JAK-STAT信號通路、IL-1β和IL-6在X射線輻照誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷中的調(diào)控作用

喻 晶， 張 宜， 刁 波

(中國人民解放軍武漢總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實驗科，湖北 武漢 430070)

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JAK-STAT信號通路、IL-1β和IL-6在X射線輻照誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷中的調(diào)控作用

喻 晶， 張 宜△， 刁 波

(中國人民解放軍武漢總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實驗科，湖北 武漢 430070)

目的： 探究JAK-STAT信號通路及炎癥因子IL-1β、IL-6是否參與X射線誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞輻射損傷。方法: 采用X射線分別以2、4和8 Gy劑量照射PC12細(xì)胞，照射后24 h通過酶聯(lián)免疫法檢測IL-1β和IL-6的表達(dá)水平；Western blot檢測p-JAK1、p-JAK2、p-STAT1、p-STAT3和p-STAT5的蛋白水平。結(jié)果: 與正常對照組相比，細(xì)胞經(jīng)不同劑量X射線照射24 h后，IL-1β和IL-6的表達(dá)水平均升高，且與輻照劑量呈劑量依賴性；p-JAK1、p-JAK2、p-STAT1、p-STAT3和p-STAT5的蛋白水平均升高，且上調(diào)程度與輻照劑量呈劑量依賴性。結(jié)論: JAK-STAT信號通路、IL-1β和IL-6可能參與X射線照射誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的損傷調(diào)控。

X射線； PC12細(xì)胞； JAK-STAT信號通路； IL-1β； IL-6

隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，核能和核技術(shù)在能源、軍事、醫(yī)療衛(wèi)生等國民生活生產(chǎn)中的大量運用，人體受到電離輻射的機會日益增多。其中在醫(yī)療領(lǐng)域，放射治療已經(jīng)成為大腦原發(fā)性、繼發(fā)性腫瘤和腦轉(zhuǎn)移瘤等頭部腫瘤不可或缺的非手術(shù)治療手段，其療效顯著，明顯延長患者的生存期，但射線在對臨床疾病進行診斷與治療的同時，也使接受輻照的患者經(jīng)受不同程度的輻射后遺效應(yīng)[1]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)是電離輻射暴露的主要靶器官，腦部在受到射線輻照后會出現(xiàn)頭痛、頭暈、疲勞乏力、學(xué)習(xí)記憶能力減退[2]、急性和慢性認(rèn)知功能缺陷[3]等精神癥狀。

腦經(jīng)輻照后神經(jīng)細(xì)胞的損害多由于繼發(fā)性炎癥反應(yīng)所致[4]。白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)和白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)作為一種炎性介質(zhì)參與中樞神經(jīng)內(nèi)分泌活動。Janus激酶-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子(Janus kinase-signal transducer and activator of transcription，JAK-STAT)信號通路在免疫功能調(diào)節(jié)[5]以及神經(jīng)炎癥[6-7]等過程中發(fā)揮著特異且多效性的生物學(xué)功能，是細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的一個重要途徑。炎癥因子IL-1β、IL-6和JAK-STAT信號通路在輻照誘導(dǎo)神經(jīng)系統(tǒng)損傷中的調(diào)控作用未見報道。本實驗選取PC12細(xì)胞作為輻射的模型細(xì)胞，考察X射線暴露對PC12細(xì)胞輻照后的損傷效應(yīng)，觀察輻照對炎癥因子IL-1β和IL-6以及JAK-STAT信號通路的影響，為進一步研究輻射對神經(jīng)系統(tǒng)的損傷機制提供參考及實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 藥品、試劑與儀器

DMEM高糖培養(yǎng)基購自HyClone；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自NQBB；胰蛋白酶購自Amersco；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量測定試劑盒購自碧云天生物公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)鼠抗人多克隆抗體購自杭州賢至生物有限公司；抗p-JAK1、p-JAK2、p-STAT1、p-STAT3、p-STAT5、JAK1、JAK2、STAT1、STAT3和STAT5抗體購自Abcam；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記羊抗兔抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；IL-1β和IL-6酶聯(lián)免疫試劑盒購自Perprotech；TRIzol試劑購自Gibco；其它試劑購于國藥試劑，均為分析純。

