塞來昔布減低HL-60和HL-60A細胞活力、誘導凋亡及抑制自噬*

陸 英， 劉相富， 劉玲玲， 林哲生， 陳玉嬋， 馮寶瑩， 張祥忠△

(中山大學附屬第三醫院 1輸血科， 2血液科，廣東 廣州 510630)

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塞來昔布減低HL-60和HL-60A細胞活力、誘導凋亡及抑制自噬*

陸 英1, 2， 劉相富1▲， 劉玲玲2， 林哲生1， 陳玉嬋1， 馮寶瑩1， 張祥忠2△

(中山大學附屬第三醫院1輸血科，2血液科，廣東 廣州 510630)

目的： 探討塞來昔布對急性髓細胞白血病(AML) HL-60細胞和HL-60A細胞的活力、凋亡及自噬的影響。方法: 用不同濃度的(0、20、40、60、80和100 μmol/L)塞來昔布作用于HL-60細胞和HL-60A細胞， 24 h、48 h和72 h后用MTT法檢測細胞活力。用流式細胞術檢測塞來昔布作用HL-60細胞和HL-60A細胞24 h后的凋亡率。用Western blot法檢測凋亡相關蛋白cleaved caspase-3、cleaved PARP，自噬相關蛋白LC3、P62，以及mTOR信號途徑相關蛋白。結果: 塞來昔布作用于HL-60細胞24 h、48 h和72 h的 IC50分別為49.4 μmol/L、32.0 μmol/L和25.1 μmol/L，對于HL-60A細胞，相應的 IC50分別是69.1 μmol/L、42.5 μmol/L和29.6 μmol/L。塞來昔布作用24 h后，流式細胞術檢測顯示HL-60細胞中Annexin-Ⅴ+PI-、Annexin-Ⅴ+PI+及Annexin-Ⅴ-PI+細胞的比例增多； HL-60A細胞中Annexin-Ⅴ+PI-及Annexin-Ⅴ+PI+細胞的比例增多。Western blot實驗結果顯示塞來昔布作用后，cleaved caspase-3和cleaved PARP的蛋白水平增高，提示該凋亡作用是通過caspase途徑的。自噬相關蛋白LC3Ⅱ及P62的表達均增加，mTOR、p-mTOR以及下游的4-EBP、p-4-EBP的蛋白水平沒有變化，說明塞來昔布能夠抑制AML細胞自噬，該作用與mTOR途徑無關。 結論: 塞來昔布對HL-60細胞和HL-60A細胞活力的抑制作用呈濃度以及時間依賴性，該作用與塞來昔布誘導細胞凋亡及壞死有關。塞來昔布能夠通過非mTOR依賴途徑抑制AML細胞自噬，有望聯合應用于AML的治療，有助于增強某些引起保護性自噬的化療藥物的細胞毒作用。

塞來昔布； 急性髓細胞白血病； 細胞凋亡； 自噬

急性髓細胞白血病(acute myeloid leukemia，AML)是一種造血系統的惡性克隆性疾病，是成人急性白血病中最常見的類型。近30年來，AML的標準治療方案為傳統的“ 3+7”方案，即3 d的蒽環類藥物加上7 d的阿糖胞苷。近年來隨著新藥的出現和治療方法的改進，白血病的完全緩解率有了明顯提高，但其多藥耐藥性以及較高的復發率仍是目前治愈白血病的主要障礙[1]。許多基礎以及臨床的研究報道了AML對蒽環類藥物以及阿糖胞苷耐藥[2-3]，因此探索新的治療方法以克服白血病細胞耐藥是AML研究的重要課題。

塞來昔布(celecoxib)是由Searle制藥廠研發的一種新型抗炎藥，1998年12月31日在美國上市，商品名為西樂葆，用于治療骨關節炎和類風濕性關節炎。近年來發現其具有抗腫瘤作用，美國FDA在2009年批準了塞來昔布治療家族性腺瘤性息肉病(familial adenomatous polyposis，FAP)，用于減少結腸和直腸癌的發病率[4]。另有研究表明塞來昔布對其它實體腫瘤包括肝癌、乳腺癌以及肺癌等均有增殖抑制作用[5-7]。有關塞來昔布對血液系統腫瘤作用的研究相對較晚，報道也相對較少。2004年研究者發現,與正常志愿者的淋巴組織相比，淋巴瘤組織細胞的COX-2水平增高2.2～4.3倍，選擇性COX-2抑制劑塞來昔布能夠抑制腫瘤細胞增殖，促進細胞凋亡，此作用呈時間和劑量依賴性[8]。2005年血液學權威雜志《Blood》發表了一項塞來昔布衍生物OSU03012治療慢性淋巴細胞白血病的實驗結果，此復合物可以同時通過線粒體依賴以及非依賴途徑促進白血病細胞的凋亡，而且此凋亡作用與Bcl-2無關[9]。此后相繼研究表明塞來昔布能促進多種AML細胞包括HL-60、NB4、MR2細胞的凋亡[10-12]。

