RNA干擾敲低GSK-3β對瘢痕疙瘩形成影響的體外研究*

蔡玉梅， 朱世澤， 楊維群， 潘明孟， 王朝陽， 吳文藝

(1泉州醫學高等?？茖W校病理學教研室， 2福建醫科大學附屬第二醫院整形外科，福建 泉州 362000)

?

RNA干擾敲低GSK-3β對瘢痕疙瘩形成影響的體外研究*

蔡玉梅1， 朱世澤2△， 楊維群1， 潘明孟2， 王朝陽2， 吳文藝2

(1泉州醫學高等專科學校病理學教研室，2福建醫科大學附屬第二醫院整形外科，福建 泉州 362000)

目的： 利用RNA干擾技術探討糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)對人瘢痕疙瘩成纖維細胞(keloid fibroblasts，KFB)的抑制效果。方法: 將針對人GSK-3β基因設計合成的3對特異性小干擾RNA(siRNA)分別轉染體外培養的人KFB，通過RT-PCR和Western blot篩選出干擾人KFBGSK-3β基因表達的最佳siRNA，進而轉染人KFB，并用RT-PCR和Western blot檢測GSK-3β及相關蛋白的mRNA和蛋白表達。結果: 1434序列具有最佳的GSK-3β mRNA和蛋白抑制效率。轉染GSK-3βsiRNA后，KFB的β-catenin、細胞周期蛋白D1(cyclin D1)、p-GSK-3β和Wnt2的蛋白水平下降，KFB活力下降，且隨著培養時間的延長，細胞生長受抑制程度增大，細胞倍增時間明顯延遲。結論: 轉染靶向GSK-3β的siRNA可有效降低該基因在KFB內的表達，從而抑制了瘢痕疙瘩生長，具有潛在的治療前景。

糖原合成酶激酶3β； 瘢痕疙瘩； 成纖維細胞； RNA干擾

瘢痕疙瘩(keloid)是一種具有浸潤生長特性的病理性瘢痕，治療后復發率高，對該病的有效預防和治療一直是整形外科界迫于解決的難題。瘢痕疙瘩組織學特點為大量成纖維細胞增生，細胞外基質中膠原、蛋白多糖、糖蛋白等過度沉積，以Ⅰ、Ⅲ型膠原過度沉積為主，膠原纖維排列紊亂，從而導致真皮纖維化[1]。成纖維細胞是瘢痕疙瘩形成與增生的效應細胞。

糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)是一種保守絲氨酸/蘇氨酸激酶，存在于所有真核生物組織中[2]。GSK-3β最初被發現是參與糖原代謝的關鍵酶，但后來發現GSK-3β廣泛參與各種細胞功能的調節，包括代謝調節、基因表達調節及細胞骨架完整性的維持，也可促進成纖維細胞的增殖和活化，并增加膠原等細胞外基質的合成[3]。我們在體外研究轉染靶向GSK-3β的siRNA對瘢痕疙瘩成纖維細胞生長可能產生的影響，以期為Wnt信號通路中不同基因靶點和高特異性基因藥物的開發、瘢痕疙瘩的分子診斷及治療提供一個新的研究領域。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 標本來源 實驗標本來自福建醫科大學附屬第二醫院整形外科，取材部位為面部、胸背部、腹部或四肢等。由于受標本例數限制，瘢痕疙瘩10例，其中男4例，女6例，年齡2～55歲，平均年齡(30.00±18.83)歲，病程6～24月，平均(13.70±6.31)月，病因為外傷4例，手術3例，穿耳孔1例，感染2例。所取標本之患者無合并皮膚疾病、結締組織病和其它重要臟器器質性疾病，局部皮膚無潰瘍及感染；正常皮膚10例(取自瘢痕疙瘩周圍的正常皮膚或植皮患者取皮區的正常皮膚)，所有取材均獲得患者知情同意；所有標本均根據臨床和病理(HE染色切片的組織學檢查)診斷證實。

