甲狀腺球蛋白基因外顯子33單核苷酸多態性與Graves病停藥后復發的相關性分析*

盧洪文， 張銀環， 劉長山， 李發梅， 王雪松， 黃靈玉， 張 穎， 柳 林△

(濰坊市人民醫院 1內分泌科， 2心內二科， 山東 濰坊 261041； 3濰坊醫學院研究生部， 山東 濰坊 261053)

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甲狀腺球蛋白基因外顯子33單核苷酸多態性與Graves病停藥后復發的相關性分析*

盧洪文1， 張銀環2， 劉長山1， 李發梅3， 王雪松1， 黃靈玉1， 張 穎3， 柳 林1△

(濰坊市人民醫院1內分泌科，2心內二科， 山東 濰坊 261041；3濰坊醫學院研究生部， 山東 濰坊 261053)

目的： 探究甲狀腺球蛋白基因外顯子33單核苷酸多態性(E33SNP)與Graves病(GD)復發的相關性，為臨床預測GD抗甲狀腺藥物(ATD)治療后的復發提供合理性依據。方法: 選取健康對照者232例以及GD治療后停藥的患者243例，且根據GD停藥患者的復發情況將觀察組分為A、B、C 3個亞組：77例治療后1年內復發者為A組，86例治療后1～2年內復發者為B組，80例治療后2年內未復發者為C組。利用RT-PCR檢測對照組和觀察組的E33SNP進行分型，對比分析對照組和觀察組不同基因型的比率及觀察組不同甲狀腺球蛋白基因型患者的游離三碘甲狀腺原氨酸(FT3)、游離甲狀腺素(FT4)、促甲狀腺激素(TSH)和促甲狀腺激素受體抗體(TRAb)水平，以及眼征、甲狀腺腫大程度等臨床資料，且對觀察組不同基因型患者在治療后2年內的累積有效率進行對比分析。結果: 觀察組與對照組E33SNP的基因型差異無統計學顯著性，但觀察組各個亞組間E33SNP基因型差異具有統計學顯著性(P<0.05)。對觀察組的A、B、C 3個亞組間不同基因型患者各項甲狀腺功能相關指標進行對比分析表明，不同基因型患者的TSH、FT3、FT4水平及甲狀腺腫大程度的差異無統計學顯著性，而TRAb水平和眼征發生率的差異具有統計學顯著性(P<0.05)。此外，E33SNP T/T型GD患者ATD治療后2年內的累積有效率為61.8%，E33SNP T/C型患者為42.6%，E33SNP C/C型患者為21.3%，差異具有統計學顯著性(P<0.05)。結論: E33SNP C/C型GD患者停藥后的TRAb水平以及眼征發生率明顯偏高，在ATD治療后更加容易復發，E33SNP T/T型患者則呈現相反的趨勢，復發率明顯偏低，因此E33SNP C/C型GD患者采用其它治療方式或者聯合治療方式可能更加合理。

Graves病； 甲狀腺球蛋白； 單核苷酸多態性； 復發

Graves病(Graves’ disease，GD)為臨床上常見的自身免疫性甲狀腺疾病(autoimmune thyroid disease，AITD)之一，主要是由于促甲狀腺激素受體抗體(thyrotropin receptor antibody，TRAb)分泌增加而導致甲狀腺機能亢進所致[1]。目前GD的發病機制尚不完全明確，但研究者普遍認為[2]，機體的免疫異常如T細胞功能缺陷，免疫耐受、識別和調節功能減退等與GD的發生有非常重要的關系。臨床上常用治療GD的方法主要包括抗甲狀腺藥物(antithyroid drug，ATD)、131I及手術治療。ATD作為最主要的治療方法，其最大的缺點就是復發率高。近來已有研究[3]表明復發率可以高達60%。GD運用ATD治療后的復發與甲狀腺腫大程度、TRAb的水平等很多因素相關[4]，同時近年來很多研究表明不少基因如細胞毒T淋巴細胞相關抗原4(cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4，CTLA-4)、CD40和促甲狀腺激素受體(thyroid-stimulating hormone receptor，TSHR)的多態性與GD復發都存在著密切的關系。甲狀腺球蛋白(thyroglobulin，Tg)是自身免疫性甲狀腺疾病中最為主要的抗原，其抗原表位至少為40個，研究表明其外顯子33單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism in exon 33, E33SNP)與GD的發病有關，但是其與ATD治療后的緩解及復發的相關性研究甚少。本研究旨在探究山東中部漢族人群中GD患者的E33SNP與ATD治療后復發的相關性，為臨床預測GD的復發提供合理的依據。