醫(yī)用直線加速器(Electa-Precise e1293)；熒光化學(xué)成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)；酶標(biāo)分析儀(中國深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司)；超純水系統(tǒng)(Millipore)；DYCZ-40電泳儀和DYCZ-24DN垂直電泳槽(北京六一儀器廠)；水平搖床(江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) PC12細(xì)胞由本院醫(yī)學(xué)實驗科保存。細(xì)胞用含10% FBS、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液，以1.0×108/L密度接種于培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細(xì)胞進行實驗。

2.2 照射條件 采用6 MeV X射線，照射劑量為2、4和8 Gy，劑量率為200 cGy/min，皮靶距為60 cm，照射野為20 cm×20 cm。

2.3 IL-1β和IL-6的檢測 各劑量組細(xì)胞經(jīng)照射后24 h收集細(xì)胞上清液，使用酶聯(lián)免疫法測定，具體步驟參照IL-1β和IL-6酶聯(lián)免疫試劑盒進行。

2.4 Western blot實驗 將各組細(xì)胞分別經(jīng)2、4、8 Gy劑量輻照，24 h后棄去培養(yǎng)液，PBS洗3次，裂解液裂解細(xì)胞，以12 000 r/min離心15 min。收集細(xì)胞裂解物，蛋白濃度用BCA法進行測定。取40 μg總蛋白在十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate, SDS)緩沖液中煮7 min，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)并電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。硝酸纖維素膜用含50 g/L脫脂奶粉的TBST緩沖液室溫封閉90 min，然后依次滴加(1∶500～1∶1 000)的抗JAK1、JAK2、STAT1、STAT3、STAT5、p-JAK1、p-JAK2、p-STAT1、p-STAT3、p-STAT5和GAPDH抗體，4 ℃過夜后TBST緩沖液洗滌 10 min、3次，然后用1∶5 000的HRP-羊抗兔或鼠IgG孵育2 h，然后用TBST緩沖液洗滌3次，每次10 min。最后用增強化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence, ECL)液進行曝光顯影，熒光化學(xué)成像系統(tǒng)進行照相并用其附帶的軟件分析蛋白的相對表達(dá)量。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 16.0軟件處理，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Dunnett-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 X射線輻照對PC12細(xì)胞IL-1β和IL-6含量的影響

PC12細(xì)胞經(jīng)2、4和8 Gy X射線輻照后，IL-1β的含量由正常對照組的(83.471±17.109) ng/L，分別增加到(139.975±16.420) ng/L、(225.378±21.007) ng/L和(301.674±23.415) ng/L。與正常對照組比較，PC12細(xì)胞經(jīng)X射線照射后IL-1β的含量升高均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖1。

PC12細(xì)胞經(jīng)2、4和8 Gy X射線照射后，IL-6含量由正常對照組的(115.585±7.783) ng/L，分別增加到(153.030±15.462) ng/L、(195.174±10.461) ng/L和(227.356±14.257)ng/L。與正常對照組比較，PC12細(xì)胞經(jīng)X射線照射后IL-6的含量升高均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖1。

2 X射線輻照對PC12細(xì)胞p-JAK1、p-JAK2、p-STAT1、p-STAT3和p-STAT5蛋白水平的影響

PC12細(xì)胞經(jīng)2、4和8 Gy X射線照射后：p-JAK1的相對蛋白水平由0.359±0.0340分別上調(diào)到0.563±0.0573、0.0828±0.0404和0.972±0.0440；p-JAK2的相對蛋白水平由0.449±0.0404分別上調(diào)到0.569±0.0380、0.752±0.0358和0.891±0.0421；p-STAT1的相對蛋白水平由0.084±0.0273分別上調(diào)到0.252±0.0291、0.530±0.0521和0.711±0.0262；p-STAT3的相對蛋白水平由0.217±0.0510分別上調(diào)到0.490±0.0450、0.711±0.0528和0.961±0.0492；p-STAT5的相對蛋白水平由0.424±0.0535分別上調(diào)到0.620±0.0392、0.728±0.0401和0.872±0.0399。與正常對照組比較，PC12細(xì)胞經(jīng) X射線照射后p-JAK1、p-JAK2、p-STAT1、p-STAT3和p-STAT5蛋白的水平上調(diào)均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖2。

Figure 1.The effect of X-ray irradiation on the levels of IL-1β and IL-6 in the PC12 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsnormal group.

