番茄轉錄因子基因SlYAB2 a 的克隆、表達及亞細胞定位分析

胡廷章，秦 娟，陳再剛，黃小云

(重慶三峽學院 生命科學與工程學院，重慶 404100)

番茄轉錄因子基因SlYAB2 a 的克隆、表達及亞細胞定位分析

胡廷章，秦 娟，陳再剛，黃小云

(重慶三峽學院 生命科學與工程學院，重慶 404100)

為了研究番茄SlYAB2a基因的功能及其在番茄生長發育中的分子機理，以番茄的cDNA為模板，利用RT-PCR技術從番茄中克隆到SlYAB2a基因，該基因編碼的蛋白質由192個氨基酸殘基組成，蛋白質的分子量為21.35 kDa，等電點是8.79，平均親水系數是-0.487。SlYAB2a蛋白質的6～165位氨基酸殘基形成Pfam：YABBY結構域，在20～47位有1個C2C2鋅指結構域，在122～181位有1個螺旋-環-螺旋結構域。二級結構分析表明SlYAB2a蛋白分子中，α-螺旋占19.79%、β-折疊占14.06%、其余66.15% 為不規則卷曲。蛋白多序列比對表明SlYAB2a與馬鈴薯、林煙草、釀酒葡萄、大豆、擬南芥、甘藍型油菜、花藥野生稻、玉米和小麥YABBY2的一致性分別為98%，78%，71%，65%，64%，64%，58%，57%，57%，說明SlYAB2a蛋白與來源于雙子葉植物的YABBY2一致性較高，而與來源于單子葉植物的一致性較低。通過聚類分析發現YABBY2蛋白明顯分為單子葉和雙子葉2個亞類，SlYAB2a蛋白屬于雙子葉亞類，與馬鈴薯、潘那利番茄、絨毛狀煙草、林煙草等的YABBY2蛋白序列親緣關系較近。實時定量RT-PCR 分析結果表明，在番茄植物的不同生長發育時期，根、莖、葉、花、果實中，都有SlYAB2a基因表達；并且在花和青熟果實中，SlYAB2a基因表達水平遠遠高于其他組織。說明SlYAB2a基因在花和果實的發育過程中起著重要作用。洋蔥表皮細胞瞬時表達結果表明SlYAB2a蛋白定位于細胞核中。

番茄；SlYAB2a；基因克隆；表達分析；亞細胞定位

高等植物的葉和花屬于側生器官，極性建立的過程是側生器官形態建成中的核心問題，也是植物發育生物學研究的熱點。側生器官的形成起始于植物的頂端分生組織，器官分化過程中需要建立基-頂軸、近-遠軸和中-側軸3個體軸極性[1]。在側生器官發育中，近-遠軸分化非常關鍵，因此，這一過程的研究備受關注。在植物中已經分離出一系列在近-遠軸極性建立中起重要作用的基因。如MYB 家族中的PHAN和AS1 基因及其同源異型結構域-亮氨酸拉鏈蛋白基因PHB、PHV、REV促進近軸面分化；KAN 家族中KAN1、KAN2、KN3基因和YABBY 家族中的YAB2、YAB3、FIL、CRC基因與側生器官遠軸面的分化有關，這類基因的突變將導致側生器官極性分化功能喪失和異常側生分生組織形成[2]。

YABBY是種子植物特有的一類轉錄因子，在控制側生器官遠-近軸極性建立中發揮重要作用，參與植物葉、枝和花的發育[3]。已經從擬南芥[4-5]、水稻[6-7]、小麥[8]、玉米[9]、大白菜[10]、箭葉淫羊藿[11]、豌豆[12]、菜薹[13]等許多植物中分離到YABBY基因家族成員。YABBY家族基因編碼一段N端含有1個C2C2鋅指結構域且C端含有1個螺旋-環-螺旋YABBY結構域的轉錄因子[4]。擬南芥植物有CRC、FIL(YAB1)、YAB2、YAB3、INNER NO OUTER(INO)和YAB5 6個YAB基因家族成員，分為CRC、YAB2、FIL/YAB3、INO和YAB5 5個亞家族。根據基因的表達模式也將5個亞家族分為兩類：一類包含CRC和INO，它們只在花器官中表達；而另一類包括FIL、YAB2和YAB5，它們也在營養組織中表達[14]。酵母雙雜交研究表明，擬南芥營養組織表達的YAB2、YAB3和YAB5蛋白可以與SLK1、SLK2和SLK3蛋白互作，FIL、YAB3和YAB5與LUG 和LUH可以互作[15]。LUG-YAB復合物阻止KNOX在葉中表達，LUG-YAB也可以調節轉錄因子CUC活性，進而調節LAS基因；LUG-YAB復合物也調控KANs、ETT/ARF4基因。LUG-YAB復合物在保持葉的極性和分生組織活性上發揮作用[15]。

