抗衰老Klotho蛋白對高糖作用下血管內皮細胞的保護作用*

張 軍， 代文靜， 周敬群， 張家俊， 曹志剛

(三峽大學仁和醫院 1ICU科， 2心血管內科，湖北 宜昌 443000)

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抗衰老Klotho蛋白對高糖作用下血管內皮細胞的保護作用*

張 軍1△， 代文靜2， 周敬群2， 張家俊1， 曹志剛1

(三峽大學仁和醫院1ICU科，2心血管內科，湖北 宜昌 443000)

目的： 研究抗衰老Klotho蛋白對高糖作用下血管內皮細胞的保護作用及其作用機制。方法: 體外培養人臍靜脈血管內皮細胞(HUVECs)，設置PBS對照組、5.5 mmol/L葡萄糖組、33.3 mmol/L葡萄糖組、0.1 μmol/L Klotho+33.3 mmol/L葡萄糖組、1 μmol/L Klotho+33.3 mmol/L葡萄糖組和10 μmol/L Klotho+33.3 mmol/L葡萄糖組。使用MTT法檢測各組細胞活力；同時檢測各組細胞培養上清中丙二醛(MDA)的含量以及乳酸脫氫酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)和還原型谷胱甘肽(GSH)的活性；流式細胞術檢測各組細胞中活性氧(ROS)含量變化；ELISA檢測各組細胞培養液中一氧化氮(NO)、內皮素1(ET-1)和細胞間黏附分子1(ICAM-1)的濃度變化；Western blot法檢測各組細胞中核因子κB(NF-κB)蛋白的表達。結果: 與PBS對照組相比，33.3 mmol/L葡萄糖能夠顯著降低HUVECs的細胞活力，增加細胞中ROS的含量，增加細胞培養上清中LDH活性和MDA含量,降低SOD和GSH的活性，同時降低NO分泌，誘導ET-1、ICAM-1分泌及細胞中NF-κB蛋白的表達(P<0.05)。不同濃度Klotho蛋白和33.3 mmol/L高糖同時作用HUVECs時，細胞活力逐漸上升，ROS和MDA含量以及LDH活性逐漸下降， SOD和GSH活性則逐漸上升，同時NO分泌增加，ET-1、ICAM-1分泌及NF-κB蛋白表達顯著下降(P<0.05)。結論: 抗衰老Klotho蛋白能夠提升高糖作用下HUVECs的細胞活力，減少高糖誘導的ROS生成及氧化損傷，恢復HUVECs的正常分泌功能，并通過減少NF-κB蛋白表達發揮抗損傷作用。

高糖； Klotho蛋白； 人臍靜脈血管內皮細胞； 氧化應激； 動脈粥樣硬化

糖尿病患者由于血糖濃度較高，極易導致血管并發癥，其較非糖尿病患者心血管病發病率及病死率高2到3倍。長期高血糖導致的血管動脈粥樣硬化是糖尿病患者死亡率上升的主要原因之一[1]。糖尿病性并發心血管疾病由于發病病因、機制、病理表現復雜尚無有效的防治方法，多發于中老年人群，提示機體衰老因素可能參與到糖尿病并發心血管疾病病因中。Klotho蛋白是一種新型與抗衰老相關的蛋白，對于抵抗機體衰老發揮重要作用[2]。已有研究表明分泌型Klotho蛋白能夠抑制機體衰老、發揮抗氧化、抗凋亡作用并保護心血管、腎臟等系統，從而對多種衰老相關疾病進行調節[3]。目前，由高血糖引起血管內皮細胞功能失調導致的動脈粥樣硬化等心血管并發癥的明確機制及有效防治方法尚不明確。因此，本研究以高濃度葡糖糖作用于人臍靜脈血管內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)模擬糖尿病患者血管內皮細胞受損狀態，研究人抗衰老Klotho蛋白對高糖作用下HUVECs損傷的影響，為驗證抗衰老因素在糖尿病并發血管內皮損傷疾病防治中發揮作用提供新依據。

材 料 和 方 法

1 材料

HUVECs購自中科院細胞資源中心(細胞培養級，CD31/vWF陽性率≥95%)；RMPI-1640細胞培養基、胎牛血清和EDTA胰酶購自HyClone；人Klotho蛋白購自R&D；MTT、二甲基亞砜(DMSO)和雙氫羅丹明123購自Sigma；乳酸脫氫酶(lactate dehydroge-nase，LDH)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；一氧化氮(nitric oxide，NO)ELISA試劑盒購自上海凱博生化試劑公司；內皮素1(endothelin-1，ET-1)和細胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)檢測ELISA試劑盒購自武漢華美生物公司；兔抗人核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)和β-actin多克隆抗體購自Abcam；HRP標記II抗和ECL化學發光試劑購自北京中杉金橋公司；其他試劑均為國產分析純。

