中藥黃芪指紋圖譜的研究進(jìn)展Δ

汪海斌，石巖，李芳，王德勝，魏鋒，馬雙成（.國(guó)家中藥材產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，安徽亳州36800；.中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 00050）

中藥黃芪指紋圖譜的研究進(jìn)展Δ

汪海斌1＊，石巖2#，李芳1，王德勝1，魏鋒2，馬雙成2（1.國(guó)家中藥材產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，安徽亳州236800；2.中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050）

目的：為中藥黃芪的質(zhì)量評(píng)價(jià)及深入研究提供參考。方法：以“黃芪”“指紋圖譜”“Astragali Radix”“Fingerpint”等為關(guān)鍵詞，組合查詢PubMed、中國(guó)知網(wǎng)、萬(wàn)方、維普等數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的2011－2016年發(fā)表的相關(guān)研究文獻(xiàn)，進(jìn)行歸納、總結(jié)和綜述。結(jié)果與結(jié)論：共檢索到相關(guān)文獻(xiàn)116篇，其中有效文獻(xiàn)38篇。黃芪主要含有皂苷類、黃酮類、多糖類等成分。黃芪指紋圖譜分析方法主要有色譜法（包括薄層色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等）、光譜法（包括紅外光譜法、核磁共振光譜法等）和分子生物學(xué)方法（包括簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間擴(kuò)增標(biāo)記方法等）。目前，黃芪指紋圖譜研究已從傳統(tǒng)的化學(xué)指紋圖譜研究領(lǐng)域，逐漸轉(zhuǎn)向了其指紋圖譜與藥效作用的相關(guān)性（譜效關(guān)系）研究領(lǐng)域。但該領(lǐng)域研究尚處于起始階段，還存在著諸多問(wèn)題亟待解決。

黃芪；指紋圖譜；研究進(jìn)展

中藥黃芪（Astragali Radix）為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.） Bge.var.monghoicus（Bge.）Hisao或膜莢黃芪 Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根[1]。其性溫，味甘，歸脾、肺經(jīng)，是傳統(tǒng)的補(bǔ)中益氣類中藥之一，具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、益衛(wèi)固表、托毒生肌和利水退腫之功效。現(xiàn)代藥理研究表明，黃芪有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、降血糖、利尿、抗疲勞、抗腫瘤等作用[2-3]。

黃芪藥材所含化學(xué)成分眾多，主要有皂苷類、黃酮類、多糖類等[4]。長(zhǎng)期以來(lái)，《中國(guó)藥典》中關(guān)于黃芪的質(zhì)量控制主要是測(cè)定其黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量，但是這種僅靠藥材中一個(gè)或兩個(gè)單一成分來(lái)評(píng)定其質(zhì)量的方法，忽略了藥材中多組分的協(xié)同作用，無(wú)法體現(xiàn)中藥質(zhì)量和療效的整體性。因此，對(duì)中藥這種多組分的復(fù)雜體系來(lái)說(shuō)，從多角度評(píng)價(jià)質(zhì)量的指紋圖譜分析技術(shù)是一種比較有效的方法[5]。本研究以“黃芪”“指紋圖譜”“Astragali Radix”“Fingerpint”等為關(guān)鍵詞，組合查詢PubMed、中國(guó)知網(wǎng)、萬(wàn)方、維普等數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的2011－2016年發(fā)表的相關(guān)研究文獻(xiàn)，進(jìn)行歸納、總結(jié)和綜述，以期為中藥黃芪的質(zhì)量評(píng)價(jià)及深入研究提供參考。

1 色譜法

1.1 薄層色譜（TLC）指紋圖譜

汪祺等[6-7]通過(guò)歸納總結(jié)2005年版《中國(guó)藥典》、中藥成方制劑標(biāo)準(zhǔn)及新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)等涉及黃芪的檢測(cè)方法，用甲醇回流提取，提取液蒸干后用AB-8大孔樹(shù)脂柱洗脫，洗脫液再用水飽和正丁醇萃取，以正丁醇-乙酸乙酯-水（4∶1∶5，V/V/V）的上層-甲醇（10∶1，V/V）為展開(kāi)劑，置氨蒸氣飽和的展開(kāi)缸內(nèi)展開(kāi)，以此分析了13批黃芪樣品皂苷類成分的薄層特征圖譜，4個(gè)特征成分黃芪甲苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ分離良好；并用醋酸乙酯回流提取，以氯仿-甲醇（10∶1，V/V）為展開(kāi)劑，分析了13批黃芪樣品黃酮類成分的薄層特征圖譜，結(jié)果4個(gè)特征成分毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、芒柄花素葡萄糖苷分離良好。