材 料 和 方 法

1 臨床資料

觀察組共收集病例243例(男49例，女194例)，平均年齡為(43.2±13.6)歲，均為2011年～2013年間在我院接受ATD正規治療在1年半以上，且用藥至少在6個月以上且不包括其它治療方式及聯合治療的GD初發患者，根據停藥后的復發時間將觀察組分為3個亞組。A組:77例，男16例，女61例，平均年齡為(40.7±11.8)歲，為停藥后1年內復發患者；B組：86例，男18例，女68例，平均年齡為(44.0±9.8)歲，為停藥后1～2年間復發患者；C組：80例，男15例，女65例，平均年齡為(43.2±13.6)歲，為停藥后2年內未復發患者。對照組232例，男性42例，女性190例，平均年齡(43.6±13.7)歲，為我體檢中心收集的健康體檢者，均無自身免疫性甲狀腺疾病，且性別和年齡與觀察組的差異無統計學顯著性。

2 基因型鑒定

采集研究對象的外周血2 mL，枸櫞酸抗凝，采用血液基因組提取試劑盒(試劑盒購自北京天根生化科技有限公司)完全按照說明書流程對研究對象的血液基因組DNA進行提取，提取獲得的基因組DNA均采用NanoDrop 2000超微量核酸蛋白定量儀測定其濃度，樣本DNA純度A260/A280均介于1.8～2.0之間，提取完成后將樣本DNA置于-20 ℃保存。采用RT-PCR技術對研究樣本E33SNP多態性進行基因分型，上游引物為5’-GGACAGTATTCCTGAGAGGAG-3’，下游引物為5’-GAACGAGGATAGGAGATGCTG-3’。引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應體系為:模板1 μL，上、下游引物各1 μL，2×HS Taq MasterMix 10 μL(購自北京天根生化科技有限公司)，20×EvaGreen 1 μL(購自Biotium)，加 ddH2O 至20 μL。PCR反應條件：94 ℃ 5 min； 94 ℃ 10 s, 65 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s，循環35次；72 ℃ 10 min。儀器為LightCycler 480 PCR儀(購自Roche)。PCR反應后利用GeneScanning軟件進行分型，并將樣本DNA經 PCR反應后的產物進行瓊脂糖凝膠電泳，回收后送至上海生工生物工程有限公司進行基因測序，根據測序峰譜圖，判斷GD患者E33SNP的基因型。

3 停藥和復發標準

停藥標準：高代謝的體征和癥狀得到明顯緩解，藥物的最小維持量可以保持血清游離三碘甲狀腺原氨酸(free triiodothyronine，FT3)、游離甲狀腺素(free thyroxine，FT4)和促甲狀腺激素(thyroid-stimulating hormone，TSH)在正常水平≥1年，TRAb的水平恢復正常。GD復發標準為停藥后患者再次出現甲狀腺功能異常，即FT3、FT4和TSH水平的升高都考慮為復發。

4 隨訪及觀察

所有GD患者在停藥后的2年內每3個月進行1次甲狀腺功能的復查，詳細記錄患者停藥后的TRAb、FT3、FT4和TSH的水平(采用Liaison Analyzer免疫化學發光分析儀進行測定)、甲狀腺的腫大程度、眼征、GD復發的狀況及時間。甲狀腺腫大程度：甲狀腺看不到但可以觸及為Ⅰ°；甲狀腺可以看到和觸及為Ⅱ°；甲狀腺腫大超過胸鎖乳突肌外緣為Ⅲ°。眼征判定采用Werner 1969年提出NOSPECT標準，當NOSPECT評分≥2時，判定為有眼癥。