本試驗以番茄(SolanumlycopersicumMill.Cv.Ailsa Craig，AC++)為試材，根據查找到的SlYAB2a基因候選序列，克隆到SlYAB2a基因的cDNA序列，分析了該基因編碼的蛋白序列，進一步檢測了SlYAB2a基因的表達模式及其表達蛋白的亞細胞定位。

1 材料和方法

1.1 植物試材及其SlYAB2a基因的克隆

試驗在重慶三峽學院園藝植物生理生化實驗室進行，試驗時間為2014 年3-10 月。將番茄種子播種到裝有營養土的花缽中，于自然條件下生長。分別取番茄幼苗的根、莖、葉，以及成苗植株的成熟葉、花、青熟期果實和成熟紅果，用于提取RNA。

采用TRIzol法提取各個組織的總RNA，RNAase-Free H2O 溶解RNA，利用紫外分光光度計法測定其濃度和純度，用1.0%變性瓊脂糖凝膠電泳的結果判斷RNA的完整性。SuperscriptTMⅢ RNase H-Reverse Transcriptase kit(Invitrogen，USA)用于合成cDNA。

根據查找到的SlYAB2a(Accession No.AK328263) 基因的候選序列，采用在線工具(http：//www.bio-soft.net/sms/)預測基因序列的開放閱讀框(ORF)，在ORF 兩端設計擴增編碼區的上游引物YAB2a F(5′-CTTTTACTTCTAATTCTTCGATCCG-3′)和下游引物YAB2a R(5′-TAATTAATAGAGACCAATTGTTTTC-3′)，以番茄幼苗的cDNA為模板進行SlYAB2a基因CDS 序列的擴增。PCR 反應程序為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，32次循環；72 ℃延伸5 min。用1% 瓊脂糖凝膠電泳分離PCR擴增產物，回收預期大小的擴增產物進行克隆、轉化和測序鑒定。

1.2SlYAB2a序列分析及蛋白質結構分析

SlYAB2a基因核苷酸翻譯采用序列處理在線工具(http：//www.bio-soft.net/sms)，用SMART進行蛋白質的結構域分析(http：//smart.embl-heidelberg.de/)，氨基酸成分、蛋白分子量、等電點、不穩定系數、脂溶指數和親水系數利用在線工具(http：//web.expasy.org/protparam)，一致性和同源性計算利用NCBI網站GenBank數據庫的Blast程序(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，在線構建蛋白親水性圖譜(http：//ipsort.hgc.jp)、預測二級結構(http://www.ibi.vu.nl/programs)和預測蛋白的胞內定位(http：//wolfpsort.seq.cbrc.jp/)，多序列比對和進化樹構建采用在線工具(http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo)。

1.3 RT-PCR檢測SlYABa基因的表達

以cDNA為模板，用引物YAB2a qf(5′-ATCATC ATCCTCTTCTACAA-3′)和 YAB2a qr(5′-TTGCTTG CCTTTATCCTTTG-3′)進行定量PCR反應，擴增SlYAB2a基因片段的長度為165 bp。以番茄Actin基因作為內標基因同時進行定量PCR反應，參照GenBank中番茄的Actin序列(U60480)，設計引物ActinF(5′-TGAAATGTGACGTGGATATTAGG-3′)和ActinR(5′-TGAGGGAAGCCAAGATAGAGC-3′)，擴增的ACTIN1基因片段長度應為201 bp。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物和引物的特異性。定量PCR分析的反應體系和反應程序參考胡廷章等[16]的方法，所有PCR 反應都設3次重復。

1.4 SlYAB2a 的亞細胞定位

依據SlYAB2a基因序列，設計帶有酶切位點SacⅠ的上游引物YAB2a yf(5′-AATGCGAGCTCCTTTTAC TTCTAATTCTTCGATCCG-3′)和酶切位點BamH Ⅰ的下游引物YAB2a yr(5′- AATCGGGATCCATAGAG ACCAATTGTTTTC-3′)，擴增基因的編碼序列，克隆到pCAMBIA1301-GFP 載體的SacⅠ/BamH Ⅰ酶切位點之間，得到pCAMBIA1301-SlYAB2a-GFP重組表達載體。利用農桿菌EHA105介導的洋蔥表皮細胞的轉化[17]。28 ℃孵育24 h 后，用共聚焦顯微鏡(Nikon Eclipse TE2000-E)觀察和拍照，照片的分析和處理采用EZ-C1 software 軟件。