1.2 高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器（HPLC-DAD）指紋圖譜

李婷婷等[8]收集12批寧夏不同產(chǎn)地兩年生蒙古黃芪樣品，用甲醇超聲提取，以甲醇-乙腈-0.02 mol/L磷酸二氫鈉溶液梯度洗脫，254 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)研究其指紋圖譜，并用毛蕊異黃酮苷、刺芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花黃素進(jìn)行了定位，測(cè)定了毛蕊異黃酮苷和芒柄花黃素的含量，共找出了15個(gè)共有峰，樣品相似度符合要求。

李健等[9]收集10批南北不同產(chǎn)地的黃芪樣品，將樣品超微粉碎后經(jīng)80%乙醇提取，以甲醇-乙腈和水梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm，進(jìn)行指紋圖譜研究，共找出了12個(gè)共有峰，且聚類分析表明黃芪存在明顯的南北地域差異。李翔等[10]考察了不同色譜柱對(duì)黃芪樣品指紋圖譜的影響，采用甲醇超聲提取，乙腈-甲醇和水梯度洗脫，260 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，共找出了11個(gè)共有峰，且樣品相似度良好。殷文靜等[11]比較了勾兌前后黃芪藥材的指紋圖譜，以乙腈和0.2%甲酸梯度洗脫，260 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)勾兌后的8批黃芪藥材指紋圖譜相似度均在0.95以上，基本達(dá)到一致性。

劉敏[12]優(yōu)選黃芪藥材中黃酮類成分提取方法和梯度洗脫方法，確定了甲醇超聲40 min及體積分?jǐn)?shù)90%-5%乙腈梯度洗脫的方法，共找出了8個(gè)共有峰。覃紅萍、陳伯叢、張秋紅等[13-15]也運(yùn)用了HPLC-DAD法研究了不同產(chǎn)地黃芪中黃酮類成分的指紋圖譜，結(jié)果穩(wěn)定、可靠，說(shuō)明該法適用于黃芪中黃酮類成分的含量測(cè)定與指紋圖譜分析。

李桂蘭等[16]將12批黃芪藥材經(jīng)甲醇超聲后，以乙腈和水梯度洗脫，由于黃芪皂苷類成分僅在紫外末端具有吸收，故選擇208 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，指認(rèn)了芒柄花素和黃芪甲苷色譜峰的位置，共標(biāo)出了12個(gè)較大的共有峰，且根據(jù)指紋圖譜總結(jié)出了同產(chǎn)地不同年限黃芪中化學(xué)成分的變化規(guī)律。石玉娟[17]分析了14批山西道地黃芪藥材的指紋圖譜，以乙腈和水為流動(dòng)相，208 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)，共標(biāo)出了11個(gè)共有峰，且不同產(chǎn)地的藥材中黃芪甲苷均得到很好地分離。

宋肖煒等[18]以芒柄花素為內(nèi)參比峰，用甲醇超聲提取后，以乙腈和0.1%磷酸水溶液梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm，進(jìn)行指紋圖譜研究，共標(biāo)出了15個(gè)共有峰，并通過(guò)與對(duì)照品對(duì)照，對(duì)其中4個(gè)色譜峰進(jìn)行了定位。白根本等[19]比較了26批購(gòu)自全國(guó)不同地區(qū)的市售黃芪飲片，以乙腈和0.05%磷酸水溶液為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm，進(jìn)行指紋圖譜研究，共標(biāo)出了25個(gè)共有峰，發(fā)現(xiàn)飲片相互吻合程度較低，說(shuō)明市售黃芪飲片整體質(zhì)量的一致性欠佳。

另外，胡曉等[20]考察了黃芪藥材中皂苷類成分分析的色譜條件，選用Ultimate XB-C18柱，柱溫35℃，乙腈-0.5%磷酸梯度洗脫，205 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)，共找出了16個(gè)共有峰；所建立的方法可操作性強(qiáng)，適用于黃芪中皂苷類成分的指紋圖譜研究。

