大黃酸通過抑制miR-21而干預TGF-β1/Smad通路并減輕博萊霉素所致大鼠肺纖維化*

屈 艷， 張 崇， 賈巖龍， 宋 宇， 牛秉軒， 詹合琴

(新鄉醫學院 1基礎醫學院， 2藥學院， 河南 新鄉 453003)

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大黃酸通過抑制miR-21而干預TGF-β1/Smad通路并減輕博萊霉素所致大鼠肺纖維化*

屈 艷1， 張 崇2△， 賈巖龍2， 宋 宇2， 牛秉軒2， 詹合琴2

(新鄉醫學院1基礎醫學院，2藥學院， 河南 新鄉 453003)

目的： 觀察大黃酸(rhein，RH)對博萊霉素所致肺纖維化大鼠微小RNA-21(miR-21)表達以及轉化生長因子β1(TGF-β1)/Smad通路的影響。方法: 博萊霉素一次性氣管內注射復制大鼠肺纖維化模型，隨機分為RH低、中、高劑量組及模型(model)組；正常對照組大鼠氣管內注射生理鹽水。用藥28 d后，HE染色觀察各組大鼠肺組織形態學的變化；測定肺系數、肺組織羥脯氨酸含量；real-time PCR檢測肺組織中miR-21和TGF-β1/Smad7 mRNA表達；Western blot法分析TGF-β1和Smad7 蛋白的表達。結果: 與model組相比，RH用藥組大鼠的肺泡炎及肺纖維化程度有明顯降低，肺系數及肺組織羥脯氨酸含量也顯著減少，肺組織中miR-21表達下降，TGF-β1的mRNA和蛋白表達水平也明顯下降，Smad7的mRNA及蛋白表達水平明顯增高(P<0.05)。結論: RH抗肺纖維化的作用可能與抑制miR-21的表達，從而干預TGF-β1/Smad信號通路，減少細胞外基質沉積有關。

大黃酸； 肺纖維化； 微小RNA-21； 轉化生長因子β1； Smad7

大黃酸(rhein，RH)是一種天然的蒽醌衍生物，可以從蓼科植物，如大黃、虎杖、何首烏等多種中藥中分離提純得到，應用歷史達千年以上，近些年研究表明RH還可發揮抗腫瘤[1-2]、抗菌[3]、抗炎[4]、抗病毒[5]等多種藥理作用。目前發現RH還可以干預多種器官組織的纖維化過程，例如腎臟纖維化[6]、胰腺纖維化[7]以及肝臟纖維化[8]均有研究，而在肺纖維中的具體作用尚不清楚。器官纖維化病理過程大都是纖維組織增生，細胞外基質(extracellular matrix，ECM)沉積所致，RH能否在肺纖維化中也能起到作用，國內外未見報道，因此本研究擬采用博萊霉素復制肺纖維化大鼠模型，觀察RH的抗肺纖維化作用，并進一步探討其作用機制。

材 料 和 方 法

1 動物

雄性SD大鼠，體質量(200±20)g，由河南省實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號為SCXK(豫)2010-0002。

2 主要藥品和試劑

注射用鹽酸博萊霉素A5(Nippon Kayaku)；羥脯氨酸測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；RH(純度≥98%)(南京澤朗醫藥有限公司)，使用前用0.5%羧甲基纖維素鈉配制成不同濃度的混懸液；抗TGF-β1 單克隆抗體(Abcam)；抗Smad7 多克隆抗體(Santa Cruz)；PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒(TaKaRa)；All-in-OneTMmiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit和All-in-OneTMmiRNA qPCR Kit(GeneCopoeia)。PCR引物由Invitrogen合成；實時熒光定量PCR檢測系統為Thermo Fisher Scientific產品。

3 主要方法

3.1 肺纖維化模型的制備、分組及給藥 大鼠麻醉后，鈍性分離暴露氣管，經氣管軟骨環間隙向心端穿刺，一次性氣管內滴入博萊霉素生理鹽水溶液0.2～0.3 mL(5 mg/kg)復制肺纖維化模型，正常對照(control)組以相同方法滴入等體積生理鹽水，立即將動物直立并行旋轉使藥物分布均勻。造模后當日將動物隨機分成模型(model)組及RH-低(low, L)、中(medium, M)、高(high, H)劑量組，低、中、高劑量分別為25、50、100 mg/kg，每日上午采用灌胃方法進行給藥，給藥劑量的選擇主要參考了文獻[4, 7]，并通過預實驗確定，control組和model組以同樣方法給予等容量0.5 %羧甲基纖維素鈉溶液。給藥28 d后，股動脈放血處死所有動物，收集待測標本