2 方法

2.1 MTT法檢測細胞活力 復蘇活化凍存的HUVECs，用含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養基培養。選取增殖期狀態良好的HUVECs，胰酶消化后用培養基稀釋濃度至107/L種于96孔板中。細胞分組為PBS對照組、5.5 mmol/L葡萄糖組、33.3 mmol/L葡萄糖組、0.1 μmol/L Klotho+33.3 mmol/L葡萄糖組、1 μmol/L Klotho+33.3 mmol/L葡萄糖組和10 μmol/L Klotho+33.3 mmol/L葡萄糖組。每組設置6個平行孔，分別加藥處理24 h和48 h。每孔加入20 μL的MTT溶液繼續溫育4 h后，去除培養基加入DMSO，振蕩5 min后在酶標儀檢測各組細胞在波長492 nm處的吸光度(A)。

2.2 LDH、MDA、SOD和GSH的檢測 按照相同的分組方法將增殖期的HUVECs以1×108/L分組處理培養48 h后，收集各組細胞培養液上清，利用比色法檢測試劑盒檢測HUVECs細胞分別經5.5、33.3 mmol/L葡萄糖及33.3 mmol/L葡萄糖與0.1、1、10 μmol/L Klotho蛋白聯合作用后對細胞分泌LDH、MDA、SOD和GSH的影響。

2.3 流式細胞術檢測細胞內活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)生成的變化 以同樣分組方法將HUVECs等量接種于不同培養板中，待細胞貼壁后經5.5、33.3 mmol/L葡萄糖及33.3 mmol/L葡萄糖與0.1、1、10 μmol/L Klotho蛋白聯合處理48 h后消化收集細胞。用PBS洗滌細胞2次后，分別在各組細胞中加入1 μmol/L的雙氫羅丹明123孵育1 h，孵育完成后離心收集細胞并用PBS洗滌1次。各組細胞內活性氧可將雙氫羅丹明123氧化為羅丹明123發出熒光，以連續傳代處于對數期的HUVECs中熒光量為陰性對照，利用流式細胞儀檢測各組細胞中熒光陽性率反映各組HUVECs細胞內ROS變化情況。

2.4 ELISA方法檢測細胞培養上清液NO、ET-1和ICAM-1含量的變化 將HUVECs分組接種于6孔板中后，按相同的分組分別用5.5、33.3 mmol/L葡萄糖及33.3 mmol/L葡萄糖與0.1、1、10 μmol/L Klotho蛋白聯合處理48 h，同時設置PBS空白對照。收集各組細胞培養上清液按照ELISA試劑盒說明書檢測各組HUVECs經處理后NO、ET-1和ICAM-1分泌量的變化。

2.5 Western blot法檢測NF-κB的蛋白表達 按照相同方法和分組處理培養的HUVECs，48 h后消化收集細胞，PBS洗滌2次后利用RAPI蛋白提取液提取各組細胞中總蛋白。BCA試劑盒測定各組細胞中總蛋白。每組上樣30 μg總蛋白進行SDS-PAGE，轉膜封閉后分別孵育抗NF-κB和β-actin的 I 抗4 ℃過夜，TBST洗滌后孵育HRP標記 II 抗2 h，TBST洗滌2次后ECL化學發光顯影拍照。利用Quantity One 軟件分析NF-κB蛋白相對表達量。

3 統計學處理

采用軟件SPSS 13.0進行統計學分析。所有數據采用均數±標準差(mean±SD)表示。在方差齊性檢驗后各組間數據比較采用單因素方差(one-way ANOVA)分析，用SNK-q檢驗進行各組均數間兩兩比較。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 Klotho蛋白對高糖作用下HUVECs細胞活力的影響

與空白對照組HUVECs細胞相比，5.5 mmol/L葡萄糖單獨處理HUVECs細胞24 h和48 h后細胞的A值有所下降，但差異無統計學顯著性；而33.3 mmol/L葡萄糖單獨處理組中HUVECs細胞的A值均顯著下降，差異有統計學顯著性(P<0.05)。當不同濃度抗衰老Klotho蛋白與33.3 mmol/L葡萄糖同時作用于HUVECs細胞時，可以顯著提升細胞A值。與33.3 mmol/L葡萄糖單獨作用組相比，1、10 μmol/L Klotho蛋白作用24 h細胞的A值顯著上升(P<0.05)，而0.1、1、10 μmol/L Klotho蛋白作用48 h時細胞A值均顯著上升(P<0.05)。說明抗衰老Klotho蛋白可以促進高糖作用下損傷的HUVECs細胞活力的上升，見圖1。

Figure 1.The effect of Klotho protein on the activity of HUVECs treated with high glucose. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsPBS control;#P<0.05vs33.3 mmol/L glucose.