1.2 試劑和儀器 改良型1640培養基(HyClone)；胎牛血清和胰蛋白酶-EDTA溶液(Gibco)；Lipofectamin 2000轉染試劑(Invitrogen)；siRNA(Gene-pharma)；TRIzol 試劑(Invitrogen)；抗Wnt2抗體(1∶200)、抗β-catenin抗體(1∶200)、抗p-GSK-3β抗體(1∶200)和抗cyclin D1抗體(1∶200)均購自Santa Cruz；抗GSK-3β抗體(1∶500)(Ptglab)；HRP標記的山羊抗兔、小鼠IgG(1∶2 000)(Jackson)；增強型化學發光劑和M-PER蛋白提取試劑(Pierce)；PVDF膜(Millipore)；實時熒光定量通用試劑(上海吉瑪公司)。生物安全柜(上海上凈凈化設備有限公司)；熒光顯微鏡(Motic)； MX3000P實時熒光定量 PCR 儀(Stratagene)；PowerPacTMHC電泳儀(Bio-Rad)；VE-180 垂直電泳槽(上海天能)；DY-B1 脫色搖床 (上海滬西儀器)。

2 方法

2.1 細胞培養和實驗分組 組織塊貼壁法培養人瘢痕疙瘩成纖維細胞，細胞在37 ℃、5% CO2條件下用含10%胎牛血清的改良型1640培養基培養，每隔3～5 d換液1次。實驗取第3～6代成纖維細胞。實驗分為空白(blank)組、正常皮膚細胞(normal skin cell， normal)組、陰性對照(negative control， NC)組、無義序列siRNA轉染(scramble siRNA transfection， scramble)組和siRNA轉染組。

2.2 siRNA的設計、合成和篩選 根據Elbashir的設計原則，查找人GSK-3β基因序列(NM_019178)并設計3個siRNA序列(根據靶序列起始位置命名為siRNA1434、siRNA1814和siRNA2012)，見表1，由上海吉瑪制藥有限公司合成，序列經BLAST查詢，排除與其它基因同源。并通過RT-qPCR和Western blot檢測不同序列具有的GSK-3β mRNA和蛋白抑制效率。

表1 siRNA序列

2.3 siRNA轉染及轉染率觀察 取處于對數生長期的細胞常規消化后，制成單細胞懸液。血球計數板計數，將細胞稀釋至1.5×109/L，然后接種 6 孔板，混勻后于37 ℃、5% CO2條件下培養 24 h。 每一A260siRNA用150 μL DEPC-H2O溶解，終濃度約為20 μmol/L。 在1.5 mL EP管中加入250 μL Opti-MEM I，再加入8 μL siRNA，取另一個1.5 mL EP管，加入250 μL Opti-MEM I，加入5 μL Lipofectamine 2000，混勻，室溫放置5 min后將兩管混合，室溫靜置25 min。吸去培養液，每孔加入1 mL無血清的改良型1640培養液。 將轉染混合物逐滴加入6孔板中，混勻后，在培養箱中溫育4～6 h。吸棄轉染液，加入1.5 mL含10% FBS 的改良型1640培養液。37 ℃、5% CO2條件下繼續培養24 h或48 h后于熒光顯微鏡下觀察轉染陽性細胞數，計算細胞轉染率。細胞轉染率(%)=轉染陽性細胞數/細胞總數×100%。

2.4 RT-PCR測定mRNA 的表達 從細胞中提取總RNA，逆轉錄后，cDNA直接用于PCR擴增，擴增時設計合成的β-catenin、Wnt2、GSK-3β和cyclin D1引物序列見表2。擴增后的PCR產物行瓊脂糖凝膠電泳,每個基因每個樣品設置3個復孔。

表2 RT-PCR的引物序列

2.5 Western blot檢測蛋白 提取細胞總蛋白，SDS-PAGE考馬斯亮藍染色觀察蛋白電泳，電轉儀將蛋白質轉移至PVDF膜上。分別加入相應的I抗和II抗?；瘜W發光檢測系統顯影、定影后，膠片用凝膠成像分析系統拍照，使用Gel-Pro Analyzer軟件分析處理β-catenin、Wnt2、GSK-3β和cyclin D1的蛋白表達情況，每個基因每個樣品做3個重復。

2.6 CCK-8檢測細胞活力 取處于對數生長期的細胞常規消化后接種于96孔板，每孔3×103個細胞，繼續培養12 h，分別于轉染前、轉染后24 h、48 h、72 h，傾去培養液，加入新鮮的培養基100 μL，每孔避光加入CCK-8試劑 10 μL，避光培養2.5 h，酶標儀450 nm波長測吸光度(A)值，每個基因每個樣品3個重復。

3 統計學處理

采用SPSS 12.0軟件進行統計分析，所有實驗數據用均數±標準差(mean±SD)描述。多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 siRNA轉染率測定

轉染陽性細胞胞質內可見大量綠色熒光，轉染效率為90%，見圖1。

Figure 1.siRNA transfection efficiency (×400). The positive cells transfected with green fluorescence.