2 結果與分析

2.1 克隆SlYAB2a基因全長cDNA 序列

利用RT-PCR技術，從番茄幼苗中擴增出預期大小的序列片段(圖1)。測序結果表明，分離到的片段長度為 636 bp，與預測的序列一致。證明克隆到的片段為所需的目的片段，命名為SlYAB2a。

2.2 SlYAB2a蛋白質特性分析

利用生物學信息軟件分析SlYAB2a 蛋白質特性。番茄SlYAB2a包含1個579 bp讀碼框，編碼的蛋白肽鏈由192個氨基酸殘基組成，包含20 種氨基酸，其中Ser為27 個(14.1%)，遠遠高于第二的Ile和Pro(都為13 個，占6.8%)，含量最低是Trp，只有1個(0.5%)。蛋白肽鏈的分子量為21.35 kDa，等電點是8.79。蛋白的不穩定參數為59.30，屬于典型的不穩定蛋白；脂溶指數(Aliphatic index)為69.58，是脂溶蛋白。SlYAB2a蛋白的平均親水系數是-0.487。用在線網站http：//ipsort.hgc.jp構建的蛋白親水性圖譜也顯示該蛋白N-末端有2個疏水區域，C-末端有3個親水區域，且大部分區域親水性比較強，傾向于親水性的蛋白(圖2)。因此，該蛋白為親水蛋白。分析SlYAB2a蛋白的二級結構表明，SlYAB2a蛋白分子中，α-螺旋占19.79%、β-折疊占14.06%、其余66.15% 為不規則卷曲。亞細胞定位分析表明，SlYAB2a 蛋白定位于細胞核。

1.DNA分子量標準；2.RT-PCR擴增產物。1.DNA Marker；2.Product of RT-PCR.

圖2 SlYABa蛋白的疏水性/親水性分析Fig.2 Hydrophobicity/hydrophilicity profile of SlYAB2a

在NCBI上Blast 分析表明該蛋白與多種植物的YABBY2轉錄因子有較高同源性。對SlYABa 功能域結構分析表明，該蛋白質具有YABBY轉錄因子家族的結構特征，即在6～165位氨基酸具有Pfam：YABBY(PFAM accession number：PF04690)結構域，在靠近N端的20～47位氨基酸有1個C2C2鋅指結構域(SMART accession number：SM00184)，在靠近C端122～181位氨基酸有1個螺旋-環-螺旋結構域(SMART accession number：SM00674)(圖3)。

圖3 SlYAB2a基因的核苷酸序列及推測的氨基酸序列Fig.3 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of SlYAB2a gene

★.SlYAB2a；星號.完全相同的氨基酸殘基；冒號.高度保守的氨基酸殘基；圓點.不太保守的氨基酸殘基；破折號.為了實現更好的比對。GenBank 登錄號：擬南芥.NP_001077490；甘藍型油菜.XP_013710950；大豆.XP_006594909；釀酒葡萄.XP_010651638；番茄.XP_004241356；馬鈴薯.XP_006361110；林煙草.XP_009792037；玉米.ACG32970；花藥野生稻.XP_006650352；小麥.ABW80974。

★.SlYAB2a；Asterisk.Identical residues；Colon.Highly conserved residues；Dot.Weakly conserved residues；Dash.Gaps introduced for optimal alignment.The GenBank accession No.Arabidopsisthaliana.NP_001077490；Brassicanapus.XP_013710950；Glycinemax.XP_006594909；Vitisvinifera.XP_010651638；Solanumlycopersicum.XP_004241356；Solanumtuberosum.XP_006361110；Nicotianasylvestris.XP_009792037；Zeamays.ACG32970；Oryzabrachyantha.XP_006650352；Triticumaestivum.ABW80974.

圖4 SlYAB2a與其他植物YABBY2蛋白的氨基酸序列對比分析
Fig.4 Analysis of Alignment of deduced SlYAB2a protein with other YABBY2 proteins from plants

2.3 SlYAB2a蛋白序列的同源比對和系統進化樹分析

用不同植物來源YABBY2蛋白的氨基酸序列進行同源性比對分析，表明它們的同源性較高(圖4)。在靠近N端的鋅指結構域和在靠近C端的螺旋-環-螺旋結構域比較保守(圖3)。一致性分析表明SlYAB2a與馬鈴薯、林煙草、釀酒葡萄、大豆、擬南芥、甘藍型油菜、花藥野生稻、玉米和小麥YABBY2的一致性分別為98%，78%，71%，65%，64%，64%，58%，57%，57%。說明YABBY2與雙子葉植物YABBY2的一致性高，而與單子葉植物來源的一致性較低。