1.3 HPLC-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）指紋圖譜

杜國(guó)軍等[21]將黃芪藥材經(jīng)甲醇索氏提取后，以環(huán)黃芪醇、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素和黃芪甲苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ為對(duì)照品，使用ELSD檢測(cè)器，并經(jīng)乙腈和水梯度洗脫，研究了來(lái)自蒙古黃芪主產(chǎn)區(qū)的2種不同種植模式下的29批黃芪藥材的HPLCELSD指紋圖譜，共標(biāo)出了22個(gè)共有峰，經(jīng)分析后發(fā)現(xiàn)2種種植模式下的黃芪藥材得到了很好地區(qū)分。

邱莉等[22]將黃芪藥材用石油醚索氏回流除雜后，藥渣經(jīng)甲醇提取，提取液使用ODS C18柱進(jìn)行洗脫，以乙腈和水為流動(dòng)相，建立了黃芪藥材的HPLC-ELSD指紋圖譜，指認(rèn)出了14個(gè)共有指紋峰，標(biāo)定了其中5個(gè)指紋峰的結(jié)構(gòu)，且得出14批樣品相似度均在90%以上。

1.4HPLC-DAD-ELSD指紋圖譜

梁瑾等[23]采用HPLC-DAD-ELSD聯(lián)用法，將黃芪藥材用95%乙醇回流提取，以乙腈和水梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，漂移管溫度112.8℃，載氣流速3.2 L/min，進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果10批黃芪藥材HPLC-DAD指紋圖譜中共找到了14個(gè)共有峰，鑒別了毛蕊異黃酮和芒柄花素；HPLC-ELSD指紋圖譜中共找到9個(gè)共有峰，鑒別了毛蕊異黃酮苷、黃芪甲苷、黃芪甲苷Ⅱ、黃芪甲苷Ⅲ，且10批黃芪藥材相似度良好。

蘇碧茹等[24]將黃芪藥材經(jīng)甲醇回流提取，以乙腈和0.2%甲酸溶液為流動(dòng)相，建立了黃芪藥材的HPLCDAD-ELSD指紋圖譜，并在指紋圖譜中選擇了8個(gè)較大的共有峰作為變量指標(biāo)，經(jīng)化學(xué)模式識(shí)別分析有效直觀地區(qū)分了黃芪藥材及其相關(guān)樣品。

劉小花等[25]在對(duì)黃芪藥材全成分研究的基礎(chǔ)上，將黃芪95%提取液分為石油醚、乙酸乙酯、乙醇以及水4個(gè)部位，以乙腈和水梯度洗脫，分別應(yīng)用DAD和ELSD檢測(cè)器，建立了黃芪藥材不同極性部位的HPLC-DADELSD指紋圖譜，且運(yùn)用各部位共有峰峰面積計(jì)算了10批黃芪藥材各部位的相似度，結(jié)果相似度均＞90%。

王惠等[26]通過(guò)部分酸水解方法，采用正交試驗(yàn)選取最佳水解條件，將黃芪中多糖水解成可供分析的寡糖，運(yùn)用ELSD檢測(cè)器，建立了基于酸水解-親水作用色譜的黃芪多糖指紋圖譜，結(jié)果20批黃芪藥材的多糖指紋圖譜相似度為0.258～0.949，反映出黃芪多糖組成存在明顯差異；同時(shí)，運(yùn)用DAD檢測(cè)器，建立了RP-HPLC指紋圖譜，用于控制除黃芪多糖以外的其他成分，對(duì)上述20批黃芪藥材進(jìn)行了分析，實(shí)現(xiàn)了對(duì)黃芪藥材質(zhì)量的全面評(píng)價(jià)。

1.5HPLC-質(zhì)譜（MS）指紋圖譜

烏日汗[27]在研究民族植物學(xué)野外調(diào)查的基礎(chǔ)上，建立了一套代謝組學(xué)研究方法，研究了4種藥用黃芪——蒙古黃芪、膜莢黃芪、北蒙古黃芪和一個(gè)未鑒定種。通過(guò)HPLC-電噴霧（ESI）-飛行時(shí)間質(zhì)譜（TOF-MS）聯(lián)用法研究得到了15個(gè)黃芪樣品的代謝指紋圖譜，并鑒定出19個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)式，包括6個(gè)黃酮及其苷類化合物和13個(gè)三萜皂苷類化合物。