細胞自噬(autophagy)是真核細胞利用溶酶體對自身細胞器及蛋白質進行降解的生物學過程[13]，是真核生物對細胞內物質進行周轉的重要形式。自噬在腫瘤細胞中的作用非常復雜，因其能夠同時抑制腫瘤的發生以及促進其存活而被喻為腫瘤發生發展過程中的雙刃劍，這種看似矛盾的作用與腫瘤類型、疾病分期及治療手段有關[14]。目前尚未見塞來昔布對血液系統腫瘤自噬作用的相關報道。本研究以HL-60細胞和HL-60A細胞為研究對象，首次探索塞來昔布對耐阿霉素的HL-60A細胞的生長抑制作用，以及其對AML細胞株自噬的影響。

材 料 和 方 法

1 試劑和儀器

塞來昔布購自Pfizer；RPMI-1640培養基購自Gibco；胎牛血清購自杭州四季青公司；氯喹、MTT、碘化丙啶(propidium iodide, PI)及RNase A購自Sigma。抗LC3、P62、mTOR、p-mTOR、4-EBP、p-4-EBP、cleaved caspase-3、cleaved PARP和GAPDH單克隆抗體均購自Cell Signaling Technology。細胞培養箱和酶標儀購自Bio-Rad；流式細胞儀購自BD。

2 細胞培養

HL-60細胞和HL-60A 細胞為中山大學附屬第三醫院血液實驗室保存。細胞接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中，置37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養箱中傳代培養，2～3 d換液1次。

3 方法

3.1 MTT法檢測細胞活力 取生長良好的HL-60細胞和HL-60A細胞，用新鮮培養基制成細胞懸液，接種于96孔板，每孔的細胞為10 000個，設3個復孔，每孔加入不同濃度的阿霉素或者塞來昔布。24 h、48 h和72 h后用MTT法檢測細胞活力，每孔加入5 g/L的MTT 20 μL，細胞培養4 h后棄去上清，加DMSO后，用酶標儀在490 nm波長處檢測吸光度(A)。細胞活力 (%)=實驗組A值/對照組A值×100%。

3.2 流式細胞術檢測細胞凋亡 收集藥物處理過的細胞懸液，離心去上清，用結合緩沖液重懸細胞，使細胞濃度為1×108/L。 取100 μL細胞加入5 μL 異硫氰酸熒光素(FTIC)標記的Annexin-Ⅴ 和5 μL PI，充分混勻，避光室溫孵育15 min。加入400 μL結合緩沖液，轉移至5 mL玻璃管，即刻用流式細胞儀進行分析。Annexin-Ⅴ+PI-為早期凋亡細胞；Annexin-Ⅴ+PI+為晚期凋亡細胞;Annexin-Ⅴ-PI+為壞死細胞。

3.3 Western blot法檢測相關蛋白 收集處理后的細胞，離心去上清，PBS洗滌1次，加入適量蛋白裂解液提取蛋白， 測定蛋白濃度，根據濃度計算出一定質量的蛋白所需體積，取等量蛋白，按比例加入loa-ding buffer，離心后100 ℃加熱10 min使之變性，保存于-20 ℃備用。 配制好SDS-PAGE膠，加上等質量的蛋白樣本，蓋上電泳槽蓋子電泳2 h，然后轉膜，再將含目的蛋白條帶的PVDF膜放入封閉液中室溫振蕩1 h，將封閉的PVDF膜裝入雜交袋中，然后加入配好的Ⅰ抗，封好膜后4 ℃孵育過夜，洗膜、封閉后Ⅱ抗室溫孵育1 h，發光液發光后顯影、定影。用ImageJ 2x軟件分析蛋白條帶的灰度。

4 統計學處理

SPSS 16.0 軟件進行統計學分析，數據用均數±標準差(mean±SD)表示。兩組間的比較用t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 塞來昔布對HL-60細胞和HL-60A細胞的增殖抑制作用

