasts；C.Yield of protoplasts.

選取每5 min為1個時間間隔進行鏡檢，關注分離的原生質體數量及活力，結果顯示5 min時原生質體完整度高，但釋放不完全，產量只有1.64×106/mL；10 min時原生質體的數量最多(10.73×106/mL)，活力最高(96.4%)；20 min時原生質體數量沒有明顯增多，但是可以觀察到部分原生質體的圓度開始受到影響，甚至已經有部分原生質體開始破裂(圖2)，活力下降至69.7%。因此，10 min是制備原生質體較佳的平搖時間。

A.原生質體形態；B.原生質體產量；C.原生質體活力。A.Morphology of protoplasts；B.Yield of protoplasts；C.Viability of protoplasts.

2.2 PEG濃度對油菜原生質體轉化的影響

本試驗采用PEG/Ca2+法將質粒轉化進油菜原生質體，設置PEG濃度分別為10%，20%，30%，40%和50%，原生質體轉化后提取蛋白質(BnRGS1蛋白)經Western Blot檢測轉化效率。由圖3-A可以看到：隨著PEG濃度的增加，蛋白表達量先上升后下降，PEG濃度為30%時蛋白表達量最高。觀察濃度分別為30%，40%和50% PEG處理后的原生質體的形態，可以發現30% PEG處理后原生質體形態基本可以保持完整，少量發生破裂；40%濃度處理后原生質體發生皺縮，部分發生破裂；50%濃度處理后原生質體大量破裂，內容物流出(圖3-B)。因此，選取30% PEG濃度轉化效率最高。

采用30% PEG濃度，分別將含有BnGA1、BnGB1、BnGG2和BnRGS1的重組質粒轉化油菜原生質體，用Western Blot檢測其蛋白表達量。由圖4可以看出：內參Actin均可穩定表達，轉化原生質體中對應蛋白的表達量均高于野生型，說明質粒已成功轉入原生質體。

A.蛋白表達量；B.原生質形態。A.Expression of protein；B.Morphology of protoplasts.

圖4 Western Blot檢測轉基因原生質體中BnGA1、BnGB1、BnGG2和BnRGS1表達量Fig.4 Expression of BnGA1，BnGB1，BnGG2 and BnRGS1 proteins in transgenic protoplasts

2.3 BnGA1、BnGB1、BnGG2和BnRGS1對外源ABA的響應

ABA可以顯著促進BnGA1、BnGB1、BnGG2和BnRGS1基因的表達[3-6]，表明G蛋白組分參與了油菜對ABA信號的響應。本試驗用不同濃度的ABA處理轉基因原生質體24 h，用Western Blot檢測原生質體中G蛋白的表達情況。結果表明：BnGA1蛋白的表達量隨著ABA濃度增加而增加，在100 mmol/L ABA時達到最高，之后下降。BnGB1蛋白的表達量在ABA濃度為150 mmol/L時達到最高。低濃度的ABA(50～100 mmol/L) 時，BnGG2蛋白的表達量增加，在高濃度的ABA處理(150～200 mmol/L)下表達水平下降，在100 mmol/L ABA處理時表達量最高。BnRGS1蛋白表達量在ABA濃度為50 mmol/L時最大(圖5)。以上結果表明，G蛋白的各組分均參與了甘藍型油菜對植物激素的應答反應。

圖5 ABA處理對轉基因原生質體G蛋白組分表達的影響Fig.5 Effects of ABA on expression of components of G protein in transgenic protoplasts

3 結論與討論

本試驗目的是構建甘藍型油菜原生質體瞬時表達系統，為油菜異三聚體G蛋白功能研究提供研究載體。試驗采用酶解法提取油菜原生質體，PEG-Ca2+介導轉化原生質體。但是直接進行試驗操作時遇到了原生質體釋放不充分、原生質體大量嚴重破裂、轉化效率低等一系列問題。因此，在前人的基礎上，從試材的選取、酶解后平搖的時間和PEG濃度這幾個方面進行了條件優化。