1.6 超高效液相色譜（UPLC）指紋圖譜

付娟[28]將黃芪藥材經(jīng)甲醇超聲后，以乙腈-異丙醇（7∶3，V/V）和0.1%甲酸溶液梯度洗脫，研究了蒙古黃芪和膜莢黃芪的UPLC-光電二極管陣列檢測(cè)器（PDA）指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)6批膜莢黃芪之間相似度較好，而蒙古黃芪各批次之間相似度不是很高，但圖譜整體特征基本一致。

芮雯等[29]在研究UPLC-PDA指紋圖譜的基礎(chǔ)上，首次建立了UPLC/四極桿（Q）-TOF-MS指紋圖譜研究方法，以0.1%甲酸-水為流動(dòng)相A、含0.1%甲酸的乙腈-異丙醇（7∶3，V/V）為流動(dòng)相B梯度洗脫，采用ESI離子源，在正離子與負(fù)離子模式下分別采集數(shù)據(jù)，掃描范圍m/z 100～1 000，霧化氣N2流速60 L/h，碰撞能量10～40 V，進(jìn)行檢測(cè)，選定22個(gè)共有峰作為特征峰，結(jié)合主成分分析（PCA），可以區(qū)分不同產(chǎn)地的黃芪藥材，并找出包括毛蕊異黃酮、芒柄花素、黃芪皂苷Ⅰ和Ⅱ等8個(gè)差異最大的化合物。

1.7 氣相色譜（GC）-MS指紋圖譜

高凡茸等[30]應(yīng)用GC-MS聯(lián)用法，將黃芪藥材70%乙醇提取游離糖進(jìn)行三氟乙酸（TFA）水解，水解產(chǎn)物經(jīng)乙酰化處理后檢測(cè)，探索建立速生黃芪與野生黃芪藥材的單糖指紋圖譜，結(jié)果野生黃芪中不同糖類成分的含量明顯高于速生黃芪，且2種黃芪可按指標(biāo)成分的比例進(jìn)行鑒別。

1.8 毛細(xì)管電泳色譜指紋圖譜

馬麗娟等[31]將黃芪飲片經(jīng)甲醇提取后，采用高效毛細(xì)管電泳色譜法（HPCE）進(jìn)行分析，以40 mmol/L硼砂-20 mmol/L硼酸-10%甲醇為電泳介質(zhì)，分離電壓20 kV，波長(zhǎng)為210 nm，建立其HPCE-DAD指紋圖譜，共找出了9個(gè)共有峰，指認(rèn)了其中的黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅰ和毛蕊異黃酮的位置。

劉楊等[32]通過(guò)應(yīng)用蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）技術(shù)，采用8種提取方法提取黃芪藥材中的水溶性蛋白，根據(jù)PAGE譜帶的多少和清晰度優(yōu)選建立黃芪藥材的蛋白質(zhì)指紋圖譜的蛋白提取條件，結(jié)果當(dāng)確定以雙蒸水為提取溶劑時(shí)，可辨識(shí)譜帶數(shù)目最多，清晰度較好，且指紋圖譜中各峰的分離度較高。

2 光譜法

2.1 紅外光譜指紋圖譜

周清等[33]利用傅里葉變換紅外光譜法（FTIR），將黃芪粉末和溴化鉀混勻壓片，采用經(jīng)氘化處理后的硫酸三甘肽晶體（DTGS）檢測(cè)器掃描，研究了黃芪藥材的紅外光譜指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地黃芪樣品的特征峰值分布差異較大，在1 000～1 800 λ/cm的峰值時(shí)特征性較強(qiáng)，依據(jù)這些特征峰值可對(duì)黃芪作出初步鑒別。李洪澤等[34]則通過(guò)山西同一產(chǎn)地不同生長(zhǎng)年限黃芪及不同產(chǎn)地同一生長(zhǎng)年限黃芪的FTIR研究，建立了山西地產(chǎn)黃芪的特征指紋圖譜。此方法比傳統(tǒng)的性狀鑒別法更具有科學(xué)性，比常規(guī)的光譜、色譜和質(zhì)譜法更快速、簡(jiǎn)便。