圖1 siRNA轉染效率測定

2 不同GSK-3βsiRNA轉染后各細胞GSK-3β的mRNA表達水平

與陰性對照組相比，siRNA1434組轉染24 h后，GSK-3β的mRNA表達下降(P<0.05)，48 h時表達卻升高；siRNA1814組于24 h GSK-3β的mRNA表達升高，48 h則下降；而siRNA2012組2個時點均升高，見圖2。

3 不同GSK-3βsiRNA轉染后各組細胞GSK-3β的蛋白表達水平

siRNA1434組及正常皮膚組與陰性對照組相比，轉染24 h及48 h后，GSK-3β的蛋白表達均有下降，差異有統計學顯著性(P<0.05); siRNA1814組和siRNA2012組與陰性對照組相比，GSK-3β的蛋白表達均有下降，且48 h各組間差異有統計學顯著性(P<0.05);而空白組、無義序列siRNA轉染組與陰性對照組相比，差異無統計學顯著性，見圖3。

4 RT-PCR檢測RNA干擾后相關mRNA的表達情況

與陰性對照相比，GSK-3βsiRNA轉染組中β-catenin的mRNA表達上調，GSK-3β的mRNA表達下調，差異均有統計學顯著性(P<0.05)。Wnt2和cyclin D1的mRNA表達水平差異均無統計學顯著性，見圖4。

5 Western blot檢測RNA干擾后相關蛋白的表達情況

與陰性對照相比，GSK-3βsiRNA轉染組β-catenin、GSK-3β、cyclin D1、Wnt2和p-GSK-3β蛋白的表達均下調，差異有統計學顯著性(P<0.05)，見圖5。

6 CCK-8法檢測RNA干擾后KFB活力的變化

CCK-8實驗顯示轉染GSK-3βsiRNA導致KFB進入對數生長期后生長減慢，且隨著培養時間的延長，細胞生長受抑制程度增大，細胞倍增時間明顯延遲，見圖6。

Figure 2.After transfection with differentGSK-3βsiRNAs, the mRNA expression of GSK-3β in different groups was detected by RT-PCR. ACTB: β-actin. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC.

圖2 不同GSK-3βsiRNA轉染后各組細胞GSK-3β的mRNA表達水平

Figure 3.After transfection with differentGSK-3βsiRNAs, the protein expression of GSK-3β in different groups was detected by Wes-tern blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC.

圖3 不同GSK-3βsiRNA轉染后各組細胞GSK-3β的蛋白表達水平

Figure 4.After transfection withGSK-3βsiRNA, the mRNA expression of Wnt2, β-catenin, GSK-3β and cyclin D1 in different groups was detected by RT-PCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC.

圖4 轉染GSK-3βsiRNA后不同細胞組中相關mRNA的表達水平

討 論

GSK-3β是細胞內主要的絲氨酸/蘇氨酸家族激酶。GSK-3β基因的編碼產物是含433個氨基酸殘基和3個結構域的多功能激酶，ATP綁定在其肽鏈 N端，由7個反向平行的β折疊構成的桶狀結構和α螺旋之間，而 Arg96、Arg180 和 Lys205 3個帶正電的氨基酸組成的口袋結構為底物結合的核心位點，通過調控多種底物，成為眾多信號轉導通路的匯聚點，參與胚胎發育、細胞周期的調控、細胞分化與凋亡、細胞的運動與黏附及炎癥反應等多種生理過程，其活性異常與多種疾病的發生發展密切相關[4]。