3.2 肺系數的檢測 處死大鼠后，完整分離出氣管和雙肺，吸干肺臟表面水分，稱量肺濕重，計算肺系數 [肺系數=肺濕重(mg)/大鼠體重(g)]

3.3 肺組織羥脯氨酸含量的測定 取右肺中葉組織，稱重后剪碎、勻漿，測定方法按堿水解法羥脯氨酸試劑盒說明進行。

3.4 病理組織學的觀察 取左肺，使用4%多聚甲醛先經左主支氣管灌注固定30 min后完全投入4%多聚甲醛中繼續固定24 h，常規石蠟包埋切片、行HE染色，根據Szapiel等[9]提供的方法評價肺泡炎及纖維化程度，2種病變程度均分為4級：0級無明顯病理改變，肺泡結構正常者評0分；1級輕度改變，病變范圍小于全肺的20%者評1分；2級中度改變，病變范圍占全肺的20%～50%者評2分；3級重度改變，病變范圍占全肺的50%以上者評3分。

3.5 Real-time PCR檢測各組肺組織中miR-21的表達及TGF-β1/Smad7的mRNA水平 用TRIzol提取總RNA，反轉錄為cDNA后進行real-time PCR反應，GAPDH作為內參照，上游引物序列為5’-CGACTTCAACAGCAACTCCCACTCTTCC’， 下游引物序列為5’-TGGGTGGTCCAGGGTTTCTTACTCCTT-3’； TGF-β1的上游引物序列為5’- AGCGGACTACTATGCTAAAGAGGTCACCC-3’， 下游引物序列為5’-CCAAGGTAACGCCAGGATTGTTGCTATA-3’； Smad7的上游引物序列為5’-TTTTGAGGTGTGGTGGG-3’，下游引物序列為5’-GAGGCAGTAAGACAGGGATGA-3’。反應體系(10 μL)包括SYBR Premix Ex TaqTMⅡ buffer 5 μL，上、下游引物各0.2 μL， cDNA模板0.2 μL，ddH2O 4.4 μL。反應條件為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環。miRNA檢測采用miRNA 逆轉錄試劑轉錄為cDNA后，All-in-OneTMmiRNA qPCR Kit進行real-time PCR反應，U6作為內參照，其引物序列為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’；miR-21引物為：5’-CGGCTAGCTTATCAGACTGA-3’。反應體系20 μL，包括qPCR Mix 10 μL、miRNA qPCR Primer 2 μL、Universal Adaptor PCR Primer 2 μL、cDNA模板2 μL、ROX reference dye 0.4 μL、ddH2O 3.6 μL。反應條件為：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 10 s，45個循環；60～95 ℃熔解曲線分析，每個樣品重復3次。數據的收集和分析由PikoReal Software 2.0完成，研究采用2-ΔΔCt法計算目標mRNA的含量。

3.6 Western blot法檢測TGF-β1和Smad7 蛋白的表達 用RIPA裂解約100 mg肺組織，提取裂解上清液，BCA法測蛋白濃度，采用SDS-PAGE分離蛋白，轉膜，封閉，分別 加相應的I 抗4 ℃孵育過夜后，加辣根過氧化物酶標記 II 抗孵育2 h，ECL檢測試劑盒顯影，凝膠成像系統照相，ImageJ 1.43軟件分析灰度值，對各組蛋白表達差異進行分析。

4 統計學處理

采用SPSS 17.0統計軟件，等級資料比較用秩和檢驗，多組總體比較采用Kruska-WallisH檢驗分析，組間兩兩比較采用Mann-WhitneyU檢驗進行統計學處理；計量資料以均數±標準差(mean±SD)表示，多組總體比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗進行統計學處理，以P<0．05為差異有統計學意義。

結 果

1 肺組織的病理組織學觀察

HE染色結果顯示，control組肺組織結構正常，偶見炎性細胞，無間質纖維組織增生；model組的肺組織結構紊亂，大量肺泡壁斷裂，肺泡腔塌陷，肺泡間隔顯著增寬，有大量纖維組織增生及膠原沉積，炎性細胞浸潤，多呈3級纖維化和2級肺泡炎改變，與control組相比，肺泡炎及肺纖維化評分顯著提高(P<0．01)；RH給藥組多數肺組織結構較為清晰，肺泡間隔增寬不明顯，膠原組織增生降低，多呈1級纖維化改變，炎性細胞浸潤減少，評分均較model組明顯減輕(P<0．05)，結果見圖1、表1。

Figure 1. The effect of rhein on the pathological changes of pulmonary tissues in the rats with pulmonary fibrosis (HE staining, ×100).