為了了解SlYAB2a蛋白與不同植物來源YABBY2蛋白間的親緣關系，構建了系統進化樹，結果表明：YABBY2蛋白分為明顯的2個亞類，即單子葉亞類和雙子葉亞類。SlYAB2a編碼的蛋白屬于雙子葉亞類，與馬鈴薯、潘那利番茄、絨毛狀煙草、林煙草等的YABBY2蛋白序列親緣關系較近(圖5)。

★.SlYAB2a；緊接在物種名后的為蛋白的GenBank上登錄號。★.SlYAB2a；The accession No.in GenBank is next to the scientific names of the organism.

2.4SlYAB2a在番茄組織中的表達

定量RT-PCR分析表明，在番茄幼苗的根、莖、幼葉，以及成苗植株的成熟葉、花、青熟果實和成熟紅果都能檢測到SlYAB2a基因的表達，說明SlYAB2a基因在番茄植株的不同組織中都能表達。但SlYAB2a在不同組織中的表達量存在很大差異。在番茄的根、莖中只有少量的表達，表達最低；而在花和青果中的表達遠遠高于其他的組織器官，分別達到根的74.76，39.90倍；特別是花中的最高，達到青果的1.87倍(圖6)。說明SlYAB2a基因在番茄植物的花和果實發育中起著重要作用。

2.5 SlYAB2a蛋白的亞細胞定位

通過農桿菌EHA105介導將載體轉化至洋蔥表皮細胞內，結果表明，被pCAMBIA1301-GFP 載體轉化的洋蔥表皮細胞內的綠色熒光分布在細胞膜、細胞質、細胞核中，在被pCAMBIA1301-SlYAB2a-GFP 載體轉化的洋蔥表皮細胞中檢測到綠色熒光只分布在細胞核中(圖7)，推測番茄SlYAB2a 蛋白定位于細胞核。

圖6 實時定量 RT-PCR 分析番茄SlYAB2a基因的表達模式Fig.6 Quantitative real-time RT-PCR analysis of the expression profiling of SlYAB2a gene

3 結論與討論

根據查找到的番茄SlYAB2a基因候選序列，采用RT-PCR技術從番茄中克隆到SlYAB2a基因的cDNA序列。其推測的蛋白質具有YABBY轉錄因子家族的結構特征，即有Pfam：YABBY結構域，在靠近N端有1個C2C2鋅指結構域，在靠近C端有1個螺旋-環-螺旋結構域。說明SlYAB2a屬于植物YABBY蛋白家族。同源性分析表明，與SlYAB2a同源性較高的YABBY2蛋白來源于馬鈴薯、林煙草、釀酒葡萄、大豆、擬南芥。系統進化樹分析表明，SlYAB2a與雙子葉植物的YABBY2蛋白親緣關系近，而與單子葉植物的YABBY2蛋白親緣關系相對較遠，與馬鈴薯YABBY2的親緣關系最近。亞細胞定位研究表明SlYAB2a蛋白定位于細胞核。進一步說明SlYAB2a屬于轉錄因子YABBY家族的YABBY2亞家族。

圖7 GFP 和SlYAB2a 基因分別在洋蔥表皮細胞中的瞬時表達Fig.7 The transient expression of GFP and SlYAB2a gene in onion epidermal cells

已有的研究表明，植物YABBY家族基因的表達模式各不相同，在植物發育和形態建成中具有不同的功能。FIL(YAB1)/YAB3和YAB5亞家族主要參與葉的形態建成，與雙子葉植物和單子葉禾本植物的葉片發生有關[8，18]。擬南芥FIL、YAB2、YAB3和YAB5基因主要在側生器官遠軸組織中表達，它們在激活薄層生成，抑制頂端分生組織生長以及葉邊緣形成中是不可或缺的[14，18]。擬南芥FIL是參與正調控和負調控的雙功能轉錄因子，控制側生器官的發育[19]。擬南芥FIL和YAB3基因突變引起包括葉序畸形的一系列缺陷表型[20]，異位表達FIL或YAB3基因引起遠軸型細胞的異常分化[5]。大白菜的BraYAB1-702基因在擬南芥中的異位表達，引起擬南芥葉彎曲，抑制SAM，延遲花期[10]。菜薹CtYABBY1是雄性不育的負調控基因，也是溫度敏感基因，低溫處理可以提高該基因的表達，恢復植物的繁殖能力[13]。小麥TaYAB1基因和野生葡萄VpYABBY1基因在擬南芥中的表達引起葉片近軸面細胞趨向于遠軸面的特征[8，21]。水稻YAB3是葉細胞生長和分化不可缺少的[7]；水稻TOB1屬于YAB3亞家族，在水稻小穗發育中起重要作用[22]。擬南芥CRC在蜜腺及心皮遠軸面中特異表達，控制蜜腺及心皮的發育[4，23]。豌豆CRC控制心皮、柱頭和蜜腺的發育[12]。花菱草基因EsCRC在心皮的發育和萼片的形成中起著重要作用[11]。水稻基因DROOPING LEAF(DL)屬于CRC/DL亞家族，DL突變體表現為心皮轉化為雄蕊和葉片的中脈缺失[6，24]。擬南芥INO在外珠被層表達，INO亞家族主要參與遠軸端外珠被的形態建成，在被子植物外被形成過程中起著關鍵作用[25]。已有的研究結果表明，YABBY家族基因在種子植物形態建成中發揮重要作用，YABBY參與植物側生器官葉和花的發育。