本研究通過針對人GSK-3β基因設計合成特異性siRNA片段1434序列，此序列具有最佳GSK-3β的mRNA和蛋白抑制效率，同時設置含無關序列的隨機片段作為對照。轉染GSK-3βsiRNA后，CCK-8實驗顯示KFB進入對數生長期后細胞活力下降，且隨著培養時間的延長，細胞生長受抑制程度增大，細胞倍增時間明顯延遲。目前發現GSK-3β參與調節的信號通路主要有2條。(1)PI3K-AKT-GSK3β 信號通路：正常情況下，磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)被激活后，進而活化蛋白激酶B(protein kinase B，PKB;又稱AKT),活化的 AKT 與GSK-3β結合后,誘導GSK-3β向細胞膜轉位,使GSK-3β失活,進而影響GSK-3β下游底物，最終發揮其參與細胞增殖與分化及調節炎癥和免疫反應的作用[5]。同時，也有研究表明當GSK-3β上游的信號轉導分子受到抑制導致GSK-3β激活時，就會促進caspase家族的蛋白酶激活，降低核蛋白的分解與DNA鏈的剪裂，而造成細胞凋亡[6]。(2)Wnt 信號通路：Wnt信號通路參與并影響人體的胚胎發育和腫瘤發生、發展關鍵的生理、病理過程，而且在出生后機體的損傷與修復方面也起著重要作用[7]，GSK-3β是Wnt經典通路的關鍵成員。創傷等誘因激活Wnt蛋白表達分泌，活化了胞質內的散亂蛋白(Dishevelled，DSH or DVL)，使β-catenin不被GSK-3β磷酸化從而避免了泛素蛋白酶體對其識別和降解，進而在細胞質內積聚，當β-catenin在細胞質內積聚到一定濃度時，就移向胞核并與胞核內的T細胞因子/淋巴細胞增強子(T-cell factor/lymphoid enhancer factor，TCF/LEF)相結合，激活下游cyclin D1、c-myc、c-fos等靶基因轉錄而導致細胞異常增殖[8-9]。有研究表明在臨床腫瘤樣本中普遍檢測出GSK-3β的過度表達與活化，無論是化學性抑制劑介導的GSK-3β活性下調，還是RNA干擾介導的表達沉默均導致腫瘤明顯的生長抑制[10-11]。瘢痕疙瘩具有腫瘤的某些生物學特性，在細胞學上以細胞增生為主，劉歡等[12]也證實在瘢痕疙瘩中GSK-3β高表達，所以通過GSK-3βsiRNA片段抑制扮演“促瘤因子”角色的GSK-3β，使得PI3K-AKT-GSK3β 信號通路受阻，最終阻礙其發揮參與細胞增殖的作用。另一方面GSK-3β在 Wnt 信號通路中充當了“腫瘤抑制因子”的功能，胞質中的GSK-3β作為β-catenin 降解復合物中的開關分子，通過磷酸化β-catenin及泛素連接酶β-TrCP介導的泛素蛋白酶體通路，使其穩定性下降[13]，所以GSK-3β的失活將在核內外啟動 Wnt 信號途徑，Wnt2表達上升，但我們實驗結果又顯示KFB的p-GSK-3β和Wnt2蛋白表達下降，β-catenin和cyclin D1的mRNA和蛋白表達下降，這可能是p-GSK-3β的水平明顯降低，增強了GSK-3β及其復合體對β-catenin的磷酸化，促進了β-catenin的降解，導致游離β-catenin的表達下調，從而導致KFB從G1期向S期的阻滯，KFB生長受抑，倍增時間延長。相反的發現在其它研究中也有報道，在體內乳腺組織高表達無激酶活性GSK-3β的轉基因小鼠可誘發乳腺癌并伴有β-catenin和cyclin D1的高表達[14]，這是否提示有其它途徑影響了Wnt2的蛋白表達，抑制了Wnt 信號通路，有待于以后的實驗進一步研究?？傊?，本研究結果表明，通過RNA干擾敲低GSK-3β，能抑制成纖維細胞的生長及活化，從而抑制了瘢痕疙瘩生成。這為 Wnt信號通路不同基因靶點和高特異性基因藥物的開發、瘢痕疙瘩的分子診斷及治療提供一個新的研究領域。

Figure 5.After transfection withGSK-3βsiRNA, the protein expression of GSK-3β, Wnt2, p-GSK-3β, β-catenin and cyclin D1 in different groups. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC.

圖5 轉染GSK-3βsiRNA后不同細胞組中相關蛋白的表達水平

Figure 6.The changes of cell viability after transfection withGSK-3βsiRNA in different groups. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC.

圖6 轉染GSK-3βsiRNA后各組細胞活力的變化

[1] Wolfram D, Tzankov AP, Piza-Katzer H, et al. Hypertrophic scars and keloids: a review of their pathophysiology, risk factors, and therapeutic management[J]. Permatol Surg, 2009, 35(2):171-181.

[2] 張 斌， 李法琦. 糖原合酶激酶3β信號分子在心肌肥厚中的作用[J]. 中國病理生理雜志, 2010, 26(3):601-604.

[3] Doble BW, Woodgett JR. GSK-3: tricks of the trade for a multi-tasking kinase[J]. J Cell Sci, 2003, 116(Pt 7):1175-1186.

[4] Kim WY, Wang XY. GSK-3 is a master regulator of neural progenitor homeostasis[J]. Nat Neurosci, 2009, 12(11):1390-1397.