圖1 RH對肺纖維化大鼠肺組織病理形態學的影響

表1 RH對大鼠肺泡炎及肺纖維化的影響

**P<0．01vscontrol group;△P<0．05,△△P<0．01vsmodel group.

2 RH對大鼠肺系數及肺組織羥脯氨酸含量的影響

與control組相比，model組大鼠肺系數及羥脯氨酸含量明顯增高(P<0．01)，RH給藥組肺系數及羥脯氨酸含量有顯著降低(P<0．05)，見表2。

3 RH對miR-21水平及TGF-β1/Smad7 mRNA相對表達量的影響

Real-time PCR檢測后的熔解曲線顯示，各基因擴增產物均為單峰，無非特異性產物或引物二聚體出現。Model組的miR-21水平和TGF-β1 mRNA的相對表達量均較control組有明顯增高(P<0．01)，而給予RH后，兩者的表達水平明顯降低；Smad7 mRNA在model組中表達下降，在RH-M和RH-H組則明顯升高(P<0．01)，見表3。

4 RH對TGF-β1和Smad7 蛋白表達的影響

與control組相比，model組大鼠TGF-β1蛋白的表達水平明顯升高，而RH給藥后TGF-β1蛋白明顯下降(P<0．05)， Smad7的蛋白表達量則相反，model組表達明顯降低，而給藥后能夠提高其表達水平，與mRNA的表達結果一致，見圖2。

表2 RH對大鼠肺系數及羥脯氨酸含量的影響

Table 2.The effecs of rhein on lung coefficient and hydroxyproline in rats (Mean±SD.n=10)

GroupDose(mg/kg)Lungcoefficient(mg/g)Hydroxyproline(mg/g)Control—4．65±0．580．75±0．09Model—8．24±1．18??1．06±0．10??RH?L257．14±0．65△0．94±0．12△RH?M506．75±0．69△△0．85±0．08△△RH?H1006．17±0．78△△0．81±0．09△△

**P<0．01vscontrol group;△P<0．05,△△P<0．01vsmo-del group.

討 論

目前，肺纖維化的發病機理仍然不清楚，尚無有效的治療方法[9]，主要病理基礎為成纖維細胞過度增殖， ECM沉積所致，膠原蛋白是ECM的主要成分，而羥脯氨酸是膠原蛋白中一種特有的氨基酸，當膠原蛋白代謝發生異常時，組織內羥脯氨酸含量會發生相應的變化，因此測定肺組織羥脯氨酸含量，可以反映肺組織中膠原蛋白即ECM的含量，RH用藥后，羥脯氨酸含量有明顯降低，提示RH可以減少ECM的合成。在肺纖維化形成過程中，由于肺泡壁纖維結締組織增生和膠原蛋白的沉積，及大量炎性細胞浸潤等因素能使肺纖維化大鼠的肺重量增加，因此肺系數可間接反映肺組織纖維化的程度，RH可以降低肺系數，同時，從組織病理學觀察也發現，RH抑制了肺泡炎及肺纖維化的程度，也印證了其抗肺纖維化作用。

表3 RH對miR-21、TGF-β1/Smad7 mRNA表達的影響

**P<0．01vscontrol group;△P<0．05,△△P<0．01vsmodel group.

Figure 2.The effect of rhein on the protein expression of TGF-β1 and Smad7. Mean±SD.n=10.**P<0．01vscontrol group;△△P<0．01vsmodel group.

圖2 RH對TGF-β1和Smad7 蛋白表達的影響

TGF-β1是促進肺纖維化的重要因子，TGF-β/Smad信號通路在其中具有重要的調控作用[10]，可促進膠原蛋白等ECM過度沉積，而導致肺纖維化的產生[11]。本研究也表明model組大鼠TGF-β1增高明顯，而RH能使其mRNA及蛋白表達水平明顯下降，He等[12]發現RH能夠抑制TGF-β的表達而發揮抑制腎間質纖維化作用，與本研究結果相似。另外，有研究表明Smad7 在TGF-β/Smad信號通路中起非常重要的調節作用，它可沉默整個信號通路，從而抑制TGF-β的作用[13]。Smad7 能與細胞膜上TGF-β受體競爭性結合，阻斷TGF-β信號在胞漿內的傳導，下游信號紊亂，在TGF-β信號中通路中起負性調節作用，是TGF-β信號轉導通路失活的機制之一[14]，而超表達Smad7 能夠使過度激活的TGF-β/ Smad信號通路平衡恢復，發揮抗纖維化作用[15]。本研究也發現RH能提高Smad7 表達水平，證明RH能抑制促纖維化細胞因子TGF-β1表達，并通過上調Smad7，干擾TGF-β/smad信號通路，減少ECM的沉積。

