APOL1基因變異的檢測及其與高血壓腎病的初步關聯研究*

陳 龍， 岑 東, △， 楊 律， 宋文慧， 陳其軍， 唐 莉， 呂建新△

(1溫州醫科大學浙江省醫學遺傳學重點實驗室，浙江 溫州 325027； 2寧波市泌尿腎病醫院，浙江 寧波 315100)

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APOL1基因變異的檢測及其與高血壓腎病的初步關聯研究*

陳 龍1， 岑 東1, 2△， 楊 律2， 宋文慧2， 陳其軍2， 唐 莉2， 呂建新1△

(1溫州醫科大學浙江省醫學遺傳學重點實驗室，浙江 溫州 325027；2寧波市泌尿腎病醫院，浙江 寧波 315100)

目的： 建立載脂蛋白 L1(APOL1)基因變異的檢測方法，初步觀察APOL1基因變異與高血壓腎病(HRD)的關聯性。方法: 檢索確認APOL1基因序列，設計第2～7外顯子的7對引物。提取人外周血樣本基因組DNA，行PCR擴增，擴增產物經瓊脂糖電泳鑒定、純化，行全基因測序。檢測10例HRD 患者APOL1基因，進行非同義突變的功能評價，分析其與HRD的關聯性。結果: 成功擴增了APOL1基因第2～7外顯子，測序證實含目標外顯子序列。10例HRD患者中發現APOL1基因變異2例，這些變異可能具有致病性。結論: 成功建立了APOL1基因的全基因測序方法。HRD患者存在APOL1基因變異，需積累病例進一步證實兩者關聯性。

載脂蛋白L1； 基因變異； 高血壓腎病

我國原發性高血壓的發病率呈上升趨勢，患病率達18.8%，其中老年人高血壓患病率已高達40%～60%，每年約100萬過早死亡與高血壓有緊密聯系[1]。高血壓腎病(hypertensive renal disease，HRD)是長期高血壓導致的常見嚴重并發癥之一[2]，并最終發展為終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)。HRD存在遺傳學因素，但相關研究較少，近年來通過混合連鎖不平衡繪圖分析發現，載脂蛋白 L1(apolipoprotein L1，APOL1)基因與HRD具有關聯性[3-5]。我們希望通過建立APOL1基因變異的檢測方法，結合臨床初步觀察APOL1基因變異與HRD的關聯性，現報告如下。

材 料 和 方 法

1 一般資料

檢索區域衛生信息化平臺，篩選登記的漢族高血壓患者(40歲以上)，結合實驗室指標：尿蛋白≥1+和血肌酐≥84 μmol/L(女)/104 μmol/L(男)，納入初選。調查患者病史，復查血壓，檢查眼底和(或)心臟超聲心動圖，檢測血/尿肌酐、24 h尿總蛋白和白蛋白、腎小球濾過率估計值(estimated glomerular filtration rate，eGFR)和尿白蛋白/肌酐比值，臨界者加做腎B超或穿刺，確認后納入實驗組。對照組納入標準為：(1) 40歲以上；(2)漢族；(3)無原發高血壓病史；(4)無繼發性高血壓、肥胖、心腦血管病、惡性腫瘤、內分泌性疾病史。納入初步關聯研究的高血壓腎病患者和對照者各10例，均無血緣關系。上述病例均經知情告知并簽署知情同意書。

2 主要材料與儀器

血液基因組 DNA 快速抽提試劑盒購自上海生工生物工程公司；PCR試劑盒和DNA膠回收試劑盒購自TaKaRa；引物合成和測序由深圳華大基因公司完成。7700 Prism序列檢測系統(ABI)；NanoDrop 2000C紫外/可見分光光度計(Thermo)；Tanon凝膠成像儀(上海天能公司)。

3 方法

3.1APOL1基因外顯子引物設計 通過PubMed檢索確認APOL1基因序列(NM_145343.2)。APOL1基因含7個外顯子，第1個外顯子無蛋白質編碼功能。采用Primer 5.0軟件，設計第2～7外顯子引物，委托深圳華大基因公司合成。