圖1 X射線輻射對PC12細(xì)胞中IL-1β和IL-6含量的影響

Figure 2.The effect of X-Ray irradiation on the protein levels of p-JAK1, p-JAK2, p-STAT1, p-STAT3 and p-STAT5 in the PC12 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsnormal group.

圖2 X射線輻射誘導(dǎo)對PC12細(xì)胞中p-JAK1、p-JAK2、p-STAT1、p-STAT3和p-STAT5的蛋白表達(dá)水平的影響

討 論

近年來，電離輻射已滲透到人類生產(chǎn)生活中的許多領(lǐng)域，如惡性腫瘤患者接受的放療、職業(yè)性工作者經(jīng)受的輻射性損害和航天飛行中人員受到的空間輻射等。輻射技術(shù)的高速發(fā)展帶來收益的同時也不可避免地給人們造成了輻射損害。電離輻射對中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的影響已成為國際放射防護委員會和聯(lián)合國原子輻射效應(yīng)科學(xué)委員會非常關(guān)注的重要內(nèi)容[8]。如何減少輻射帶來的損傷，保護人體的健康，已經(jīng)成為輻射防護研究人員和相關(guān)預(yù)防醫(yī)學(xué)工作者重要的研究課題[9]。

放射性的腦損傷是中樞神經(jīng)系統(tǒng)或臨近器官病變接受放療后經(jīng)過一段潛伏期，所產(chǎn)生的神經(jīng)系統(tǒng)損傷疾病，是放射性治療后最嚴(yán)重的并發(fā)癥，常為進行性，甚至是致死性[10]，目前仍沒有有效的治療手段。電離輻射引起生物活性分子的電離和激發(fā)是輻射生物效應(yīng)的基礎(chǔ)，一般來說，照射劑量越大，劑量率越高，效應(yīng)越顯著。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，電離輻射損傷可以引起機體一些細(xì)胞因子、酶類和基因表達(dá)的改變[11]，而一些分子的改變與機體的損傷程度和輻射劑量相關(guān)。本實驗發(fā)現(xiàn)，X射線輻照PC12細(xì)胞后，隨著輻照劑量的增加，細(xì)胞的損傷效應(yīng)越嚴(yán)重，表現(xiàn)為釋放過量的炎癥因子，激活JAK-STAT信號通路。

輻射可以引起機體的炎癥反應(yīng)，這種炎癥反應(yīng)是通過自分泌或旁分泌產(chǎn)生的炎癥細(xì)胞因子介導(dǎo)的，炎癥因子是細(xì)胞對外界損傷刺激產(chǎn)生正常免疫反應(yīng)的產(chǎn)物[12]。IL-1作為一種炎性介質(zhì)參與中樞神經(jīng)內(nèi)分泌活動，通過下丘腦-垂體-腎上腺軸，調(diào)節(jié)垂體前葉細(xì)胞的生長。IL-1有2種結(jié)構(gòu)不同的分子：IL-1α和IL-1β，而以IL-1β為主要的分泌形式。IL-1發(fā)揮生物學(xué)作用是通過與位于其靶細(xì)胞膜上的高親和性受體結(jié)合來實現(xiàn)的，介導(dǎo)腦損傷后的許多病理生理反應(yīng)，如發(fā)熱、白細(xì)胞聚集、血管內(nèi)皮滲透性增加等，從而與腦水腫的形成及顱內(nèi)壓的增高密切相關(guān)。正常情況下，腦組織中的IL-1活性較低，而在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病理情況下，IL-1的活性則明顯增高。有研究發(fā)現(xiàn)，輻射可誘導(dǎo)大鼠腦組織局部炎癥因子IL-1β的明顯升高[13]。IL-1還可誘導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中某些重要的神經(jīng)毒性分子的釋放，如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、IL-6、IL-8等。其中，IL-6是炎癥反應(yīng)和機體免疫的多向性細(xì)胞因子[14]，參與多種疾病的病理過程如免疫應(yīng)答、急性期反應(yīng)等，在不同組織中通過復(fù)雜的細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡等[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，IL-6參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)炎癥，調(diào)節(jié)許多重要的神經(jīng)元和突觸功能，包括突觸傳遞和突觸可塑性的細(xì)胞機制[16]，其在正常中樞神經(jīng)系統(tǒng)中低表達(dá)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染和損傷時表達(dá)水平升高[17]。本實驗發(fā)現(xiàn)，PC12細(xì)胞經(jīng)X射線輻照后，輻照組IL-1β和IL-6的含量較未輻照組明顯增加，且隨著輻照劑量的增加，細(xì)胞釋放的IL-1β和IL-6亦增加，炎癥反應(yīng)越嚴(yán)重。