5 統計學處理

全部數據應用SPSS 19.0軟件進行統計分析。各組基因型頻率及等位基因頻率采用基因計數法進行計算，各組間等位基因頻率及各基因型頻率的比較采用2檢驗;組間突眼征發生程度比較采用Kruskal-WalisH秩和檢驗;正態分布定量數據用均數±標準差(mean±SD)表示，組間定量數據采用完全隨機設計的單因素方差分析;參考Liu等[5]的方法采用Kaplan-Meier生存分析方法繪制不同基因型患者的累積有效率。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 各組間基因型頻率及等位基因頻率的對比性分析

根據測序峰譜圖，對2組患者的E33SNP進行基因分型，E33SNP C/C型對應藍色單峰，為純合子；E33SNP C/T型對應藍紅色相兼的雙峰，代表雜合子；E33SNP T/T型對應紅色單峰，為純合子，具體見圖1～3。對觀察組和對照組的基因型頻率及等位基因頻率進行對比性分析的結果表明，2組患者的基因型頻率及等位基因頻率的差異無統計學顯著性，而觀察組各亞組間的基因型頻率及等位基因頻率的差異具有統計學顯著性，A組CC型患者顯著多于B組和C組，而CT型患者顯著少于B組和C組(P<0.05)，B組CC型患者顯著多于C組，CT型患者顯著少于C組(P<0.05)，B組和C組的TT型患者數量間的差異無統計學顯著性，見表1。

Figure 1.The sequencing analysis of E33SNP C/C genotype.

圖1 E33SNP C/C型序列圖譜分析

Figure 2.The sequencing analysis of E33SNP C/T genotype.

圖2 E33SNP C/T型序列的圖譜分析

Figure 3.The sequencing analysis of E33SNP T/T genotype.

圖3 E33SNP T/T型序列圖譜分析

表1 基因型頻率及等位基因頻率的對比性分析

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsA group;$P<0.05,$$P<0.01vsB group.

2 停藥后不同基因型患者甲狀腺功能相關指標的對比分析

檢測觀察組不同基因型患者在停藥后的各項甲狀腺功能相關指標，并對其進行對比分析，結果表明停藥后A、B、C 3組中不同基因型患者的TSH、FT3和FT4水平及甲狀腺腫大程度的差異無統計學顯著性，而A、B、C 3組中不同基因型患者TRAb水平的差異具有統計學意義，CC型患者明顯偏高(P<0.05)。不同基因型患者眼征發生率的差異也具有統計學顯著性，CC基因型患者眼征的發生率顯著偏高(P<0.05)，見表2。

表2 不同基因型患者甲狀腺功能相關指標的對比分析

*P<0.05,**P<0.01vsCC genotype in the same group;#P<0.05,##P<0.01vsCT genotype in the same group.

3 各基因型患者停藥后累積有效率的對比分析

對觀察組不同基因型患者的復發狀況進行詳細記錄，采用Kaplan-Meier生存分析的方法繪制不同基因型患者的累積有效率，結果表明CC型患者2年內的累積有效率為21.3%，CT型患者2年內的累積有效率為42.6%，TT型患者2年內的累積有效率為61.8%，3組差異具有統計學顯著性(P<0.05)，見圖4。

討 論

研究者認為GD為遺傳因素與多種復雜非遺傳因素共同作用的結果[6]，如有研究表明，凋亡相關蛋白Fas、FasL及Bcl-2也能促進GD的發生[7]。目前公認的與GD發生相關的基因主要分為兩類：一類為與免疫調節相關的基因，主要包括人白細胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)基因[8]、CTLA-4基因[9]以及CD40基因[10]等，另一類為甲狀腺特異性基因即Tg基因。免疫調節相關基因不僅與GD具有重要的關系，對機體其它的自身免疫性疾病也有重要影響，因此該類基因對GD發生的影響通常是錯綜復雜且相互關聯的[11]，而Tg基因作為甲狀腺特異性基因與AITD具有更加直接和重要的關系。目前，有關Tg基因與AITD相關性的研究已有不少，但是由于樣本地域的差異性，使得不同研究的結果具有較大的差異。E33SNP為甲狀腺球蛋白基因研究比較多的多態性位點，近來Wang等[12]系統性地研究了中國漢族人群Tg基因多態性與AITD的相關性，結果發現河南北部人群E33SNP與AITD無相關性，而陜西西安人群的E33SNP與AITD呈統計學相關，早前張進安等[13]對中國北部漢族人群的研究也發現E33SNP與AITD無相關性，但是與橋本甲狀腺炎呈統計學相關。本實驗研究結果表明，在山東中部人群中E33SNP與GD發生無相關性，這與上述研究具有一定的相似性。但是 Hsiao等[14]研究發現在臺灣北部人群中E33SNP與GD發生具有統計學相關性，因此，不同區域的人群其E33SNP各基因型頻率、等位基因頻率及其是否與GD相關具有一定的差異。