為驗證HL-60A細胞對阿霉素的耐藥性，首先檢測了阿霉素對HL-60細胞和HL-60A細胞活力的影響。利用 MTT法檢測不同濃度的阿霉素(0、0.1、0.2、0.4和0.8 mg/L)對2種細胞株的活力抑制作用。從圖 1可見，0.8 mg/L 阿霉素作用 24 h、48 h和72 h 后，HL-60細胞的活力分別為 23.4%±2.9%、17.7%±0.5%及12.2%±4.4%，HL-60A細胞的活率則分別為63.8%±4.6%、28.6%±4.4%和14.8%±4.7%，阿霉素作用于HL-60細胞24 h的IC50是0.28 mg/L，而對于HL-60A細胞，相應的 IC50是2.23 mg/L。以上結果證實了HL-60A細胞對阿霉素的耐藥性。

然后用不同濃度的塞來昔布(0、20、40、60、80和100 μmol/L)處理HL-60細胞和HL-60A細胞，分別在 24 h、48 h和72 h 后檢測2種細胞株的活力。從圖1可見，塞來昔布作用于HL-60細胞24 h、48 h和72 h的 IC50分別是49.4 μmol/L、32.0 μmol/L和25.1 μmol/L，而對于HL-60A細胞，相應的 IC50分別是69.1 μmol/L、42.5 μmol/L和29.6 μmol/L。由此可見，塞來昔布作用24 h及48 h時對HL-60A細胞活力的抑制作用低于HL-60細胞，而藥物作用時間延長至72 h，塞來昔布對2種細胞活力的抑制作用接近。

Figure 1.Celecoxib inhibited the viability of HL-60 cells and HL-60A cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 mg/L doxorubicin;#P<0.05,##P<0.01vs0 μmol/L celecoxib.

圖1 塞來昔布抑制HL-60細胞和HL-60A細胞活力

2 塞來昔布對HL-60細胞和HL-60A細胞凋亡率的影響

利用流式細胞術檢測不同濃度塞來昔布(0、20、40、60和80 μmol/L)對HL-60細胞和HL-60A細胞凋亡的影響。如圖2所示，隨著塞來昔布濃度的增加，24 h后死亡細胞的比例均逐漸上升，不同濃度塞來昔布處理的HL-60細胞的凋亡率為分別為7.22%±1.74%、12.83%±2.84%、24.91%±1.33%、27.33%±3.01%和23.01%±3.31%，壞死率分別為1.82%±0.07%、4.18%±0.40%、12.40%±1.69%、50.10%±4.03%和63.45%±8.55%；HL-60A細胞的凋亡率為分別為1.61%±0.49%、12.17%±1.91%、25.67%±4.66%、16.44%±3.90%和15.39%±3.23%，壞死率分別為0.87%±0.04%、2.03%±0.24%、2.55%±0.55%、3.47%±1.39%和8.12%±2.65%。

Figure 2.Celecoxib induced apoptosis of HL-60 cells and HL-60A cells and induced HL-60 cell necrosis. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L.

圖2 塞來昔布促進HL-60細胞和HL-60A細胞凋亡以及促進HL-60細胞壞死

3 塞來昔布對凋亡相關蛋白的影響

用Western blot法檢測了細胞凋亡相關蛋白cleaved caspase-3和cleaved PARP的蛋白水平。從圖3可見，隨著塞來昔布濃度的增加，HL-60和HL-60A細胞的cleaved caspase-3及cleaved PARP的蛋白水平也逐漸增加，總PARP 的蛋白水平降低。

4 塞來昔布對HL-60細胞和HL-60A細胞自噬的影響

4.1 塞來昔布作用于HL-60細胞和HL-60A細胞后LC3和P62的變化 隨著塞來昔布濃度的增加(0、20、40和80 μmol/L)，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及P62蛋白水平均增加，見圖4。

4.2 塞來昔布對mTOR途徑的影響 從圖4可見，隨著塞來昔布濃度的增加，AML細胞株中mTOR、p-mTOR以及下游的4-EBP、p-4-EBP蛋白水平沒有變化。

4.3 氯喹作用于HL-60細胞后LC3及P62的變化 由圖5可見，兩種AML細胞經20 μmol/L氯喹處理24 h后LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ以及P62蛋白水平都增加。

Figure 3.The effects of celecoxib on the expression of apoptosis-related proteins in HL-60 cells and HL-60A cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L.