圖1 Klotho蛋白對高糖作用下HUVECs活力的影響

2 Klotho蛋白對高糖作用下HUVECs中LDH、MDA、SOD和GSH的影響

如圖2所示，與PBS對照組相比，33.3 mmol/L葡萄糖作用下，HUVECs分泌LDH活力和MDA含量顯著上升，而SOD和GSH活力則顯著下降(P<0.05)。當0.1、1、10 μmol/L抗衰老Klotho蛋白和33.3 mmol/L葡萄糖同時作用時，HUVECs分泌LDH活力和MDA含量均逐漸降低，而SOD和GSH活力則逐漸上升，且具有濃度依賴效應(P<0.05)。

Figure 2.The effect of Klotho protein on the content of MDA, and the activities of LDH, SOD and GSH in the culture supernatants of HUVECs treated with high glucose. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsPBS control;#P<0.05vs33.3 mmol/L glucose.

圖2 Klotho蛋白對高糖作用下HUVECs分泌LDH、MDA、SOD、GSH的影響

3 Klotho蛋白對高糖作用下HUVECs中ROS生成的影響

流式細胞術檢測發現抗衰老Klotho蛋白可以抑制高糖誘導下HUVECs產生的ROS，結果見圖3。與PBS對照組相比，5.55 mmol/L葡萄糖誘導HUVECs產生ROS不明顯，但33.3 mmol/L葡萄糖組中產生ROS的量則顯著上升(P<0.05)。當抗衰老Klotho蛋白和高濃度葡萄糖同時作用于HUVECs時，細胞內活性氧ROS有所下降，并隨著Klotho作用濃度的升高ROS含量逐漸降低，與高糖單獨作用組相比，差異有統計學顯著性(P<0.05)。這說明Klotho蛋白能夠減少高糖對HUVECs氧化損傷產生的ROS。

Figure 3.The effect of Klotho protein on the ROS production in the HUVECs treated with high glucose. A: PBS control; B: 5.5 mmol/L glucose; C: 33.3 mmol/L glucose; D: 0.1 μmol/L Klotho+33.3 mmol/L glucose; E: 1 μmol/L Klotho+33.3 mmol/L glucose; F: 10 μmol/L Klotho+33.3 mmol/L glucose. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsPBS control;#P<0.05vs33.3 mmol/L glucose.

圖3 Klotho蛋白對高糖作用下HUVECs細胞ROS生成的影響

4 Klotho蛋白對高糖作用下HUVECs培養上清中NO、ET-1和ICAM-1的影響

ELISA方法檢測抗衰老Klotho蛋白對高糖作用下HUVECs培養上清中的NO、ET-1和ICAM-1含量，結果見表1。與PBS對照組相比，5.5 mmol/L葡萄糖作用組中HUVECs分泌NO、ET-1及ICAM-1含量的變化較小，但33.3 mmol/L葡萄糖作用組HUVECs中NO含量顯著降低，而ET-1和ICAM-1含量顯著上升(均P<0.05)。當不同濃度Klotho蛋白和33.3 mmol/L高糖同時作用于HUVECs細胞時，隨著Klotho濃度的升高，NO含量逐漸上升而ET-1和ICAM-1含量逐漸下降，與高糖單獨作用組相比，差異有統計學顯著性(P<0.05)。

5 Klotho蛋白對高糖作用下HUVECs中NF-κB蛋白表達的影響

通過Western blot法檢測抗衰老Klotho蛋白對高糖作用下HUVECs中NF-κB表達的影響，結果見圖4。低濃度5.5 mmol/L和高濃度33.3 mmol/L葡萄糖作用HUVECs時，細胞中NF-κB蛋白均顯著上升，且高糖作用組中上升更為明顯(P<0.05)。但當不同濃度Klotho蛋白和33.3 mmol/L高糖同時作用HUVECs時，細胞內NF-κB蛋白則顯著下降，隨著Klotho作用濃度的升高，NF-κB表達漸下降，與高糖單獨作用組相比，差異有統計學顯著性(P<0.05)。

表1 Klotho蛋白對高糖作用下HUVECs培養上清中NO、ET-1和ICAM-1含量的影響

Table 1.The effect of Klotho protein on the concentrations of NO, ET-1 and ICAM-1 in the culture supernatants of HUVECs treated with high glucose (Mean±SD.n=6)