Figure 4.Cumulative efficiency curves of the patients with diffe-rent genotypes after drug withdrawal.

圖4 不同基因型GD患者停藥后的累積有效率曲線

影響GD復發的因素很多，臨床上研究多為非遺傳因素對GD復發的影響，而與GD復發相關的遺傳因素卻研究甚少，目前有人報道過的基因僅為CTLA-4[15]、CD40[16]及TgE33SNP[14]，且Kim等[16]的研究表明在韓國人群中CTLA-4與CD40基因多態性與GD的復發無顯著相關性，這一研究結果與張京玲等[15]對中國北方人群的研究結果具有一定差異，可能與樣本地域差異性有關。本研究通過研究停藥后不同時段復發的GD患者(A、B、C 3組)的E33SNP發現，不同時段復發的GD患者其E33SNP基因型差異具有統計學顯著性，E33SNP C/C型患者在A組中的比率較B組和C組明顯偏高，而E33SNP T/T型患者在A組中的比率較B組和C組明顯偏低，表明E33SNP T/T型的GD患者治愈后會有更低的復發率，這一研究結果與Hsiao等[14]的研究結果存在一定的相似性，但是與Sevda等[17]的研究結果卻存在著一定的差異。本研究對不同基因型患者甲狀腺功能相關指標進行對比性分析發現，A、B、C 3組中不同基因型患者的TRAb水平以及眼征的發生率存在著顯著性差異，E33SNP T/T型患者TRAb的水平較E33SNP C/T型和E33SNP C/C型患者明顯偏低，而眼征的發生率呈現E33SNP T/T>E33SNP C/T>E33SNP C/C的趨勢。Hsiao等[14]在臺灣人群中也得出了類似的結論，并且發現E33SNP不同基因型的GD患者甲狀腺腫大程度具有一定的差異，而本研究尚未得出這一結論。Sevda等[17]的研究結果也未表明不同基因型GD患者的甲狀腺腫大程度具有一定的差異。此外，本研究參考Liu等[5]的方法，繪制了不同基因型GD患者停藥后的累積有效率曲線，結果發現E33SNP T/T型治療后2年內的累積有效率為61.8%，E33SNP T/C型累積有效率為42.6%，E33SNP C/C型累積有效率為21.3%，累積有效率在不同基因型間的差異具有統計學顯著性，這也表明E33SNP C/C的患者容易在停藥后的較短時間內復發。

GD患者藥物治療后的復發除了有遺傳因素的影響外，非遺傳因素如年齡、治療前后的TRAb水平、停藥后無碘鹽的攝取等對其的影響也相當復雜[18]。近年來的研究表明抗甲狀腺藥物給藥方式對GD患者治療后的復發具有重要意義，長期低劑量給藥可以顯著降低GD患者治療后的復發率[5,19]。本實驗在此方面存在著一定的不足，尚未討論非遺傳因素對GD患者治療后復發率的影響，以及E33SNP基因型與患者其它臨床資料的相關性，如Hsiao等[14]的研究就表明GD患者的吸煙率在E33SNP不同基因型間差異具有統計學顯著性。由于研究樣本基本是山東中部濰坊及周邊地區的GD患者，樣本的地域來源并不寬泛；本研究對樣本的隨訪時間僅為2年，延長隨訪觀察時間，對樣本進行更長時間的觀察可以使研究結果更加確切；本研究僅探討了E33SNP這一個多態性位點對GD患者藥物治療后復發的影響，但目前已經證明Tg基因存在多個多態性位點，多個位點是否存在著協同作用這一點尚未得到證實，因此本研究也存在一定的局限性。