圖3 塞來昔布對HL-60和HL-60A細胞凋亡相關蛋白的影響

討 論

本研究表明隨著塞來昔布藥物濃度的增加以及作用時間的延長，HL-60細胞、HL-60A細胞活力逐漸降低，說明在一定藥物濃度以及作用時間范圍內，塞來昔布對HL-60細胞和HL-60A細胞活力的抑制作用呈時間以及劑量依賴性。與HL-60A細胞對阿霉素耐藥不同，當塞來昔布的藥物濃度提高到60～100 μmol/L，作用時間延長到72 h時，塞來昔布對2株細胞具有相似的細胞活力抑制作用。此實驗結果提示塞來昔布有望用于治療對阿霉素耐藥的AML。

研究進一步證實了塞來昔布能夠促進HL-60細胞和HL-60A細胞的凋亡。值得一提的是除凋亡這一經典的細胞死亡途徑外，塞來昔布還誘導AML細胞的壞死，這一作用在HL-60細胞中尤為突出，隨著塞來昔布藥物濃度的增加，HL-60細胞壞死數量明顯遞增，然而對HL-60A而言，不同濃度塞來昔布作用24 h后，壞死的細胞沒有明顯增加。由此可見，塞來昔布作用AML細胞24 h后，HL-60細胞活力遠遠低于HL-60A細胞的原因之一是塞來昔布促HL-60A壞死的能力遠遠低于HL-60細胞。此外，實驗還從蛋白水平檢測了凋亡相關蛋白cleaved caspase-3以及cleaved PARP。在本研究中，塞來昔布作用于HL-60細胞和HL-60A細胞后，cleaved caspase-3以及cleaved PARP蛋白的水平均明顯升高，說明塞來昔布對白血病細胞的促凋亡作用是通過caspase途徑的，這與Zhang等[15]的研究一致。

本研究的重點是在塞來昔布對AML細胞的自噬作用的影響。細胞自噬是一個非常復雜而且神秘的過程，至今其中的機制尚未完全研究清楚。細胞自噬過程由自噬體的形成到自噬體與溶酶體的結合，最后到溶酶體的降解，因此自噬的過程又被稱為自噬流[16]。本研究用Western blot法檢測不同濃度塞來昔布作用于HL-60細胞和HL-60A細胞后LC3的變化。LC3是目前發現的唯一定位于自噬泡膜上的調節蛋白，因此常用作自噬形成的標志[17]。隨著塞來昔布濃度的增加，LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ逐漸增多，提示自噬體的增加。P62又稱SQSTM1，是參與自噬體降解的重要蛋白，隨著自噬體的降解，P62逐漸減少[18]， 因此P62的降低提示自噬增加，相反P62增加提示自噬被抑制。隨著塞來昔布濃度的增加，P62逐漸增加。 LC3及P62的結果提示塞來昔布能夠抑制HL-60細胞和HL-60A細胞自噬，其并不是抑制自噬體的形成，而是抑制自噬體的降解。自噬的調節是非常復雜的過程，有多種信號通路包括mTOR、Beclin 1、PI3K及Ca2+等的參與。其中mTOR是ATP和氨基酸的感受器，在自噬過程中發揮著門控作用，是自噬體形成、成熟的關鍵[19]。

Figure 4.The effects of celecoxib on the expression of autophagy-related proteins in the HL-60 cells and HL-60A cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L.

圖4 塞來昔布對HL-60和HL-60A細胞自噬相關蛋白的影響

Figure 5.The effects of chloroquine (CQ) on the expression of autophagy-related proteins in the HL-60 cells and HL-60A cells. Mean±SD.n=3. *P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L.

圖5 氯喹對HL-60和HL-60A細胞自噬相關蛋白的影響

實驗進一步檢測mTOR途徑相關蛋白，mTOR、p-mTOR以及下游的4-EBP、p-4-EBP蛋白水平沒有變化，進一步支持了的LC3Ⅱ的增加并非是自噬體的生成增多引起的。本研究還比較了塞來昔布以及氯喹對2株AML細胞的作用。氯喹是一種常用的自噬抑制劑，它能夠通過抑制溶酶體的功能以及抑制自噬體與溶酶體的結合而抑制細胞自噬過程[20]。氯喹能夠增加HL-60細胞和HL-60A細胞LC3 Ⅱ和P62水平，這與塞來昔布對HL-60細胞和HL-60A細胞的作用一致，因此進一步證實了塞來昔布與氯喹一樣，能夠抑制白血病細胞的自噬，這是一個新的發現。