3.2 外周血基因組DNA的提取 采集EDTA-K2抗凝全血2 mL，采用血液基因組 DNA 快速抽提試劑盒提取外周血樣本基因組DNA：取300 μL抗凝全血，加入600 μL buffer TBP裂解紅細胞；加入180 μL buffer digestion和20 μL proteinase K裂解白細胞；等體積的異丙醇沉淀基因組DNA，75%乙醇漂洗；50 μL TE buffer溶解DNA，備用。

3.3APOL1基因的擴增 取外周血基因組DNA提取物，行PCR。20 μL反應體系：DNA提取物1 μL，10×PCR緩沖液2 μL，MgCl21.5 mmol/L，上、下游引物各0.4 μmol/L，dNTPs 1.6 mmol/L，Taq DNA聚合酶0.5 U。擴增條件：95 ℃ 1 min;95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，30個循環；72 ℃ 10 min。檢測擴增產物純度。

3.4 PCR產物的鑒定、純化與測序 PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，用Tanon凝膠成像儀觀察記錄電泳結果。采用DNA膠回收試劑盒純化目標DNA，委托深圳華大基因公司測序。

4 分析與評價

采用Mutation Surveyor 4.0.4軟件對測序資料進行連接和分析。采用Protein Variation Effect Analyzer (PROVEAN)、Sorting Intolerant From Tolerant (SIFT)和Polymorphism Phenotyping v2 (PolyPhen-2) 軟件進行非同義突變的功能評價。

結 果

1APOL1基因外顯子引物設計

根據APOL1基因序列(NM_145343.2)，因第1外顯子無蛋白質編碼功能故不設計引物，第2～6外顯子各設計1對引物，第7外顯子序列長度為883 bp，為便于檢測，設計2對引物，序列見表1。

表1 APOL1基因外顯子引物

F: forward; R: reverse.

2APOL1基因的擴增與測序

將APOL1基因各外顯子PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，發現均存在特異性條帶，與預期相符，見圖1。測序結果經Mutation Surveyor 4.0.4軟件處理，分別與APOL1基因(NM_145343.2)的第2～7個外顯子比對，均包含各外顯子序列。上述結果證實，已成功擴增APOL1基因第2～7外顯子。

Figure 1.PCR products of exons ofAPOL1 gene. 1: E2; 2: E3; 3: E4; 4: E5; 5: E6; 6: E7-1; 7: E7-2.

圖1APOL1基因外顯子PCR產物

3APOL1基因變異與高血壓腎病的關聯

10例實驗組測序結果經Mutation Surveyor 4.0.4軟件處理，發現2例存在APOL1基因突變：c.382 C>T， p.R128C； c.533 C>T， p.A178V。采用PROVEAN、SIFT和PolyPhen-2軟件進行非同義突變的功能評價均顯示為可能致病性，而對照組未發現APOL1基因突變，2組的一般臨床資料見表2。上述結果提示APOL1基因變異可能與高血壓腎病存在關聯。

討 論

APOL1基因位于染色體22q13.1，含7個外顯子，表達APOL1蛋白，具陰離子孔隙形成域、膜定位區域和α螺旋等3個結構和功能區域[5]，是唯一分泌至細胞外的APOL蛋白。研究發現，APOL1變異與錐蟲病、脂代謝紊亂、肥胖、精神分裂癥、腫瘤、慢性腎病等有關[6]。

表2 2組人群的臨床資料

eGFR: estimated glomerular filtration rate; β2-MG: β2-microglobulin; NAG:N-acetyl-β-D-glucosaminidase.

美國科學家在觀察美國非裔人群抗布氏錐蟲指名亞種感染時發現，APOL1基因變異會增強該人群對非糖尿病腎病的易感性，既與變異數量有關[7-9]，又與腎病進展高度相關[2,7]，慢性腎病更快進展為ESRD[3,8]，導致ESRD發病年齡更小[10]，但與血壓控制水平、糖尿病無關[11]。此外，還發現APOL1基因變異與美國非裔人群局灶性節段性腎小球硬化癥、HIV相關腎病、HRD、非糖尿病性ESRD相關[7-8]，但與糖尿病性ESRD無關[12-13]。同時，藥物治療對延遲具有APOL1基因變異的慢性腎病患者病情進展作用有限，且患者之間反應相似[9]。