MicroRNA參與基因的表達調控，導致mRNA的降解或翻譯抑制，近些年發現在多種病理生理學過程中發揮重要作用[16]。約10%的miRNA在肺纖維化過程中有明顯改變，其中被證實起重要作用有Let-7、miR-21、miR-29、miR-154等[17]，這些MicroRNA可能成為肺纖維化發生發展的關鍵因子及藥物作用的新靶點。miR-21是miRNA轉錄的主要驅動子，在腫瘤、心血管疾病等許多病理過程中表達上調[18]。Liu等[19]研究證明miR-21在博萊霉素誘導的肺纖維化model中和特發性肺纖維化病人中，均呈高表達狀態，TGF-β1能增強miR-21的表達，反過來miR-21又能上調TGF-β1功能，促進其誘導肺纖維作用。本研究發現miR-21在肺纖維化model組中表達明顯增高，與TGF-β1高表達同步，與前人研究相一致，證明miR-21與TGF-β1確實可能具有密切的聯系，并可能在肺纖維化發生發展過程中存在協同作用。另有研究認為TGF-β是通過Smad途徑促進miR-21表達，miR-21能夠抑制Smad-7表達，增加TGF-β促肝纖維化作用[20]，同樣腎纖維化中也有研究發現在TGF-β1能上調miR-21的表達，并成劑量及時間依賴性，采用siRNA方法沉默Smad7 能直接調節α-SMA和E-cadherin 表達，miR-21表達增強后可通過抑制靶基因Smad7 表達，增強TGF-β1導致ECM沉積而導致的纖維化作用[21]，因此過表達miR-21，Smad-7表達下調，通過Smad信號通路可增強 TGF-β1誘導ECM過量沉積。在TGF-β1介導的肺纖維化中，針對miR-21進行抑制可能是一個更好的選擇。本研究發現使用RH后，miR-21的表達受到了明顯的抑制，同時TGF-β1表達也同步降低，而Smad7 表達水平卻增加，ECM沉積被抑制，推測RH發揮抗肺纖維化作用可能與其抑制miR-21的表達，使Smad7 的表達增強，從而干預TGF-β1/Smad信號通路，減少了ECM沉積有關。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Rhein attenuates bleomycin-induced rats pulmonary fibrosis through TGF-β1/Smad pathway by inhibiting miR-21 expression

QU Yan1, ZHANG Chong2, JIA Yan-long2, SONG Yu2, NIU Bing-xuan2, ZHAN He-qin2

(1SchoolofBasicMedicine,2CollegeofPharmacy,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453003,China.E-mail:chong29@126.com)

AIM: To investigate the effect of rhein on bleomycin-induced pulmonary fibrosis and the expression of microRNA-21 (miR-21) and transforming growth factor-β1 (TGF-β1)/Smad signaling molecules in rats. METHODS: A single dose of bleomycin was intratracheal injected into the SD rats to induce pulmonary fibrosis. After injection of bleomycin, the rats were randomly divided into low-, medium- and high-dose rhein treatment groups and model group. The rats that were instilled with normal saline intratracheally served as control group. After the treatment for 28 d, the pulmonary pathologic changes were observed under microscope with hematoxylin-eosin staining. The lung coefficient and hydroxyproline content were also measured. The expression of miR-21 and the mRNA levels of TGF-β1 and Smad7 in the lung tissues were detected by real-time PCR. The protein levels of TGF-β1 and Smad7 were determined by Western blot. RESULTS: Rhein significantly attenuated the experimental alveolitis, pulmonary fibrosis, lung coefficient and hydroxyproline contents in the rats. Rhein obviously decreased the expression of miR-21,and the mRNA and protein levels of TGF-β1, but significantly increased the mRNA and protein levels of Smad7 in the lung tissues. CONCLUSION: Rhein effectively prevents bleomycin-induced pulmonary fibrosis by inhibiting the expression of miR-21 and promoting the expression of Smad7, thus regulating the TGF/Smad signaling pathway to decrease extracellular matrix deposition.

Rhein; Pulmonary fibrosis; MicroRNA-21; Transforming growth factor-β1; Smad7

1000- 4718(2017)01- 0149- 05

2016- 06- 16

2016- 08- 22

河南省科技公關項目(No. 122102310200)；新鄉市經濟社會發展重點科研項目(No. S10008)；新鄉醫學院第七批省級重點學科開放課題(No. ZD200903);新鄉醫學院培育基金資助項目(No. 2014QN130)

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.01.025

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