特別值得一提的是在白血病的治療中，細胞自噬被看作是一種非常重要的能影響各種藥物治療效果的機制[21-23]。在某些治療藥物中，自噬呈現出細胞毒作用促進細胞死亡[21-22]，然而，在另外一些治療方法中，自噬作為一種調節機制能夠促進白血病細胞的存活，亦被稱作保護性細胞自噬[23]。有1期臨床試驗結果顯示，羥氯喹聯合硼替佐米治療14例復發/難治的多發性骨髓瘤患者，3例(14%)取得較好緩解(very good partial remission，VGPR)， 3例(14%)獲得微小緩解(minor remission，MR)，10例(45%)疾病穩定(stable disease，SD)[24]。以上結果表明化療或者其它小分子物質聯合自噬抑制劑將會是靶向血液系統惡性腫瘤的一種有前途的治療手段。本實驗表明塞來昔布能夠抑制白血病細胞株HL-60細胞和HL-60A的細胞自噬，因此，塞來昔布作為可選擇的自噬抑制劑，有望聯合應用于AML的治療過程，有助于增強某些引起保護性自噬的化療藥物的細胞毒作用。我們的后期實驗將進一步探索塞來昔布聯合阿霉素等化療藥物作用于白血病細胞的效果，檢測2類藥物聯用能否增強化療藥物的細胞毒作用以及該作用與細胞自噬的關系。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Celecoxib inhibits viability, induces apoptosis and inhibits autophagy in acute myeloid leukemia cell lines HL-60 and HL-60A

LU Ying1, 2, LIU Xiang-fu1, LIU Ling-ling2, LIN Zhe-sheng1, CHEN Yu-chan1, FENG Bao-ying1, ZHANG Xiang-zhong2

(1DepartmentofBloodTransfusion,2DepartmentofHematology,TheThirdAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China.E-mail:bradzxz@126.com)

AIM: To investigate the effects of celecoxib on viability, apoptosis and autophagy in acute myeloid leukemia (AML) cell lines HL-60 and HL-60A. METHODS: The HL-60 cells and HL-60A cells were cultured with various concentrations (0, 20, 40, 60, 80 and 100 μmol/L) of celecoxib. The inhibitory effect of celecoxib on the cell viability was evaluated by MTT assay. Apoptosis was analyzed by Annexin-V/PI staining. Apoptosis-related and autophagy-related proteins were determined by Western blot. RESULTS: IC50of celecoxib were 49.4 μmol/L, 32.0 μmol/L and 25.1 μmol/L for HL-60 cells treated with celecoxib for 24 h, 48 h and 72 h, respectively. For HL-60A cells, the corresponding IC50were 69.1 μmol/L, 42.5 μmol/L and 29.6 μmol/L, respectively. The results of flow cytometry analysis showed the proportions of Annexin-Ⅴ+PI-, Annexin-Ⅴ+PI+and Annexin-Ⅴ-PI+cells were increased in the HL-60 cells, and those of Annexin-Ⅴ+PI-and Annexin-Ⅴ+PI+cells were increased in the HL-60A cells treated with celecoxib for 24 h. After treated with celecoxib, the induction of apoptosis was observed, the apoptosis-related proteins cleaved caspase-3 and cleaved PARP were upregulated, the autophagy-related proteins LC3 II and P62 were both increased, and mTOR, p-mTOR, 4-EBP and p-4-EBP were not changed, indicating that celecoxib inhibited autophagy in the AML cells without the mTOR pathway involvement. CONCLUSION: Celecoxib inhibits the viability of HL-60 cells and HL-60A cells in a time- and dose-dependent manner by its effects of inducing apoptosis and necrosis. Celecoxib inhibits mTOR-independent autophagy in AML cells, indicating a possible way of using celecoxib for enhancing the antitumor activity of therapeutic agents to induce cytoprotective autophagy in the AML cells.

Celecoxib; Acute myeloid leukemia; Apoptosis; Autophagy

1000- 4718(2017)01- 0018- 08

2016- 07- 07

2016- 10- 26

廣東省自然科學基金資助項目(No. 2014A030313138)；廣東省自然科學基金博士啟動基金資助項目(No. 2014A030310292)

R733．72

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.01.004

雜志網址： http://www.cjpp.net

△通訊作者 Tel: 020-82179782； E-mail: bradzxz@126.com

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