綜上所述，本研究通過對山東中部漢族人群的243例GD患者進行比較系統性的研究，發現E33SNP在健康人群和GD患者中的差異無統計學顯著性，但是不同階段的GD停藥復發患者E33SNP基因型之間的差異具有統計學顯著性，E33SNP C/C型患者在第1年內復發的比率顯著高于第2年內復發率或2年內未復發的比率，而E33SNP T/T型患者在2年內未復發的比率卻顯著偏高，與E33SNP C/C型呈現相反的趨勢，同時本研究還發現E33SNP T/T型患者的眼征發生率和TRAb的水平較E33SNP C/C型患者偏低。總之本實驗研究結果初步顯示在山東中部GD患者人群中，E33SNP T/T型GD患者在ATD治療后復發率較低而E33SNP C/C型GD患者ATD治療后復發率較高，但是本研究也存在著一些上述提出的局限性，因此應更加全面系統地研究E33SNP及其它基因多態性位點與GD患者ATD治療后復發的相關性，為臨床預測GD患者ATD停藥后復發提供有力的臨床依據。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Association between single nucleotide polymorphism in exon 33 of thyroglobulin gene and Graves’ disease relapse after antithyroid drug withdrawal

LU Hong-wen1, ZHANG Yin-huan2, LIU Chang-shan1, LI Fa-mei3, WANG Xue-song1,HUANG Ling-yu1, ZHANG Ying3, LIU Lin1

(1DepartmentofEndocrinology,2DepartmentofNo.2Cardiology,WeifangPeople’sHospital,Weifang261041,China;3DepartmentofPostgraduate,WeifangMedicalUniversity,Weifang261053,China.E-mail: 15908029097@163.com)

AIM: To explore the association between single nucleotide polymorphism in exon 33 (E33SNP) of thyroglobulin gene and Graves’ disease (GD) relapse after antithyroid drug (ATD) withdrawal. METHODS: The healthy controls (232 cases) and GD patients with discontinued treatment (243 cases) were selected. According to the time of relapse, the GD patients were divided into A, B and C subgroups. The A group contained 77 cases of relapse within 1 year, B group contained 86 cases of relapse 1～2 years after treatment and C group contained 80 cases without recurrence within 2 years. The genotypes of E33SNP were identified by RT-PCR. The genotype ratio of thyroglobulin between control group and observation group was comparatively analyzed, and the levels of thyroid-stimulating hormone (TSH), free triiodothyronine (FT3), free thyroxine (FT4) and thyrotropin receptor antibody (TRAb), ophthalmopathy and goiter size in A, B and C subgroups in different genotype GD patients were investigated. Moreover, cumulative efficiency for patients with different genotypes in the observation group after ATD treatment within 2 years were analyzed. RESULTS: The genotype of E33SNP between observation group and control group had no significant difference, but a significant difference between A, B and C subgroups was observed (P<0.05). The levels of TSH, FT3 and FT4, and goiter size of the patients with different genotypes had no significant difference, while the TRAb levels and ophthalmopathy presented a significant difference (P<0.05). In addition, the cumulative efficiency within 2 years for GD patients with E33SNP T/T, E33SNP T/C and E33SNP C/C genotypes was 61.8%, 42.6% and 21.3%, respectively, all with significant differences (P<0.05). CONCLUSION: The GD patients with E33SNP C/C genotype have significantly higher TRAb level and ophthalmopathy rate than those in the patients with E33SNP C/T and E33SNP C/C genotypes, and are more likely to relapse after ATD treatment. The GD patients with E33SNP T/T genotype show a lower recurrence rate. Therefore, combination treatment or other treatment modalities may be more reasonable for the GD patients with E33SNP C/C genotype.

Graves’ disease; Thyroglobulin; Single nucleotied polymorphism; Relapse

1000- 4718(2017)01- 0143- 06

2016- 04- 14

2016- 10- 31

衛生部衛生公益性行業科研基金(No. 201202008)

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.01.024

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