2.2 核磁共振光譜指紋圖譜

陳燕燕等[35]采用質(zhì)子核磁共振指紋圖譜（1H-NMR）技術(shù)對(duì)黃芪及其4種炮制品的化學(xué)成分進(jìn)行表征，探索建立了黃芪藥材的1H-NMR指紋圖譜，通過(guò)該指紋圖譜檢測(cè)并鑒定出21種化學(xué)成分，其中有8個(gè)氨基酸類化合物、4個(gè)有機(jī)酸類化合物，并結(jié)合偏最小二乘法判別分析（PLS-DA），揭示了不同炮制方法不僅影響黃芪藥材中黃酮類成分的含量，同時(shí)對(duì)氨基酸類和糖類成分浸出率的影響也十分顯著。Jung JY等[36]研究建立了去皮與未去皮黃芪藥材的1H-NMR和UPLC-MS指紋圖譜，結(jié)果鑒定出20種化學(xué)成分，且發(fā)現(xiàn)去皮黃芪藥材中異黃酮和皂苷的含量顯著降低。

3 分子生物學(xué)方法

張蔓等[37]利用簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間擴(kuò)增（ISSR）標(biāo)記方法，經(jīng)改進(jìn)的十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）提取法提取葉片總DNA，從120個(gè)ISSR引物中篩選出3個(gè)多態(tài)性引物分別對(duì)黃芪、紅芪樣品進(jìn)行DNA擴(kuò)增，建立了甘肅不同產(chǎn)地黃芪和紅芪樣品的ISSR指紋圖譜，結(jié)果檢測(cè)到黃芪、紅芪共擴(kuò)增出位點(diǎn)數(shù)23個(gè)，多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)16個(gè)。厚毅清等[38]則通過(guò)TIANGEN植物基因組DNA提取試劑盒提取黃芪和紅芪樣品的基因組，從101對(duì)簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）引物中篩選出6對(duì)有效鑒定物，標(biāo)記參試引物及對(duì)應(yīng)的特征泳帶，生成了黃芪與紅芪的指紋圖譜，為黃芪與紅芪的鑒別提供了依據(jù)。

4 結(jié)論

中藥為多組分的復(fù)雜體系，因此僅測(cè)定少數(shù)幾種有效成分或指標(biāo)成分，并不足以保證其質(zhì)量。與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，指紋圖譜分析技術(shù)能全面反映中藥的多種內(nèi)在化學(xué)成分的種類和數(shù)量，具有整體性、特征性及可量化等特點(diǎn)，彌補(bǔ)了單一化學(xué)成分質(zhì)量控制的弊端，可以最大程度地綜合評(píng)價(jià)中藥的內(nèi)在質(zhì)量。

目前，黃芪指紋圖譜研究已從傳統(tǒng)的化學(xué)指紋圖譜研究領(lǐng)域，逐漸轉(zhuǎn)向了其指紋圖譜與藥效作用的相關(guān)性（譜效關(guān)系）研究領(lǐng)域。但該領(lǐng)域研究尚處于起始階段，還存在著諸多問(wèn)題亟待解決，如：在藥效的有效性上大多采用西醫(yī)的計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)，而沒(méi)有與中醫(yī)理論密切結(jié)合；只體現(xiàn)了某個(gè)組分的藥效相關(guān)性，還未達(dá)到闡明復(fù)雜成分協(xié)同作用的高度；缺乏一個(gè)科學(xué)合理的數(shù)據(jù)分析方法系統(tǒng)，從而更加準(zhǔn)確地表明“譜”與“效”之間的關(guān)系。因此，如何科學(xué)、準(zhǔn)確地闡述黃芪的譜效關(guān)系機(jī)制，尚待進(jìn)一步的深入研究。

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R284.1

A

1001-0408（2017）33-4749-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.33.39

亳州市科技攻關(guān)項(xiàng)目（No.BK2015008）

＊助理工程師，碩士。研究方向：中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)。E-mail：1157838457@qq.com

#通信作者：副研究員，博士。研究方向：中藥及保健食品質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)。E-mail：san0373@163.com

（編輯：周 箐）

2017-03-25

2017-10-15）