在本研究定量PCR分析結果表明，SlYAB2基因在番茄的根、莖、葉、花和果實中均有表達，但在花和青果中的表達明顯高于其他的組織器官。基因在組織器官中的表達與其行使的功能是密切相關的。當1個基因在某一組織或器官中特異表達或表達顯著高于其他部位時，該基因往往在這一組織或器官行使的功能是不可或缺的。由于YABBY家族基因在種子植物形態建成中發揮重要作用。因此，有理由相信SlYAB2a轉錄因子在番茄花和果實發育的調控中發揮重要的作用。下一步將通過轉基因技術，驗證SlYAB2a在植物體內的生理功能。

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Cloning，Expression and Subcellular Localization Analysis of SlYAB 2 a Gene from Tomato

HU Tingzhang，QIN Juan，CHEN Zaigang，HUANG Xiaoyun

(School of Life Science and Engineering，Chongqing Three Gorges University，Chongqing 404100，China)

In order to study the function and molecular mechanism ofSlYAB2ain growth and development of tomato.The cDNA sequence ofSlYAB2awas cloned from tomato by RT-PCR.Bioinformatics analysis showed thatSlYAB2aencodes a putative polypeptide of 192 amino acids with a calculated molecular mass of 21.35 kDa，a theoretical pI of 8.79，and a grand average of hydropathy value of-0.487.SlYAB2a protein was predicted to possess a Pfam：YABBY domain architecture at position 6-165，a C2C2zinc finger-like domain at position 20-47，and a helix-loop-helix domain at position 122-181.Secondary structure analysis revealed that SlYAB2a protein contains 19.79% α-helical domains，14.06% β-sheet domains，and 66.15% random coil.The analysis of protein multiple sequence alignments showed that the percent identity of the SlYAB2a with members of group YABBY2 fromSolanumtuberosum，Nicotianasylvestris，Vitisvinifera，Glycinemax，Arabidopsisthaliana，Brassicanapus，Oryzabrachyantha，ZeamaysandTriticumaestivumwere 98%，78%，71%，65%，64%，64%，58%，57% and 57%，respectively；which suggested the percent identity of the SlYAB2a with other members of group YABBY2 from dicotyledon was higher than that from monocotyledon.The analysis of phylogenetic relationship showed that YABBY2 was easily separated into two distinct subgroups，that was dicotyledon subgroup and monocotyledon subgroup.SlYAB2a belonged to dicotyledon subgroup and was most closely related to members of group YABBY2 fromSolanumtuberosum，Solanumpennellii，NicotianatomentosiformisandNicotianasylvestris.The expression ofSlYAB2awas determined by Real-time quantitative RT-PCR.The result showed that theSlYAB2agene was transcribed in different tissue organ.The expression level ofSlYAB2ain flowers and mature green fruits was much higher than that in any other analyzed tissue organs.These results suggested that SlYAB2a might be involved in flower and fruit development.Following transient expression of SlYAB2a in onion epidermal cells，SlYAB2a was found to be localized in the nucleus.

Tomato；SlYAB2a；Gene cloning；Expression analysis；Subcellular localization

2016-06-01

重慶市教育委員會科學技術研究項目(KJ131101)；重慶市萬州區科學技術項目(201403063)；重慶三峽學院科學研究計劃項目(15PY03)

胡廷章(1965-)，男，四川簡陽人，教授，博士，主要從事植物生理生化與分子生物學研究。

Q78；S641.03

A

1000-7091(2016)06-0076-07

10.7668/hbnxb.2016.06.012