無菌培養的幼苗子葉、下胚軸、黃化苗及生長不同時間的真葉都可以作為原生質體游離的外殖體[12-14]。利用下胚軸或黃化苗作為外殖體，當報告基因為GFP或熒光素基因時，可以有效避免葉綠素自發熒光的干擾。本試驗采用Western Blot檢測目標蛋白的表達量，不需考慮葉綠素自發熒光的干擾。

苗齡越大，葉片表面角質層和細胞壁發育越充分，葉片組織結構越緊密，不利于酶與細胞結構的接觸，而使酶解效率降低，原生質體產量較低。相反苗齡越小，細胞組織結構較疏松，酶解較充分，但產生的原生質體容易破裂，導致原生質體活力下降[15-17]。在擬南芥中，生長21～28 d的第5～7片真葉是提取原生質體最佳材料[8]。本試驗選取土培30 d左右的鋸齒形葉片進行原生質體提取，原生質體可以很好地釋放出來，產量可達10.22×106/mL。較幼嫩(20 d)葉片的原生質體釋放不完全，產量不高，且酶解釋放出的原生質體易破碎，活力低。

酶解后低速平搖可以促進原生質體的釋放[18]，由于沒有細胞壁的保護，機械搖晃對釋放出的原生質體可能造成損傷，致使破裂或活力下降。因此，合理控制平搖時間對原生質體的產量和活力有重要影響。在本試驗條件下，平搖10 min原生質體的產量和活力最高，是較佳的平搖時間。

PEG/Ca2+介導的原生質體轉化是原生質體瞬時表達最常用的方法。PEG濃度對轉化效率的影響因不同植物試材和不同外源DNA而異，濃度自20%～50%均有報道[19-21]。本試驗對甘藍型油菜研究的結果表明，PEG濃度為30%時轉化蛋白質的表達量最高，轉化后原生質體形態可以基本保持完整。因此，采用以上優化的條件進行試驗可以提取出完整度好、數量多的原生質體，轉化后在不破壞原生質體形態的情況下可以達到較高的轉化效率。

采用以上優化的條件，有效地分離了甘藍型油菜原生質體，成功轉化得到了油菜異三聚體G蛋白各組分的原生質體瞬時表達體系，經Western Blot檢測功能蛋白均有效表達，G蛋白各組分對ABA信號的響應存在劑量效應。上述測試結果為深入研究油菜G蛋白功能提供了良好的試材依據。

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Establishment of Heterotrimeric G Protein Gene Protoplast Transient Expression System in Brassica napus

CHEN Yun，YU Yifan，PAN Shufen，ZHOU Yan，GE Huimin，LIU Lijun

(Key Laboratory of Crop Genetics and Physiology of Jiangsu Province，Yangzhou University，Yangzhou 225009，China)

To establish the protoplast transient expression system of the components of heterotrimeric G protein inBrassicanapus，the key factors in protoplast preparation and transformation including explant，flat rolling time and polyethylene glycol(PEG) concentration were optimized.The results showed that the best yield and viability of protoplasts were 10.73×106/mL and 96.4% respectively，with the optimum conditions as 30 days seedling age and 10 min rolling time.The expression of target proteins reached the maximum with 30% PEG.The responses of G protein to ABA were investigated using the protoplast transient system by Western Blot detection.The highest expression levels of BnGA1，BnGB1，BnGG2 and BnRGS1 were observed when the ABA concentration was 100，150，100，50 mmol/L，respectively.

Brassicanapus；Protoplast transient expression；Heterotrimeric G protein

2016-07-22

國家自然科學基金項目(31371562；30970249)

陳 云(1973-)，女，江蘇東臺人，副教授，博士，主要從事植物生理與生化研究。

劉立軍(1973-)，男，江蘇泗陽人，教授，博士，主要從事作物栽培生理研究。

S565.03；Q819

A

1000-7091(2016)06-0021-05

10.7668/hbnxb.2016.06.004