此外，炎癥反應(yīng)可以同時激活細(xì)胞內(nèi)多種不同的應(yīng)激信號通路，并使其之間的平衡關(guān)系發(fā)生改變。JAK-STAT信號通路作為IL-6家族下游主要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，涉及細(xì)胞的生長、分化、炎癥、突變和凋亡等多種神經(jīng)功能[18]。以往JAK-STAT信號通路的研究主要集中在腫瘤、肝臟、造血系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，JAK-STAT參與神經(jīng)炎癥、神經(jīng)退行性病變等神經(jīng)系統(tǒng)疾病，在細(xì)胞損傷及應(yīng)激狀態(tài)下，JAK-STAT信號通路能被激活[19]。研究顯示，炎癥因子IL-6的上調(diào)可以激活STAT3的磷酸化[20]，海馬神經(jīng)元細(xì)胞在炎癥反應(yīng)中出現(xiàn)促炎性細(xì)胞因子IL-6的升高，JAK1、STAT3和STAT5磷酸化的過表達(dá)[21]。與本實驗的結(jié)果。

生命是一個復(fù)雜的系統(tǒng)，從分子水平的事件發(fā)展到可觀察到的生物學(xué)效應(yīng)，需要經(jīng)歷細(xì)胞、組織器官和系統(tǒng)等不同層次的信號傳導(dǎo)、調(diào)節(jié)和放大，發(fā)生在任一層級的任何效應(yīng)都要經(jīng)歷一個時間過程且受許多環(huán)境因素的影響和多維空間的調(diào)節(jié)。本實驗發(fā)現(xiàn)，X射線輻照PC12細(xì)胞，誘導(dǎo)其釋放過量的炎癥因子IL-1β和IL-6，激活JAK-STAT信號通路的磷酸化，繼而進一步啟動損傷。炎癥因子IL-1β、IL-6和JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常激活，可能是電離輻射致神經(jīng)系統(tǒng)損傷的機制之一。然而，JAK-STAT信號通路下游調(diào)控分子，JAK-STAT信號通路抑制劑是否對輻射損傷有效，以及JAK-STAT是否與其它信號通路共同調(diào)控輻射致神經(jīng)系統(tǒng)損傷機制還有待更深入的研究。

[1] Balentova S, Adamkov M. Molecular, cellular, and functional effects of radiation-induced brain injury:a review[J]. Int J Mol Sci, 2015, 16(11):27796-27815.

[2] Burns TC, Awad AJ, Li MD, et al. Radiation-induced brain injury: low-hanging fruit for neuroregeneration[J]. Neurosurg Focus, 2016, 40(5):E3.

[3] Acharya MM, Baulch JE, Lusardi TA, et al. Adenosine kinase inhibition protects against cranial radiation-induced cognitive dysfunction[J]. Front Mol Neurosci, 2016, 9:42.

[4] Dong X, Luo M, Huang G, et al. Relationship between irradiation-induced neuro-inflammatory environments and impaired cognitive function in the developing brain of mice[J]. Int J Radiat Biol, 2015, 91(3):224-239.

[5] O’Shea JJ, Plenge R. JAK and STAT signaling molecules in immunoregulation and immune-mediated disease[J]. Immunity, 2012, 36(4):542-550.

[6] Benveniste EN, Liu Y, McFarland BC, et al. Involvement of the Janus kinase/signal transducer and activator of transcription signaling pathway in multiple sclerosis and the animal model of experimental autoimmune encephalomyelitis[J]. J Interferon Cytokine Res, 2014, 34(8):577-588.

[7] Liu Y, Gibson SA, Benveniste EN, et al. Opportunities for translation from the bench: therapeutic intervention of the JAK/STAT pathway in neuroinflammatory diseases[J]. Crit Rev Immunol, 2015, 35(6):505-527.

[8] Leuraud K, Richardson DB, Cardis E, et al. Ionising radiation and risk of death from leukaemia and lymphoma in radiation-monitored workers (INWORKS): an international cohort study[J]. Lancet Haematol, 2015, 2(7):e276-e281.