GroupNO(μmol/L)ET?1(mmol/L)ICAM?1(μg/L)PBScontrol93．58±4．850．57±0．053．63±0．235．5mmol/Lglucose85．43±6．750．62±0．123．95±0．3533．3mmol/Lglucose54．17±5．17?0．97±0．06?8．64±0．47?0．1μmol/LKlotho+33．3mmol/Lglucose67．33±3．48#0．85±0．047．33±0．27#1μmol/LKlotho+33．3mmol/Lglucose75．29±4．19#0．71±0．08#5．37±0．30#10μmol/LKlotho+33．3mmol/Lglucose83．45±3．98#0．64±0．07#4．11±0．46#

*P<0.05vsPBS control;#P<0.05vs33.3 mmol/L glucose.

Figure 4.The effect of Klotho protein on NF-κB protein expression in HUVECs treated with high glucose. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsPBS control;#P<0.05vs33.3 mmol/L glucose.

圖4 Klotho蛋白對高糖作用下HUVECs NF-κB表達的影響

討 論

糖尿病患者常常引發血管并發癥，因為其血管內慢性高血糖水平容易使血管內皮細胞喪失正常生理功能，血管內皮功能損傷被認為是動脈粥樣硬化等心血管疾病的發病起始因素，可以導致機體多發性器官病變[4]。而糖尿病及心血管疾病多發于老年人群，相比于青少年群體，其發病率和死亡率均較高，提示機體衰老因素與血管性疾病病因有關聯[5]?？顾ダ螷lotho蛋白是一種與人類衰老相關的蛋白因子，有膜型和分泌型兩種形式。分泌型Klotho蛋白可作為抗衰老調節激素對多種靶器官發揮調節作用，研究表明它能夠保護心血管系統，對衰老等多種相關疾病進行調節[6]。進一步研究表明，Klotho蛋白與人類心血管疾病、癌癥、腎損傷等多種代謝疾病都有密不可分的關系，前期研究中已發現Klotho蛋白能夠抑制高糖作用下內皮細胞的衰老和凋亡，但關于其是否在高糖引起的血管內皮損傷氧化應激和炎癥反應中發揮作用尚未見研究[7]。本研究中以不同濃度葡萄糖作用于HUVECs模擬糖尿病人受損血管內皮，MTT檢測可以發現33.3 mmol/L高濃度葡萄糖作用組中HUVECs細胞活力顯著下降，而當Klotho蛋白與高糖同時作用于HUVECs時，細胞活力卻能夠顯著上升，說明抗衰老Klotho蛋白能夠減輕高糖對HUVECs的損傷作用。

動脈粥樣硬化等心血管障礙性疾病都與血管內皮細胞氧化應激有關，而糖尿病患者由于血管內血糖濃度過高，使血管內皮細胞產生ROS增多而加速其損傷程度[8]。本文通過流式細胞術檢測也發現，當不同濃度葡糖糖單獨作用于HUVECs時細胞內產生ROS的含量會顯著上升，說明高糖能夠誘導血管內皮細胞的ROS。而當抗衰老Klotho蛋白同時作用于HUVECs時，細胞內ROS含量逐漸下降，并具有明顯的濃度效應，說明Klotho蛋白有助于減少高糖引起的HUVECs細胞ROS損傷。同時血管內皮細胞的抗氧化生理功能還能通過LDH、MDA、SOD及GSH反映出來。LDH在細胞內糖分解和異生中起著重要作用，其分泌的多少反映機體氧化損傷的嚴重程度[9]。MDA是機體脂質過氧化的敏感指標，水平的高低可以反映細胞的氧化損傷程度，而細胞內存在的抗氧化系統SOD和GSH可以對抗氧化應激對細胞的損傷[10]。本研究中不同濃度Klotho蛋白和高糖同時作用于HUVECs時，與高糖單獨損傷組相比，細胞中LDH和MDA水平顯著下降，而抗氧化SOD和GSH活性均明顯上升，說明抗衰老Klotho蛋白作用于高糖損傷的HUVECs，能夠刺激其抗氧化損傷系統發揮作用，進而對氧化損傷的細胞發揮保護和修復作用。