[5] 熊 濤， 屈 藝， 母得志. AKT-GSK3信號通路與缺血缺氧性腦損傷[J]. 醫學綜述, 2010, 16(23):3521-3524.

[6] De Laurenzi V, Melino G. Apoptosis: the little devil of death[J]. Nature, 2000, 406(6792): 135-136.

[7] Tanaka SS, Koji Y, Yamagnchi YL, et al. Impact of WNT signaling on tissue lineage differentiation in the early mouse embryo[J]. Dev Growth Differ, 2011, 53(7):843-856.

[8] Piao S, Lee SH, Kim H, et al. Direct inhibition of GSK-3β by the phosphorylated cytoplasmic domain of LRP6 in Wnt/β-catenin signaling [J]. PLoS One, 2008, 3(12):1754-1755.

[9] Wu G, Huang H, Garcia Abreu J, et al. Inhibition of GSK3 phosphorylation of β-catenin via phosphorylated PPPSPXS motifs of Wnt coreceptor LRP6[J]. PLoS One, 2009, 4(3):e4926.

[10]Watanabe M, Abe N, Oshikiri Y, et al. Selective growth inhibition by glycogen synthase kinase-3 inhibitors in tumorigenic HeLa hybrid cells is mediated through NF-κB-dependentGLUT3 expression[J]. Oncogenesis, 2012, 1:e21.

[11]Zhou W, Wang L, Gou SM, et al. ShRNA silencing glycogen synthase kinase-3 beta inhibits tumor growth and angiogenesis in pancreatic cancer[J]. Cancer Lett, 2012, 316 (2):178-186.

[12]劉 歡， 郭 澍， 唐明睿， 等. GSK-3β在病理性瘢痕中的表達和意義[J]. 中國美容整形外科雜志, 2012, 5(23):318-320.

[13]Jacobs KM, Bhave SR, Frraro DJ, et al. GSK-3β: a bifunctional role in cell death pathways[J]. Int J Cell Biol, 2012, 2012:930710.

[14]Farago M, Dominguez I, Landesman-Bollag E, et al. Kinase-inactive glycogen synthase kinase 3β promotes Wnt signaling and mammary tumorigenesis[J]. Cancer Res, 2005, 65(13):5792-5801.

(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Effects of GSK-3β knockdown by RNA interference on formation of keloid in vitro

CAI Yu-mei1, ZHU Shi-ze2, YANG Wei-qun1, PAN Ming-meng2, WANG Chao-yang2, WU Wen-yi2

(1DepartmentofPathology,QuanzhouMedicalCollege,2DepartmentofOrthopedics,TheSecondAffiliatedHospitalofFujianMedicalUniversity,Quanzhou362000,China.E-mail:zhusz@fjmu.edu.cn)

AIM: To study the suppressive effect of glycogen synthase kinase-3β (GSK-3β) knockdown by RNA interference on the formation of keloid. METHODS: Human keloid fibroblasts (KFB)invitrowere transfected with 3 pairs of specificGSK-3βsmall interfering RNA (siRNA). The best siRNA to inhibit the GSK-3β expression in human KFB was screen by RT-PCR and Western blot. The expression of GSK-3β and related proteins at mRNA and protein levels in the KFB was determined by RT-PCR and Western blot.RESULTS: TheGSK-3βsiRNA1434 remarkably inhibited the expression of GSK-3β at mRNA and proteins levels in the human KFB. After transfection withGSK-3βsiRNA, the protein levels of β-catenin, p-GSK-3β, Wnt2 and cyclin D1 were all decreased. KFB growth became slow. With the extension of time, the inhibition of cell growth increased, and the cell doubling time was significantly delayed. CONCLUSION: siRNA targetingGSK-3βefficiently knocks down the expression ofGSK-3βin the human KFB, and inhibits the activation of Wnt signaling pathway, thus inhibiting the growth of keloid. GSK-3β may be a potential therapeutic target for keloid.

Glycogen synthase kinase-3β; Keloid; Fibroblasts; RNA interference

1000- 4718(2017)01- 0154- 07

2015- 11- 05

2016- 10- 14

福建省泉州市科技局重點資助科技項目(No. 2012Z70)； 福建省醫學創新課題(No. 2009-CX-21)

R363； R751

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.01.026

雜志網址： http://www.cjpp.net

△通訊作者 Tel: 0591-22862863； E-mail: zhusz@fjmu.edu.cn