[9] Williams JP, Calvi L, Chakkalakal JV, et al. Addressing the symptoms or fixing the problem?Developing countermeasures against normal tissue radiation injury[J]. Radiat Res, 2016, 186(1):1-16.

[10]Kohutek ZA, Yamada Y, Chan TA, et al. Long-term risk of radionecrosis and imaging changes after stereotactic radiosurgery for brain metastases[J]. J Neurooncol, 2015, 125(1):149-156.

[11]Acharya MM, Green KN, Allen BD, et al. Elimination of microglia improves cognitive function following cranial irradiation[J]. Sci Rep, 2016, 6:31545.

[12]Mancilla-Herrera I, Alvarado-Moreno JA, Cérbulo-Vázquez A, et al. Activated endothelial cells limit inflammatory response, but increase chemoattractant potential and bacterial clearance by human monocytes[J]. Cell Biol Int, 2015, 39(6):721-732.

[13]Lee WH, Sonntag WE, Mitschelen M, et al. Irradiation induced regionally specific alterations in pro-inflammatory environments in rat brain[J]. Int J Radiat Biol, 2010, 86(2):132-144.

[14]Ishihara K, Hirano T. IL-6 in autoimmune disease and chronic inflammatory proliferative disease[J]. Cytokine Growth Factor Rev, 2002, 13(4-5):357-368.

[15]Donegan JJ, Girotti M, Weinberg MS, et al. A novel role for brain interleukin-6: facilitation of cognitive flexibility in rat orbitofrontal cortex[J]. J Neurosci, 2014, 34(3):953-962.

[16]Gruol DL. IL-6 regulation of synaptic function in the CNS[J]. Neuropharmacology, 2015, 96(Pt A):42-54.

[17]Campbell IL, Erta M, Lim SL, et al. Trans-signaling is a dominant mechanism for the pathogenic actions of interleukin-6 in the brain[J]. J Neurosci, 2014, 34(7):2503-2513.

[18]Duan W, Yang Y, Yan J, et al. The effects of eurcumin post-treatment against myocardial isehemia and reperfasion by activation of the JAK2/STAT3 signaling pathway[J]. Basic Res Cardiol, 2012, 107(3):263.

[19]Nicolas CS, Amici M, Bortolotto ZA, et al. The role of JAK-STAT signaling within the CNS[J]. JAKSTAT, 2013, 2(1):e22925.

[20]Hao Y, Jing H, Zhang J, et al. Intra-amygdala microinfusion of IL-6 impairs the auditory fear conditioning of rats via JAK/STAT activation[J]. Behav Brain Res, 2014, 275:88-95.

[21]Manickam M, Tulsawani R. Survival response of hippocampal neurons under low oxygen conditions induced byHippophaerhamnoidesis associated with JAK/STAT signaling[J]. PLoS One, 2014, 92(2):e87694.

(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Effects of JAK-STAT signaling pathway, IL-1β and IL-6 on injury of PC12 cells with X-ray irradiation

YU Jing, ZHANG Yi, DIAO Bo

(DepartmentofMedicalExperiments,WuhanGeneralHospitalofChinesePeople’sLiberationArmy,Wuhan430070,China.E-mail:fish0826@163.com)

AIM: To investigate the role of JAK-STAT pathway, IL-1β and IL-6 in the PC12 cells with X-ray irradiation.METHODS: The PC12 cells were irradiated with X-ray at doses of 2, 4 and 8 Gy. After 24 h, the levels of IL-1β and IL-6 were detected by ELISA. The protein levels of p-JAK1, p-JAK2, p-STAT1, p-STAT3 and p-STAT5 were measured by Western blot.RESULTS: Compared with control group, the levels of IL-1β and IL-6 increased. The protein levels of p-JAK1, p-JAK2, p-STAT1, p-STAT3 and p-STAT5 increased with the doses of X-ray exposed.CONCLUSION: JAK-STAT signaling pathway, IL-1β and IL-6 play a role in the injury of PC12 cells with X-ray irradiation.

X-ray; PC12 cells; JAK-STAT signaling pathway; IL-1β; IL-6

1000- 4718(2017)01- 0174- 05

2015- 07- 27

2016- 03- 11

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.01.030

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△通訊作者 Tel: 027-50772965; E-mail: fish0826@163.com