相對于其它腎病[14-15]，HRD遺傳學研究較少，除與HRD確診困難有關外，主要原因在于尚未發現與其發病機制具有確定關聯的基因。近年來，隨著對APOL1基因變異的研究深入，其與HRD的關聯性日益得到關注，APOL1 G1/G2與非裔人群腎病易感性的關聯已被確認[2,7-8,10]。

為觀察我國漢族人群APOL1基因變異及其表達頻率與HRD相關性，我們通過建立APOL1基因外顯子全基因測序途徑來觀察其變異。除第1外顯子無蛋白質編碼功能不進行測序外，我們設計7對引物擴增第2～7外顯子并行測序，結果證實擴增產物中含目標外顯子序列，為APOL1基因變異檢測提供了技術保證。

臨床檢測發現，10例HRD中2例存在APOL1基因變異；非同義突變的功能評價提示這些變異可能具有致病性；但因病例較少，其變異頻率尚待證實。分別調查相應家族內HRD發病情況，將有助于明確APOL1基因變異的遺傳特征。此外，為了提高HRD初篩陽性率并考慮尿蛋白測定結果的影響因素，我們以尿蛋白≥1+者為粗篩納入標準，可能丟失尿蛋白為弱陽性的患者，此乃本研究不足之處。因此，計劃依托區域衛生信息化平臺，開展大樣本調查，同時根據診斷需要開展腎病理檢查，以期系統科學觀察APOL1基因變異發生頻率及與HRD的關聯性。與此同時，因腎病多為復雜多基因病，還計劃納入MYH9等基因，以期有助于HRD多基因病因的闡明。此外，在糖尿病腎病或其它類型腎病中是否也存在APOL1基因的變異？其發生頻率、關聯性和可能致病性如何？APOL1基因研究對腎病的發病機制、診斷和治療的價值尚需進一步證實。

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(責任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Establishment of whole-gene sequencing for APOL1 gene variations and its preliminary interconnection with hypertensive renal disease

CHEN Long1, CEN Dong1, 2, YANG Lü2, SONG Wen-hui2, CHEN Qi-jun2, TANG Li2, Lü Jian-xin1

(1ZhejiangProvincialKeyLaboratoryofMedicalGenetics,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325027,China;2NingboHospitalofUrologyandNephrology,Ningbo315100,China.E-mail:cengdong2002@163.com;jxlu313@163.com)

AIM: To establish whole-gene sequencing method for apolipoprotein L1 (APOL1) gene, and to examine a potential interconnection betweenAPOL1 variations and hypertensive renal disease (HRD) in Chinese Han population. METHODS: According to confirmed gene sequence, 7 pairs of primes forAPOL1 gene exons 2～7 were designed. Peripheral blood was collected and total genomic DNA was prepared for PCR. PCR products were purified and Sanger sequencing analysis was performed in 10 patients with HRD. Genetic variations were visualized and evaluated by Mutation Surveyor software. The association ofAPOL1 variations with HRD was evaluated. RESULTS: SixAPOL1 gene exons were amplified successfully, and their PCR products were identified to contain target sequences by sequencing.APOL1 gene exons 2～7 were amplified and variations were detected by Sanger sequencing. Two nonsynonymous mutations ofAPOL1 gene, c.382 C>T (p. R128C) and c. 533 C>T (p.A178V), were found in 2 of 10 HRD patients, and their functional impacts were predicted to be likely pathogenic.CONCLUSION: Whole-gene sequencing analysis showed that variants ofAPOL1 gene existed in Chinese Han HRD patients. It’s necessary to collect more samples to evaluate potential association betweenAPOL1 gene variations and HRD.

Apolipoprotein L1; Genetic variation; Variant; Hypertensive renal disease

1000- 4718(2017)01- 0170- 04

2016- 09- 26

2016- 11- 14

浙江省醫藥衛生科學研究基金資助項目(No. 2014KYB243)； 寧波市科技計劃(No. 2014C50015)

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.01.029

雜志網址： http://www.cjpp.net

△通訊作者 岑 東 Tel: 13858227718； E-mail: cengdong2002@163.com； 呂建新 Tel: 13857772708； E-mail： jxlu313@163.com