正常血管內皮細胞還具有分泌功能，能夠分泌NO、ET-1、ICAM-1等因子，并在動脈粥樣硬化形成中發揮重要作用[11]。NO是血管內皮細胞釋放的重要舒血管物質能夠直接反映內皮細胞功能的強弱，而內皮素ET-1是機體內強收縮血管物質，能夠促進血管平滑肌的增生，血管損傷時會顯著上升，也可以反映血管的損傷程度[12]。ICAM-1能夠在受損的內皮細胞及血管中斑塊形成處較強表達，從而導致動脈粥樣硬化[13]。研究表明糖尿病患者血管內皮細胞功能受損，血清中NO分泌含量下降，而ET-1及ICAM-1會顯著上升[14]。本文研究發現單獨高糖作用HUVECs時，細胞中NO分泌含量顯著下降，而ET-1及ICAM-1含量均顯著上升，說明高糖損傷HUVECs正常分泌功能。當抗衰老Klotho蛋白與高糖同時作用于HUVECs時，細胞分泌NO含量能夠逐漸上升，而ET-1和ICAM-1水平會漸下降,說明Klotho蛋白能夠恢復HUVECs正常分泌功能，對于預防動脈粥樣硬化斑塊形成有積極作用。同時有研究[15]表明ROS能夠激活細胞中NF-κB表達的上調，而NF-κB能夠調節編碼多種炎癥介質的基因，使血管內皮細胞發生炎癥反應、免疫應答或凋亡，從而誘發動脈粥樣硬化，而通過阻斷NF-κB信號通路能夠阻止糖尿病血管病變的發生、發展。本研究中Western blot檢測也發現，在高糖環境下HUVECs中NF-κB蛋白表達上調，但不同濃度Klotho蛋白能夠逐漸抑制高糖誘導HUVECs中NF-κB蛋白的表達，說明其保護高糖下血管內皮細胞可能通過減少NF-κB蛋白表達阻斷NF-κB信號通路發揮作用。

綜上所述，本研究發現抗衰老Klotho蛋白能夠提升高糖作用下HUVECs細胞活力，抵抗高糖誘導的氧化損傷，恢復內皮細胞正常分泌功能，從而對血管內皮細胞發揮保護作用，并可通過減少NF-κB蛋白表達發揮作用。通過本研究能夠對高血糖引起的動脈粥樣硬化等心血管并發癥的防治提供新的視野和思路。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Protective effect of anti-aging Klotho protein on human umbilical vein endothelial cells treated with high glucose

ZHANG Jun1, DAI Wen-jing2, ZHOU Jing-qun2, ZHANG Jia-jun1, CAO Zhi-gang1

(1ICU,2DepartmentofCardiology,RenheHospital,ThreeGorgesUniversity,Yichang443000,China.E-mail:zhoujingqun-1@medmail.com.cn)

AIM: To study the protective effect of anti-aging Klotho protein on human umbilical vein endothe-lial cells (HUVECs) treated with high glucose (HG).METHODS: HUVECs were culturedinvitro, and divided into PBS control group, 5.5 mmol/L glucose group, 33.3 mmol/L glucose group, 0.1 μmol/L Klotho+33.3 mmol/L glucose group, 1 μmol/L Klotho+33.3 mmol/L glucose group, and 10 μmol/L Klotho+33.3 mmol/L glucose group. The viability of the HUVECs was measured by MTT assay. The content of malondialdehyde (MDA), and the activities of lactate dehydrogenase (LDH), superoxide dismutase (SOD) and glutathione (GSH) in cell culture supernatants were observed. The production of reactive oxygen species (ROS) in HUVECs was analyzed by flow cytometry. The levels of nitric oxide (NO), endothelin (ET-1), intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) in HUVEC culture medium were detected by ELISA. The protein expression of nuclear factor-kappa B (NF-κB) in the HUVECs was determined by Western blot. RESULTS: Compared with PBS control group, 33.3 mmol/L glucose significantly decreased the HUVEC viability, increased ROS, LDH and MDA levels, reduced the activities of SOD and GSH, decreased the NO secretion, and induced the ET-1 and ICAM-1 secretion and the protein expression of NF-κB in HUVECs. When HUVECs were treated with Klotho protein at different concentrations combined with 33.3 mmol/L glucose, the cell viability was increased significantly, the ROS, LDH and MDA levels were decreased significantly, the antioxidant SOD and GSH activities were significantly increased, the secretion of NO was increased, but ET-1 and ICAM-1 releases and protein expression of NF-κB were significantly reduced.CONCLUSION: Anti-aging Klotho protein promotes the viability of HUVECs treated with HG, reduces the oxidative damage and ROS production, and restores the normal secretory function of HUVECs, thus playing a protective role in vascular endothelial cells through reducing the protein expression of NF-κB.

High glucose; Klotho protein; Human umbilical vein endothelial cells; Oxidative stress; Atherosclerosis

1000- 4718(2017)01- 0067- 06

2016- 05- 24

2016- 10- 27

湖北省教育廳自然科學研究計劃重點項目(No. D20091308)

R587.1； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.01.011

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